方法文章

通过注射重组狗尾草花叶病毒和甘蔗花叶病毒感染性克隆直接对玉米幼苗进行农杆菌接种 关键词：玉米幼苗，农杆菌接种，注射，重组狗尾草花叶病毒，重组甘蔗花叶病毒，感染性克隆

DOI：

10.3791/62277

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2021年2月27日

 ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Iowa State University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文介绍了一种基于农杆菌的注射（agroinjection）方法，用于将Agrobacterium介导的狗尾草花叶病毒 和甘蔗花叶病毒克隆接种至玉米幼苗。采用该方法接种可实现病毒感染、病毒诱导的标记基因沉默以及GFP的病毒过表达。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

农杆菌基于接种的方法被广泛用于将病毒载体引入植物组织。本研究详细描述了一种在分生组织附近注射玉米幼苗的实验方案。 农杆菌 携带病毒载体。为基因沉默和基因表达而改造的重组狐尾草花叶病毒（FoMV）克隆被用于优化该方法，并进一步扩展应用至为基因表达而设计的重组甘蔗花叶病毒（SCMV）。将目的基因片段或编码序列插入已克隆至双元T-DNA质粒载体pCAMBIA1380中的修饰型感染性病毒基因组。将所获得的质粒构建体转化至 根癌农杆菌 菌株GV3101。可在距4日龄幼苗胚芽鞘节附近注射重悬于MgSO₄中的细菌4 溶液。在感染过程中 农杆菌，携带病毒基因组的T-DNA被转移至玉米细胞，从而启动病毒RNA基因组的转录。随着重组病毒在植株体内复制并系统性扩散，靶基因沉默所导致的病毒症状和表型变化也随之出现 类病变22 (les22) 或 八氢番茄红素脱氢酶 (pds可在叶片上观察到症状，或通过紫外光照射或荧光显微镜检测绿色荧光蛋白（GFP）的表达。为同时检测病毒并评估插入片段的完整性，从注射植株的叶片中提取RNA，并利用跨越携带插入序列的多克隆位点（MCS）的引物进行RT-PCR。该方案已在多种玉米基因型中有效应用，并可轻松扩展至其他病毒载体，从而为玉米中病毒载体的引入提供了一种便捷的工具。

引言

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许多植物病毒的感染性克隆已被改造用于病毒诱导的基因沉默（VIGS）、基因过表达（VOX），以及最近发展的病毒介导的基因编辑（VEdGE）。1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11随着新型病毒载体的不断开发，也必须考虑如何成功利用这些改造后的病毒侵染植物组织的方法。目前在植物中启动病毒感染的方法包括基因枪轰击、体外转录的RNA或DNA克隆摩擦接种、维管穿刺接种，或 根癌农杆菌 接种（农杆菌介导接种）5,12,13,14,15,16,17每种接种方法都有其固有的优缺点，包括成本、对专用设备的需求，以及在特定植物-病毒系统中的可行性。采用浸润或注射方式的 农杆菌 含有设计用于递送重组病毒的双元T-DNA结构的菌株更受青睐，因其操作简便且成本低廉。然而，针对单子叶植物物种的详细农杆菌接种方法，例如 玉米（Zea mays） （玉米）缺乏。

关于农杆菌接种法用于病毒递送的最早报道之一发表于1986年，当时将花椰菜花叶病毒（CaMV）的基因组插入T-DNA构建体中，并将携带该构建体的Agrobacterium通过摩擦接种法接种到芜菁植株上18。此后，又开发出其他农杆菌接种方法。例如，在狐尾粟花叶病毒（FoMV）的研究中，可使用Nicotiana benthamiana作为中间寄主，在其叶片中产生病毒颗粒，从而提供接种源6。利用感染的N. benthamiana叶片对玉米进行摩擦接种，具有高效、快速且简便的优点，但中间寄主的方法并不适用于所有感染玉米的病毒。例如，甘蔗花叶病毒（SCMV）无法感染N. benthamiana， 因此需要为源自该病毒的载体寻找替代的接种源。1988年，通过注射法（农杆菌注射法，agroinjection）将含有玉米条纹病毒（MSV，一种DNA病毒）的Agrobacterium导入玉米幼苗，证明基于Agrobacterium的接种方法同样适用于单子叶植物19。尽管农杆菌注射法早期已取得成功，但此后在玉米中应用该技术的研究报道甚少，因此该方法在RNA病毒以及VIGS、VOX和VEdGE载体中的适用性仍存在未解问题20,21,22。然而，农杆菌注射法在单子叶植物中的广泛应用前景广阔，因为该方法已在兰花、水稻和小麦中成功应用23,24,25,26,27,28。

该实验方案已针对FoMV和农杆菌（Agrobacterium）菌株GV3101进行了优化，并已应用于一种SCMV载体。FoMV是一种马铃薯X病毒属病毒，宿主范围广泛，包括56种单子叶和双子叶植物29。FoMV具有一个6.2千碱基（kb）的正义单链RNA基因组，通过五个开放阅读框（ORFs）编码五种不同的蛋白质30,31,32,33,34,35。此前，FoMV已被开发为可用于玉米的VIGS和VOX载体，方法是将感染性克隆整合到T-DNA质粒骨架上6,36,37。为实现VIGS应用，该病毒基因组在衣壳蛋白（CP）的下游立即添加了一个克隆位点（MCS1*）进行改造（图1A）36。对于VOX和VEdGE应用，复制了CP启动子，并在ORF4与CP之间添加了第二个克隆位点（MCS2），以实现目的序列的插入（图1B）6。含有MCS1和MCS2但无插入片段的FoMV载体即为FoMV空载体（FoMV-EV）（图1）。

SCMV 是一种与 VOX 无关的病毒，已在玉米中开发用于 VOX38。它属于Potyviridae家族，该家族中已有多个成员被改造用于在植物体内表达外源蛋白39,40,41,42,43,44。SCMV 的寄主范围包括玉米、高粱和甘蔗45,46，使其在这些主要农作物的基因功能研究中具有重要价值36,38。SCMV 具有一个约 10 kb 长的正义单链 RNA 基因组47,48。为了构建 SCMV VOX 载体，采用了已得到充分验证的 P1/HCPro 连接位点作为外源序列的插入位点38。该克隆位点后接编码 NIa-Pro 蛋白酶切割位点的序列，从而产生独立于 SCMV 多聚蛋白的蛋白质（图 1C）。

携带这些重组病毒感染性cDNA的T-DNA质粒已转入 农杆菌 菌株GV3101。GV3101是一种胭脂碱型菌株，已知能够将T-DNA转移至单子叶植物物种，包括玉米26,28,49此外，以往的农杆菌注射研究通常采用菌株C58或其衍生菌株GV310119,20,22,27.

