本文介绍了一种新方案，用于在生理流动条件下，研究和绘制药物载体在体外构建的、真实尺寸的三维人动脉模型中向内皮细胞的靶向沉积。该方法可作为血管系统内药物载体靶向递送的新平台。
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摘要
摘要
使用具有正确尺寸和解剖结构的人类动脉三维（3D）模型，能够准确模拟心血管系统中的多种重要生理过程。尽管近年来已有若干生物学研究应用了此类人类动脉的3D模型，但其在血管靶向研究中的应用尚未开展。本文介绍一种利用3D打印技术制备真实尺寸、可重建的人类动脉模型的新方法，并以人源内皮细胞（ECs）对模型内壁进行衬覆，用于在生理流动条件下研究颗粒靶向行为。该模型的优势在于能够利用低成本组件重现人体血管的生理尺寸和生理环境。该技术有望成为研究和理解心血管系统中药物靶向作用的新平台，并有助于优化新型可注射纳米药物的设计。此外，该方法可为在个体化血流和生理条件下研究心血管疾病治疗中各类药物的靶向递送提供重要工具。
引言
近年来，多种方法已应用于人类动脉的三维模型1,2,3,4,5这些模型复制了人体不同动脉的生理解剖结构和微环境 体外然而，这些研究主要应用于细胞生物学领域。目前关于颗粒物靶向血管内皮的研究包括 计算机模拟 计算模拟6,7,8, 体外 微流控模型9,10,11，以及 体内 动物模型12尽管这些实验模型提供了重要的见解，但它们未能准确模拟在人类动脉中发生的靶向过程，其中血流和血流动力学是主导因素。例如，对颗粒靶向颈动脉分叉处动脉粥样硬化区域的研究显示，该区域以复杂的回流流动模式和管壁剪切应力梯度为特征，这可能影响颗粒在到达内皮细胞之前所经历的路径13,14,15,16因此，这些研究必须在能够模拟生理环境的条件下进行， 即大小、尺寸、解剖结构和流速分布。
近期，本研究团队构建了三维重建的人体动脉模型，用于研究颗粒在血管系统中的沉积与靶向特性17。这些模型基于人体血管的几何三维复制品，并在其内壁培养了人源内皮细胞（ECs），使其形成内衬。此外，当该模型被置于可产生生理流动的灌注系统中时，能够准确模拟生理条件。该灌注系统采用蠕动泵，可在闭合与开放回路配置下以恒定流速进行液体灌注（图1）。系统可作为闭合回路使用，用于绘制颗粒在颈动脉模型内部接种细胞上的沉积与靶向分布图；同时，也可作为开放回路，在实验结束时洗脱未黏附的颗粒，并用于系统的清洗与维护。本文提供了构建人颈动脉分叉三维模型、设计灌注系统以及绘制靶向颗粒在模型内部沉积分布图的详细实验方案。
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方案
注意：本方案描述了颈动脉三维模型的制备方法，通过简单调整几何参数，该方法也可用于生成其他任何目标动脉的模型。
1. 人颈动脉模型三分叉结构的设计与制备
- 选择来自患者或先前研究过的人类颈动脉分叉的几何结构图像，并创建需要打印的模具的计算机辅助设计模型。
注意：颈动脉分叉具有一个入口和两个出口。必须在动脉周围设计一个三维模具框架，并在框架与动脉模具之间设置临时打印支撑（图2A-C）。 - 使用3D打印机打印几何结构。切除临时打印支撑，并用砂纸打磨和抛光模具，特别是在支撑被切除的区域。用异丙醇冲洗打磨后的模型以去除塑料粉尘，并在通风橱中完全干燥2-3小时。
注意：此处打印的模具由透明树脂v4制成（图2D,E）。 - 为便于溶解塑料，在通风橱内用透明清漆喷涂模具，并静置晾干1小时。重复此步骤3次。