本实验方案的开发使用了三个标记基因：其中两个用于基因沉默，一个用于基因表达。选取玉米基因lesion mimic 22（les22，GRMZM2G044074）中一段329个碱基对（bp）的片段构建沉默载体FoMV-LES22。当玉米中的les22基因被沉默时，叶片维管束周围会出现小而圆形的坏死细胞斑块，这些斑块随时间推移逐渐扩展并融合成大片坏死叶组织50。FoMV-PDS载体包含高粱基因phytoene desaturase（pds，LOC110436156）中一段313 bp的片段（与玉米pds基因GRMZM2G410515的序列同源性达96%），可在玉米中诱导pds基因沉默，导致叶片维管束处出现浅色光漂白细胞条纹，并随时间延长而加长51。绿色荧光蛋白（GFP）的完整编码序列被用于验证FoMV（FoMV-GFP）和SCMV（SCMV-GFP）两种载体的蛋白表达能力。叶片中GFP的表达通常在接种后14天（DPI）最为明显6。尽管已有研究报道通过农杆菌注射法将病毒载体导入玉米，但这些实验仅证明农杆菌注射可促进玉米幼苗中感染性克隆的病毒侵染，尚未拓展至专为VIGS或VOX应用设计的重组病毒系统19,20,21,22。本文所述方案在先前农杆菌注射方法的基础上进行了优化，特别是借鉴了Grismley等人的研究19。总体而言，该农杆菌注射方法适用于VIGS和VOX载体，无需特殊设备或替代宿主作为接种源，相较于需要基因枪轰击或体外转录的常规方法，显著缩短了操作时间并降低了成本。本方案将有助于推动玉米功能基因组学研究，适用于VIGS、VOX及VEdGE等多种应用场景。

方案

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1. 质粒构建

注意：本方案也可适用于其他病毒载体或 农杆菌 菌株，但这可能会影响农杆菌注射接种的整体成功率。细菌接种和涂布步骤务必在超净工作台中进行。

  1. FoMV 沉默载体
    注意：除非另有说明，所有培养基均使用Luria-Bertani（LB）培养基（Miller）。液体LB培养基的制备方法为：将25 g颗粒溶解于1,000 mL蒸馏水中，于121 °C高压灭菌15分钟。固体LB培养基的制备方法与此相同，但在灭菌前加入1.5%琼脂。抗生素 在LB培养基冷却至约60 °C后加入上述成分，然后将溶液倒入95 × 15 mm的培养皿中。所用抗生素浓度如下：利福平（rif）25 µg/mL，庆大霉素（gent）50 µg/mL，卡那霉素（kan）50 µg/mL。
    1. PCR 扩增拟被沉默的玉米基因片段（例如， les22 或 pds）使用带有正向引物的 PacI 限制性位点和带有反向引物的 XbaI 限制性位点。这将使基因片段能够以反义方向连接到 FoMV-pCAMBIA1380 双元载体的 MCS1* 多克隆位点中。
      注意：根据高保真DNA聚合酶的说明书，使用高保真DNA聚合酶、正向和反向引物（各10 µM）、质粒DNA模板和水配制PCR反应体系。扩增35个循环，退火温度依据DNA聚合酶及引物的熔解温度（Tm）确定，延伸时间为每千碱基30秒。
    2. 使用PCR纯化试剂盒，按照试剂盒说明书进行PCR纯化。
    3. 用限制性内切酶消化纯化的PCR产物和FoMV-EV Xba我与 PacI. 使用1 µg质粒或全部纯化的PCR产物，加入2 µL 10x缓冲液、1 µL限制性内切酶，加水至终体积为20 µL。根据酶的说明书进行孵育。
    4. 根据制造商说明书，使用T4 DNA连接酶将消化后的PCR产物与FoMV-EV连接在一起。
    5. 将连接后的质粒转化至化学感受态DH5α中 E. coli 使用热激法转化细胞。
      1. 将细胞在冰上解冻，向离心管中加入 3 µL 质粒。冰上孵育 30 分钟，然后在 42 °C 下热激 30 秒。
      2. 冰上放置5分钟，加入200 µL含分解代谢抑制的超优肉汤（SOC）并孵育 E. coli 在37 °C、225 rpm振荡条件下，于SOC培养基中复苏细胞1小时。
      3. 在含卡那霉素的平板上培养 选择性LB培养基，37 °C过夜培养。
    6. 使用引物 FM-5840F 和 FM-6138R 通过 Sanger 测序对菌落进行克隆准确性验证补充表1)。将250 ng质粒DNA提交至可进行Sanger测序的机构。本实验中，样品送至爱荷华州立大学DNA核心设施（Iowa State University DNA Core Facility）进行测序。
    7. 挑取选定的菌落接种于2 mL液体LB培养基中，37 °C、225 rpm振荡培养过夜。通过碱裂解法质粒DNA提取方法从过夜培养物中提取质粒DNA。52.
    8. 将质粒 DNA 转化至 农杆菌 使用冻融法转化GV3101菌株细胞。将100 µL感受态细胞置于冰上融化，加入1–5 µL质粒，冰上孵育30分钟。液氮中放置1分钟，然后37 °C孵育3分钟。加入1 mL SOC培养基，28 °C摇床培养2–3小时进行恢复，涂布于含利福平、庆大霉素和卡那霉素的LB选择性培养基平板，28 °C培养2天。
    9. 通过菌落PCR筛选含有插入片段的菌落。挑取单个细菌菌落，混入30 µL水中。加入12.5 µL聚合酶预混液进行PCR反应 主混合液，10 µM 引物 FM-5840F 和 FM-6138R 各 1.25 µL，3 µL 细菌菌落悬液，加水至终体积为 25 µL。循环 35 次，退火温度为 64 °C，延伸时间为 1 分钟（每扩增 1 kb 对应 1 分钟）。
    10. 接种2-5 mL含利福平、庆大霉素、卡那霉素的液体LB培养基 农杆菌 菌落。在28 °C、225 rpm振荡条件下培养过夜。
    11. 将过夜培养物与50%甘油溶液按1:1比例混合，于-80 °C保存以进行长期储存。
  2. FoMV 表达载体
    1. PCR扩增目标编码序列（包括起始密码子和终止密码子，例如GFP），具体操作如1.1.1节所述，并添加一个 Bsu正向引物上的36I限制性位点和一个 Psp反向引物上设计有 OMI 限制性酶切位点，以实现将目的片段定向克隆至 MCS2 中的正义方向。
    2. 使用PCR纯化试剂盒，按照试剂盒说明书进行PCR纯化。
    3. 用限制性内切酶消化PCR产物和FoMV-EV Bsu36I 和 PspOMI，如1.1.3节所述
    4. 使用T4 DNA连接酶，按照生产商说明书将经消化的PCR产物与FoMV-EV连接在一起。
    5. 转化为DH5α化学感受态细胞 E. coli 使用1.1.5节所述热激法转化细胞，并在卡那霉素平板上涂布培养 选择性LB培养基，37 °C过夜培养。
    6. 使用引物5AmuS2和5AmuA2，通过Sanger测序检测菌落以筛选正确克隆，具体步骤如1.1.6所述（补充表 1).
    7. 接种所选菌落至2 mL液体LB培养基中，37 °C、225 RPM振荡培养过夜。通过碱裂解法质粒DNA提取方法从过夜培养物中提取质粒DNA52.
    8. 将质粒 DNA 转化至 农杆菌 使用1.1.8节所述的冻融法对GV3101菌株感受态细胞进行转化。接种于含利福平（rif）、庆大霉素（gent）和卡那霉素（kan）的选择性LB培养基平板上，28 °C培养2天。
    9. 使用引物5AmuS2和5AmuA2通过菌落PCR筛选含有插入片段的菌落。
    10. 接种2-5 mL含利福平、庆大霉素、卡那霉素的液体LB培养基 农杆菌 菌落。在28 °C、225 rpm条件下振荡培养过夜。
    11. 将过夜培养物与50%甘油溶液按1:1比例混合，于-80 °C保存以进行长期储存。
  3. SCMV 表达载体
    1. PCR扩增目的基因（例如GFP），排除终止密码子，具体方法如1.1.1所述，并包含一个 Psp正向引物上的 OMI 消化位点及一个 Sbf在反向引物上设计 I 型限制性酶切位点，以实现定向克隆至 SCMV-pCAMBIA1380 双元载体中。
      注意：插入片段必须与病毒多聚蛋白的阅读框保持一致进行克隆。
    2. 使用PCR纯化试剂盒，按照试剂盒说明书进行PCR纯化。
    3. 用限制性内切酶消化PCR产物和SCMV-EV PspOMI 和 Sbf如1.1.3中所述
    4. 使用T4 DNA连接酶，按照生产商说明书将经消化的PCR产物与SCMV-EV连接。
    5. 将产物转入DH5α化学感受态细胞 E. coli 使用1.1.5节所述热激法转化细胞，并在含卡那霉素的平板上涂布培养 选择性LB培养基，37 °C过夜培养。
    6. 使用引物 SC-745F 和 HCProR1，按照 1.1.6 节所述方法通过 Sanger 测序对菌落进行筛选，以获得准确的克隆补充表1).
    7. 接种所选菌落于2 mL液体LB培养基中，37 °C、225 rpm振荡培养过夜。通过碱裂解法质粒DNA提取方法从过夜培养物中提取质粒DNA。52.
    8. 将质粒DNA转化至 农杆菌 使用1.1.8中所述的冻融法对GV3101菌株感受态细胞进行转化。在含利福平、庆大霉素和卡那霉素的LB选择性培养基平板上培养，并于28 °C培养2天。
    9. 使用引物 SC-745F 和 HCProR1，按照 1.1.9 节所述方法，通过菌落 PCR 筛选含有插入片段的菌落。
    10. 接种2-5 mL含利福平、庆大霉素、卡那霉素的液体LB培养基 农杆菌 菌落。在28 °C、225 rpm条件下振荡培养过夜。
    11. 将过夜培养物与50%甘油溶液按1:1比例混合，于-80 °C保存以进行长期储存。

2. 幼苗制备

  1. 在注射前4-7天，将1-2粒玉米种子（如‘Golden Bantam’甜玉米、FR1064、B73等）种植于置于托盘内小插盆中的泥炭基质中。将植株置于生长室中，光照周期为16小时光照（25 °C）、8小时黑暗（22 °C），光合有效辐射（PAR）约为185，或置于温室中，光照周期为16小时光照（22-25 °C）、8小时黑暗（22-25 °C），光合有效辐射为350-400 PAR。
    注意：不同玉米基因型对农杆菌（Agrobacterium）的敏感性存在差异，这会影响转化成功率。此外，某些病毒载体可能与特定玉米基因型不兼容。
  2. 定期浇水，并每周施用一次15-5-15液体肥料，浓度为330百万分率（PPM）。

3. 准备 农杆菌

  1. 注射前一天，准备含有适当抗生素（rif、gent、kan）的 LB 液体培养基，并接种携带目标病毒载体的Agrobacterium菌株。建议将 20 µL 甘油菌种加入 50 mL LB 培养基中，该培养量足以接种>100 株植物，可根据需要按比例放大或缩小。
    注意：应准备足够的接种物，使每 4–5 株植物至少获得 1 mL 光密度在 600 nm 处（OD600）为 1.0 的细菌悬浮液。
  2. 在 28 °C 下以 225 rpm 振荡培养 24 小时。
  3. 在室温下以 4,000 × g 离心 10 分钟，收集菌体沉淀。弃去上清液。
  4. 用 1 mL 去离子水（DI 水）通过移液或轻柔涡旋充分洗涤沉淀。
  5. 重复步骤 3.3 以再次收集菌体沉淀。
  6. 用移液或轻柔涡旋将沉淀重悬于 1 mL 10 mM MgSO4 溶液中。
    1. 可选：可在溶液中加入 200 µM 乙酰丁香酮（acetosyringone）。尽管该物质常被使用，但仅能增强部分Agrobacterium菌株的转化能力。作者发现在此方案中添加乙酰丁香酮对效率无显著影响（补充表 2）。
      注意：10 mM MgSO4 溶液可由室温保存的 pH 6.3 的 1 M 母液稀释配制。该溶液通常无需调节 pH。
  7. 使用分光光度计测定样品的 OD600，并用 10 mM MgSO4 溶液稀释至 OD600 为 1.0。
    ​注意：此为可安全暂停的步骤。细菌悬浮液在室温下可保存最多 5 小时再进行注射。

4. 注射

注意：可使用4至7天大的玉米幼苗进行注射。幼苗生长速度受多种因素影响，包括生长条件、光合有效辐射（PAR）量（例如，温室中的PAR高于人工气候室）以及基因型等，其中许多因素在温室条件下难以控制。幼苗在4天大时即可进行注射，此时植株高度为2-3 cm，叶片尚未展开；最晚可在7天大时注射，此时最下部叶尖呈圆形的叶片已展开。播种超过7天后，该接种方法的成功率会迅速下降。无论幼苗年龄如何，注射位点均相同。

  1. 佩戴安全护目镜，使用连接在1 mL一次性注射器上的25G x 5/8"针头，在胚芽鞘节上方2-3 mm处将细菌悬浮液注入幼苗。
    注：胚芽鞘节是将来冠根形成的位置，为植株上最下方的节。通常在此节及其下方会出现从绿色到白色的色泽变化。注射位置应位于分生组织正上方。在此阶段解剖几株幼苗有助于观察分生组织的位置，从而确定正确的注射位点。
  2. 轻柔推动注射器，直至悬浮液充满胚芽鞘或在叶鞘环中可见（具体取决于植株的生长阶段），注射量约为100–200 µL。
    注：若难以将悬浮液注入幼苗，可能是注射位置过低。仅需施加适中压力即可完成注射。
  3. 对所有幼苗进行注射，每种构建体需更换新的注射器和针头。

5. 植物的持续养护

  1. 在幼苗7-8天大时，将其移栽至13 x 13 x 15 cm或更大的花盆中。
  2. 保持生长条件（16小时光照周期，每周施肥一次）。

6. 感染确认（表型与RT-PCR检测）

  1. 在接种后14至21天（DPI）期间对植株进行表型评分。lesion mimic 22 或 phytoene desaturase 基因沉默所产生的病斑在叶片上清晰可见，且与FoMV症状明显不同。GFP表达可通过荧光显微镜成像或其他紫外光成像方法检测。
    注意：某些构建体/病毒载体可能需要更长时间才能显现症状，甚至完全不出现症状。高光照条件会显著增强沉默 lesion mimic 22 和 phytoene desaturase 所引起的表型。若植株培养于较低光照条件下（如人工气候室），病斑可能较难观察或缺失，但通过RT-PCR测定的实际感染率不应受到影响（表1）。
  2. 为从分子水平确认感染情况，在接种后14至21天采集第6片叶，按照制造商说明书使用苯酚-氯仿法提取总RNA。
  3. 以提取的RNA为模板合成第一链cDNA。
    1. 配制cDNA合成反应体系：最多加入5 µg总RNA、1 µL随机六聚体引物、1 µL寡核苷酸(dT)18引物、1 µL dNTPs、1 µL逆转录酶，并加水至终体积为14.5 µL。
  4. 以针对病毒载体设计的引物和cDNA为模板，对每个样品进行PCR扩增，以确认病毒感染并检测目标基因或基因片段的完整性（操作如1.1.1所述），但为避免假阳性结果，FoMV的扩增循环数减少至25次，SCMV减少至30次。
    1. 对于FoMV基因沉默载体，使用引物FM-5840F和FM-6138R扩增包含玉米基因片段的MCS1*区域；对于FoMV表达载体，使用引物5AmuS2和5AmuA2扩增包含插入基因的MCS2区域。
    2. 对于SCMV表达载体，使用引物SC745-F和HCProR1扩增包含插入基因的MCS区域（见补充图3）。
    3. 内源性对照基因扩增使用引物ZmActS和ZmActA，用于扩增玉米actin（GRMZM2G126010）的mRNA片段；或使用引物ZmUbiF和ZmUbiR，用于扩增玉米polyubiquitin（GRMZM2G409726_T01）的mRNA片段。
  5. 将PCR产物在含核酸染料的1%琼脂糖凝胶上电泳，以判断病毒及目标基因或基因片段的存在与否。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究的目的是建立一种简单的方法，用于将经过基因沉默或基因表达改造的重组病毒直接导入玉米幼苗（图2）。携带插入片段的病毒载体通过标准的分子生物学技术进行设计和克隆。用于基因沉默的基因片段插入到FoMV-EV的MCS1*位点，而用于表达的编码序列则插入到FoMV-EV的MCS2位点或SCMV-EV的MCS位点。将构建好的质粒转化至农杆菌（Agrobacterium）菌株GV3101中。随后，在播种后一周内对玉米幼苗进行注射。注射两周后，可通过表型和分子方法评估植株的病毒感染情况、基因沉默效果以及基因表达水平。

玉米植株在泥炭基质中生长4-7天。在此阶段，茎尖分生组织恰好位于胚芽鞘节上方（图3A）。在胚芽鞘伸长至2-3厘米或播种后不超过7天时，对植株进行注射，注射位置位于胚芽鞘节上方2-3毫米处（图3B-F）。注射后约12天，植株叶片开始出现基因沉默表型，通常出现在维管组织附近，这些病变为肉眼可辨，且与FoMV病毒花叶症状明显不同（图4）。在注射后的植株中可同时检测到FoMV的存在以及目标基因的沉默（图5）。注射后约两周，在荧光显微镜下可检测到GFP表达，且在第5至第7片叶上表达最强（图6）。在荧光成像系统下观察，由FoMV驱动的GFP表达表现为沿维管组织分布于叶片上的多个细小、点状荧光区域，而由SCMV驱动的GFP表达则呈现为较大片状的荧光区域（图6，补充图1）。尽管携带FoMV基因沉默载体的植株常表现出病毒花叶症状，但成功表达GFP的GFP表达载体注射植株往往不表现出这些症状。因此，即使植株无可见症状，仍可能检测到病毒和GFP的表达。此外，在农杆菌注射过程中应避免刺穿分生组织，以免引起形态学缺陷；然而，即使发生刺伤，植株通常仍可存活，但常表现出症状（图7）。

尽管本实验方案最初是利用甜玉米开发的，但多种玉米自交系均可通过农杆菌注射法成功接种FoMV基因沉默载体。例如，FR1064和B73通常具有较高的病毒感染率（表2）。值得注意的是，Mo17系已知对FoMV具有遗传抗性，其感染效率如预期为0%36, 53。此外，所使用的载体也会影响感染效率（表3）。以FoMV为例，FoMV-EV和FoMV-LES22的感染效率通常最高，分别为53%和54%。FoMV-PDS的效率略低，为38%，而FoMV-GFP最低，仅为17%。SCMV-GFP的感染效率为8%。这些百分比为多次实验的平均值；单次实验的感染效率可能更高或更低。

FoMV 沉默和表达载体示意图；pCAMBIA1380 质粒系统中的基因结构。
图 1：用于玉米农杆菌注射的 FoMV 和 SCMV T-DNA 克隆示意图。 FoMV 载体包含两个多克隆位点（MCS1* 和 MCS2）。空载体 FoMV-EV 为 7,269 bp，两个 MCS 中均无插入片段。（A）利用 FoMV 载体进行基因沉默，可通过将基因片段插入 MCS1* 实现，该片段指定为目标序列（SOI），通常采用反向互补方向。（B）利用 FoMV 载体进行基因表达，可通过将基因的开放阅读框（ORF）以正向插入 MCS2 实现，该片段同样指定为目标序列（SOI）。（C）SCMV 载体经改造后在 P1 和 HCPro 之间设有一个多克隆位点（MCS）。空载体 SCMV-EV 为 11,015 bp，MCS 中无任何插入片段。插入 MCS 中且与 SCMV 多聚蛋白读码框一致的基因 ORF 将被表达为蛋白质。请点击此处查看此图的放大版本。

Gene editing workflow diagram; cloning, PCR, maize growth, RNA extraction, electrophoresis analysis.
图2农杆菌注射实验流程示意图 (A将目的片段（SOI，可以是CDS或基因片段）克隆至病毒载体中，并转化进入 农杆菌 菌株GV3101。B) 播种玉米并培养 4-7 天。C在28 °C下于液体培养基中过夜培养GV3101。D制备用于注射的细菌悬液。E在胚芽鞘节上方2-3毫米处，向幼苗注入100-200 µL悬浮液。F将7天大的幼苗移栽至较大的花盆中，继续培养2-3周，直至植株长至5叶期th 叶片可见。如有需要，记录表型。G) 取第5片叶片并提取RNA。H) 制备cDNA并进行PCR以扩增病毒/SOI。我在琼脂糖凝胶上进行电泳以开展定性分析，确定病毒的存在/缺失以及SOI是否发生截短或保持完整。该图使用BioRender.com制作。 请点击此处以查看此图的放大版本。

玉米幼苗生长；展示胚芽鞘节、分生组织的注射方法；植物实验装置。
图 3：在胚芽鞘节上方进行农杆菌注射接种幼苗的方法。（A）4–5天龄的植株。胚芽鞘已完全伸展，第一片真叶可能部分可见，但尚未展开。（B）6–7天龄的植株。第一片叶可能已经展开，但尚无叶环可见。第二片叶也可见，此阶段可能开始展开。（C）6–7天龄植株的解剖图，显示茎尖分生组织相对于胚芽鞘节的位置。（D）对4–5天龄植株进行注射。（E）对6–7天龄植株进行注射。（F）使用染料溶液对6–7天龄植株进行注射，显示染色的接种物从幼苗叶鞘中渗出。（G）6–7天龄植株注射位点的特写，显示其与胚芽鞘节的相对位置。（H）6–7天龄植株注射后的特写，显示染色的接种物存在于植株叶鞘中。请点击此处查看该图的放大版本。

植物病理学；上图：坏死病斑，下图：光漂白条纹；疾病分析。
图4：农杆菌注射实验中所用沉默对照基因的症状表现。（A）植物注射FoMV-LES22后17天（DPI）拍摄的叶片照片。FoMV-LES22携带一段329 bp的玉米lesion mimic 22基因3'编码区（CDS）反向插入片段。基因沉默导致有毒代谢物积累，进而引发坏死病斑，最初沿维管束呈现为条纹状，随后扩展为较大的斑块，如图所示。（B）植物注射FoMV-PDS后17天（DPI）拍摄的叶片照片。FoMV-PDS携带一段313 bp的高粱phytoene desaturase基因3'编码区（CDS）反向插入片段。在玉米中沉默pds基因会引起系统性光漂白表型，最初沿维管束出现细小的条纹，随后沿叶片长度方向发展为更长的条纹，如图所示。请点击此处查看该图的放大版本。

Gene expression analysis using qRT-PCR; western blot, graph, experimental results, FoMV, Zm-Actin.
图5：利用FoMV基因沉默载体注射植物后的qRT-PCR分析。 通过农杆菌注射法将FoMV-LES22和FoMV-PDS载体导入甜玉米植株（Golden x Bantam）后，验证系统性FoMV感染及基因沉默效应。A凝胶图像显示了RT-PCR分析结果，证实了5株独立植株的第6片叶片中存在FoMV-MCS1*空载体（315 bp扩增片段）和FoMV-PDS（625 bp扩增片段）。所用PCR引物扩增的片段跨越MCS1*区域。玉米基因actin（Zm-Actin）扩增片段作为参考基因。柱状图表示通过农杆菌注射FoMV-MCS1*或FoMV-PDS后37天（dpi），第6片叶片中pds基因的qRT-PCR相对表达量。基因沉默的抑制 pds 在五个生物学重复中均可检测到（p=0.003；事后Dunnett检验；误差棒表示三次技术重复的标准差（SD））。(B凝胶图像显示RT-PCR分析结果，证实5株独立植株的第6片叶片中存在FoMV-MCS1*（315 bp扩增片段）。在10株独立植株中，第6片叶片组织（样品FoMV-LES22 1–5，接种后38天）和第4片叶片（样品FoMV-LES22 6–10，接种后20天）均检测到FoMV-LES22（625 bp扩增片段）。Zm-Actin扩增片段作为参考基因。柱状图表示通过农杆菌注射FoMV-MCS1*或FoMV-LES22病毒载体后，玉米组织中les22基因的qRT-PCR相对表达量。在10个生物学重复中，有9个出现les22表达抑制（p=<0.0001；事后Dunnett检验；误差线表示三次技术重复的标准差（SD）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

植物荧光成像，GFP检测；显微镜滤光片：可见光、叶绿素、GFP、DIC、DsRed、EGFP。
图6．农杆菌注射实验中所用不同构建体的表型。 所有成像植株在6-7日龄时注射携带指定构建体的根癌农杆菌（Agrobacterium）菌株GV3101。图像采集于接种后16天（DPI）。（A）pCAMBIA1380（空载体骨架）、FoMV-EV、FoMV-GFP和SCMV-GFP植株叶片在可见光下、FluorCam叶绿素滤光片下（曝光250 µs）以及FluorCam GFP滤光片下（曝光10 ms）的叶片症状。（B）对照处理（仅注射MgSO4溶液）、FoMV-EV和FoMV-GFP注射植株叶片的荧光显微图像。显示了DIC、DsRed和EGFP通道，各通道曝光时间均为1500 ms。比例尺为200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

植物生理学，叶片撕裂示意图，生长条件下叶片分裂的研究，植物学研究。
图7。注射的形态学效应。 直接注射到分生组织中可能引发较严重的形态学变化。这种损伤可导致叶片“撕裂”以及茎干分裂。 请点击此处查看该图的放大版本。

病毒培养条件基因型感染植株数植株总数感染率平均感染率
FoMV-EV培养室甜玉米222396%97%
B731818100%
B104202195%
温室甜玉米202387%89%
B73171894%
B104161984%
SCMV-EV培养室甜玉米142167%47%
B7351828%
B104102148%
温室甜玉米142361%49%
B730190%
B104192286%

表1：温室与生长室条件对农杆菌注射接种效率的影响。 种子在相同的生长条件下萌发。萌发后的幼苗进行农杆菌注射，其中一半移至生长室（25 °C，16小时光照/22 °C，8小时黑暗；185 PAR），另一半移至温室（22–25 °C，16小时光照/22–25 °C，8小时黑暗；350–400 PAR）。本表列出了感染率（以百分比表示），计算方法为经RT-PCR确认感染相应病毒的植株数除以农杆菌注射的总植株数。生长室与温室条件之间的感染效率无统计学差异（FoMV双尾t检验p=0.08；SCMV双尾t检验p=0.96）。

玉米基因型FoMV-EVFoMV-LES22合计感染率
感染数总数感染率%感染数总数感染率%感染率%
甜玉米182378%152365%72%
MO4772232%1215%19%
K551157%31718%13%
W64A102245%82040%43%
MO170160%0130%0%
B73101856%71741%49%
B101122157%82433%44%
FR106444100%44100%100%
B104102245%52124%35%
WCC222729%4667%46%
A188030%4667%44%

表2：FoMV载体在不同玉米基因型中的侵染效率。 将FoMV-EV和FoMV-LES22通过农杆菌注射至11种玉米基因型中。注射后，将幼苗转移至温室中培养。本表格列出了侵染率（百分比），该数值通过RT-PCR确认的FoMV侵染植株数除以总注射植株数计算得出。合并总侵染率表示两种FoMV载体在每种基因型中侵染率的平均值。

植物时期4-5天龄植物6-7天龄植物合计感染率
发病植株数总植株数感染率%发病植株数总植株数感染率%感染率%
FoMV-EV427258%8017047%53% (A)
FoMV-PDS6515741%6618436%39% (B C)
FoMV-LES2211519559%14429249%54% (A B)
FoMV-GFP1610316%3721717%16% (C)
SCMV-GFP109511%5826%8% (C)

表3：注射实验总结。 本表格总结了2017年8月至2018年8月期间在Golden Bantam甜玉米幼苗上进行的注射实验。通过肉眼观察（FoMV-EV、FoMV-PDS和FoMV-LES22）或FluorCam检测（FoMV-GFP和SCMV-GFP），对植株的病毒症状（FoMV-EV）、基因沉默症状（pds 和 les22）或GFP荧光（GFP）进行评估。结果分别列出4-5天龄和6-7天龄植株的数据，并提供所有植株年龄的总体汇总。4-5天龄植株与6-7天龄植株之间未发现显著差异（单因素方差分析，F=0.6513）。不同病毒载体间存在显著差异（单因素方差分析，F=<0.0001），字母表示Tukey-Kramer HSD连接字母报告结果。

补充表1：本方案中使用的所有引物名称及序列列表。 请点击此处下载该表格。

补充表 2：乙酰丁香酮测试。（A）初始乙酰丁香酮测试，比较在含有 200 µM 乙酰丁香酮（+）或不含乙酰丁香酮（-）的接种悬浮液中，接种空白对照、FoMV-EV 和 FoMV-LES22 植物后症状出现的比率。（B）通过 RT-PCR 检测 FoMV-LES22 感染率的比较，接种悬浮液分别为：不含乙酰丁香酮（-）、含 200 µM 乙酰丁香酮（+），以及在重悬于缓冲液前 4 小时向细菌培养物中添加 20 µM 乙酰丁香酮，并在最终悬浮液中加入 200 µM 乙酰丁香酮（++）。总体而言，不同乙酰丁香酮处理之间未发现显著差异（单因素方差分析，f=0.5452）。请点击此处下载该表格。

补充图1：农杆菌注射的SCMV的荧光成像及其在玉米中异源蛋白表达的分子验证。 玉米通过农杆菌注射导入了一种改良的SCMV载体，该载体包含GFP和纳米荧光素酶（NLuc）的两个编码序列（CDS）。（A）采用Fluorcam成像系统对GFP进行筛选和检测。左侧为对照注射植株，右侧为SCMV-NLucGFP注射植株。（B）提取叶片蛋白后进行SDS-PAGE分离，并通过凝胶内荧光素酶活性检测或免疫印迹分析检测NLuc、GFP及SCMV衣壳蛋白（CP）的存在。请点击此处下载该文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agrobacterium 是一种重要的工具，可促进植物相关研究中多种分子生物学技术的应用。本研究提供了一种农杆菌注射（agroinjection）方案，用于将 FoMV 和 SCMV 病毒载体直接接种到玉米组织中，以应用于病毒诱导基因沉默（VIGS）和病毒介导的过表达（VOX）。主要目标是提高基于病毒的技术在单子叶作物研究中的便捷性和实用性。尽管已有少数研究报道了对玉米进行直接农杆菌接种，但作者尚未发现详细的操作方案，且这些研究中均未见 VIGS 和 VOX 应用的实例19,22。

已有报道，并且在本方案的开发过程中也证实了，注射位置是通过农杆菌注射成功引发系统性病毒感染的关键因素19。其中，能否始终如一地在植物推荐位置进行注射被认为是最大的变量，因为玉米幼苗中分生组织的确切位置几乎无法通过肉眼识别。为尽量减少操作者之间的差异，建议解剖几株玉米幼苗直至暴露分生组织，以更清楚地观察其位置（图3C）。对于4至7天龄的植株，分生组织相对于胚芽鞘节的位置大致相同。此外，使用染色液体进行注射练习，可直观显示"接种物"在叶鞘内的扩散情况；由于注射部位会被染料标记，因此可据此验证注射位置的准确性（图3G，H）。分生组织对农杆菌注射最为敏感，但将Agrobacterium菌液直接注射到该组织会导致不良的形态学效应（图6）19。尽管分生组织受损的植株仍能存活，但所产生的缺陷并不理想，因此应避免对该组织进行直接注射。

通过农杆菌注射启动系统性病毒感染的成功可能受到多个变量的影响，因为需要三个复杂的生物系统（植物、病毒和Agrobacterium菌株）协调相互作用。这种复杂的相互作用可能得益于分生组织区域快速分裂的细胞，因此该区域是农杆菌接种的理想部位19。Agrobacterium菌株 必须能够感染植物组织的细胞，以递送携带病毒基因组的T-DNA，同时植物必须对病毒具有感受性，才能启动病毒复制和系统性感染。玉米的不同基因型对病毒（例如，Mo17对FoMV具有抗性）或Agrobacterium菌株的感受性存在差异，但大多数经过测试的基因型似乎对FoMV和SCMV均具有感受性（表1和表2）53。例如，自交系FR1064和甜玉米品种Golden Bantam可能对GV3101 Agrobacterium菌株以及基于FoMV的载体尤为敏感。

用于RT-PCR检测的取样叶片编号及取样时间对于准确评估病毒感染至关重要。在本示例中，叶片编号从第一片圆形叶（通常称为“"拇指叶"）开始，向上依次计数确定。叶片在完全展开且下一片叶开始出现时进行取样。然而，最佳取样叶片可能因所用病毒种类、生长条件及玉米基因型的不同而有所差异。因此，当将本方案应用于新的病毒系统时，建议首先开展初步的时间进程实验，以优化叶片选择和取样时间的策略。

所使用的特定载体对本实验方案的效率具有显著影响。例如，空载体FoMV-EV和SCMV-EV，以及均含有较小插入片段的FoMV-PDS 和FoMV-LES22（插入片段长度分别为313 bp和329 bp），在这些实验中通常能够产生最高比例的出现病毒症状的植株（表1和表2）。然而，携带GFP开放阅读框（720 bp）较大插入片段的重组病毒FoMV-GFP和SCMV-GFP，其感染率明显低于接种空载体或基因沉默载体的植株。这一趋势可能是由于病毒基因组中插入的外源遗传物质增加，对病毒适应性产生了负面影响所致。多项研究表明，植物病毒载体的插入片段稳定性在很大程度上依赖于插入片段的大小和序列36,54,55,56,57。此外，接种FoMV或SCMV空载体后，感染植株的比例存在明显差异，提示针对SCMV的本实验方案仍需进一步优化（表1）。这些结果表明，在构建载体时可能需要进行一定的问题排查，因为插入片段的序列和长度均会影响实验效率。

总体而言，本研究显示，农杆菌注射法（agroinjection）是一种有效的接种方法，可用于两种不同的RNA植物病毒、多种载体构型以及11种玉米基因型的幼苗接种。本研究结合之前利用玉米褪绿斑驳病毒（MCMV）或玉米条纹病毒（MSV）进行注射的研究工作，表明农杆菌注射法适用于通过RNA和DNA病毒的感染性克隆对玉米幼苗进行接种19,20,21,22。此外，本研究进一步证明，农杆菌注射法同样适用于病毒诱导基因沉默（VIGS）和病毒介导的基因过表达（VOX）载体，并可应用于低至4日龄的幼苗（表3）。本文所提出的实验方案预期将被玉米生物学家广泛采用，以促进功能基因组学研究中瞬时基因沉默（VIGS）和过表达（VOX）相关工作的开展。农杆菌注射法还具备推动基于病毒的基因编辑技术（VEdGE）的潜力，该技术此前受限于植物转化效率，而该方法可能提高基因编辑的效率和可及性58,59,60。只要合理选择合适的农杆菌（Agrobacterium）菌株、玉米基因型和病毒载体，农杆菌注射法有望成为玉米中瞬时基因功能分析的重要工具。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

研究人员无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

爱荷华州立大学是支持美国国防高级研究计划局（DARPA）“昆虫盟友”计划（项目编号：HR0011-17-2-0053）的研究团队成员之一。本研究还得到了爱荷华州立大学植物科学研究所、爱荷华州立大学作物生物工程中心、美国农业部国家食品与农业研究所（USDA NIFA）哈奇项目（项目编号：3808）以及爱荷华州州政府资金的支持。K.L.H. 还部分得到了美国国家科学基金会资助的爱荷华州立大学预测植物表型组学研究生培训项目（项目编号：DGE #1545453）以及美国农业部国家食品与农业研究所农业与食品研究倡议基金（项目编号：2019-07318）的支持。资助方在本研究的设计、数据的收集、分析与解释以及论文撰写过程中未发挥任何作用。本文所表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者观点，不一定反映资助方的观点。

感谢 Nick Lauter（美国农业部农业研究局，艾姆斯，爱荷华州）提供玉米自交系种子，Christian F. Montes-Serey（爱荷华州立大学）构建了 FoMV-GFP 克隆，以及 Tyler Austin（爱荷华州立大学）提供的技术协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器Fisher Scientific14955450或者，BD 309659
15 mL Falcon管康宁科学352059
1kb+ DNA标准参照物赛默飞世尔科技10787018用于评估PCR产物的大小
25G × 5/8" PrecisionGlide 针头Becton, Dickinson and Company (BD)305122
28°C 型培养箱用于农杆菌
37°C 培养箱对于 E. coli
乙酰丁香酮MilliporeSigmaD134406可选
琼脂MilliporeSigmaA4800
琼脂糖GeneMateE-3120用于检测病毒/插入片段稳定性的凝胶制备
根癌农杆菌 GV3101菌株携带 病毒 编码T-DNA转移机制的质粒，RifR，GmR，来自实验室库存
Bsu36INew England BiolabsR0524
cDNA试剂盒赛默飞世尔科技K1672Maxima 第一链 cDNA 合成试剂盒（含 Dnase）
氯仿Fisher ScientificC298用于RNA提取
比色皿Fisher Scientific149551271.5 mL
D-(+)-葡萄糖MilliporeSigmaG7528碱裂解法
DH5alpha 感受态细胞 E. coli 细胞New England BiolabsC2987
DNA连接酶赛默飞世尔科技K1422快速DNA连接试剂盒
EDTA（乙二胺四乙酸，二钠盐二水合物）Fisher ScientificS311碱性裂解
乙醇用于RNA提取
肥料Peters肥料15-15-15浓缩液
平插件T.O. Plastics715357C用于在托盘中萌发种子
平皿T.O. Plastics710245C在托盘中萌发种子
FluorCamPhoton Systems Instruments在显微镜观察前对玉米植株进行GFP表达检测
荧光显微镜
凝胶电泳槽
硫酸庆大霉素Fisher ScientificBP918
冰醋酸Fisher ScientificA38碱裂解法
甘油Fisher ScientificG33-500用于保存细菌的冷冻菌种
Go-Taq，2XPromegaM7123
盐酸Fisher ScientificA144用于调节溶液 pH 值
异丙醇Sigma-Aldrich109827用于RNA提取
卡那霉素单硫酸盐Fisher ScientificBP906
大型培养皿KordlokSQL05505x5x4" 或更大。  用于幼苗移栽。
Luria Bertani (LB) 肉汤，MillerHimediaM1245
七水硫酸镁Amresco662
玉米金黄矮生甜玉米种子美国草地，西海岸种子
玉米自交系种子我们的种子来自本机构，但我们 <强>不 能够为其他研究人员提供此支持。
Maxima H Minus 逆转录酶赛默飞世尔科技EP0753
MilliQElgaPurelab Ultra
Monarch PCR &和 DNA 纯化试剂盒New England BiolabsT1030
PacINew England BiolabsR0547
Peters Excel 15-5-15 肥料ICL 专用肥料G99140
培养皿，95 mm × 15 mmFisher ScientificFB0875714G
pH计
乙酸钾Fisher ScientificP171碱裂解法
引物我们的引物由本机构的DNA合成平台或IDT公司合成
PspOMINew England BiolabsR0653
Q5 高保真 DNA 聚合酶New England BiolabsM0491
利福平EMD Millipore Corp557303
Rnase A赛默飞世尔科技12091021碱裂解法
SbfINew England BiolabsR0642
量程用于称量培养基或缓冲液的化学试剂
SDS（十二烷基硫酸钠）Fisher ScientificBP166碱裂解法
氢氧化钠Fisher ScientificS318碱裂解法
土壤基质SunGro园艺SS#1-F1P阳光营养土 #1/Fafard-1P，任何适合玉米良好生长的土壤混合物均可
分光光度计用于测量 OD600
Sybr Safe，10,000×InvitrogenS33102用于检测病毒/插入片段稳定性的凝胶制备
PCR仪用于PCR
Tris BaseFisher ScientificBP154碱性裂解
TrizolAmbion15596018用于RNA提取
称量纸用于称量培养基或缓冲液的化学试剂
XbaI新英格兰生物实验室R0145

参考文献

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