注意：此处使用了2X Ultra Cover Clear Spray，但只要不是木器清漆，其他类型的清漆也可适用。需确认无裸露塑料残留，因为塑料可能与硅胶发生反应，阻碍其正常固化。喷涂表面的质量将决定最终硅胶模型表面的质量。 - 裁剪与模具框架尺寸相同的透明光滑塑料矩形片/条，并使用清漆将其从所有侧面以及框架的一侧粘接到框架上，使底部密封而顶部开口。在通风橱内使用毛刷涂抹清漆，并让塑料片至少完全干燥24小时（图2F）。
- 配制硅橡胶混合液时，将液态硅胶与其固化剂按1:10的质量比加入塑料培养皿中，并充分搅拌 以确保完全混合。对于颈动脉模型，加入54 g硅胶和6 g固化剂。
- 将混合液在4 °C下冷却15分钟，然后置于真空干燥器中脱气，直至所有气泡完全消除。将模具放入干燥器中（开口朝上），缓慢将硅胶混合液倒入模具中，再次去除气泡，直至混合液变得透明。
- 让模具在室温下静置过夜（如有可能，将其留在无真空状态的干燥器中）。如果混合液未完全干燥，则在60 °C下继续孵育数小时。
- 待混合液完全干燥后，取下透明塑料片，将模型置于通风橱内的无水丙酮中浸泡48小时，直至塑料完全溶解。用木棒清除任何残留的塑料碎片。为蒸发模型内部滞留的丙酮，在接种细胞前需在60 °C下孵育至少4天。
2. 模型中的细胞培养与接种
- 为颈动脉模型准备三个连接器：一个用于入口，两个用于出口（参见 材料表）。在生物安全柜中通过紫外照射对模型和连接器进行20分钟的灭菌处理。
- 用 4 mL 浓度为 100 µg/mL 的纤连蛋白溶液（溶于 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中）包被模型，37 °C 下孵育 2 小时，或 4 °C 过夜。使用 5 或 10 mL 塑料注射器将纤连蛋白溶液从入口注入模型中。通过出口移除纤连蛋白溶液，并用 EC 培养基洗涤模型。
- 将 2.5 × 10⁶ 个细胞重悬于6 细胞/mL 人脐静脉内皮细胞（HUVECs，代次 < 6），使用5或10 mL塑料注射器将4 mL细胞悬液注入模型中（图3A）。将模型置于培养箱内（37 °C）的旋转仪上，以1 rpm的速度旋转48小时，以确保细胞均匀接种。确保模型牢固地固定在旋转仪上（图3B)。在生物安全柜中更换培养基，24小时后将样品放回培养箱内的旋转仪中继续培养24小时。
注意：24 小时后，细胞已接种，可使用显微镜进行成像。 - 将模型从旋转器上取下，使用10 mL塑料注射器以1×PBS清洗。为固定细胞，在化学通风橱内向模型中加入4 mL 4%多聚甲醛（PFA），孵育15分钟，随后用PBS冲洗3次。加入4 mL PBS，于4 °C保存直至实验使用图3C). 采用标准染色方案对模型内的细胞进行染色（例如， 使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行细胞核染色， 图3D).
3. 灌注系统的设计
- 灌流系统有两个入口和两个出口管路。将两个入口合并为一根内径4 mm的管路，再分为两根内径6 mm的管路，连接至蠕动泵。将来自蠕动泵的两根内径6 mm管路合并为一根内径4 mm的管路，并连接至一个振荡阻尼器，以消除泵产生的任何振荡。使用一个带三孔盖的250 mL窄口瓶作为阻尼器。
- 将其中一个孔连接来自泵的入口管路，第二个孔用软木塞封闭，用于紧急情况下的压力释放，第三个孔（即出口）延伸至瓶底。
- 使用出口管路将阻尼器连接至培养的颈动脉模型的入口。将模型的两个出口合并为一根管路，作为系统的出口（所有管路内径均为4 mm）。
- 将出口管路分为两根出口管（一根用于闭路循环，另一根用于开路循环中的废液容器）。在每根管路上安装一个塑料夹。
注意：开/闭夹的组合方式将决定系统处于闭路或开路循环配置。如图1所示，若夹子a和d关闭，而b和c打开，则系统为闭路循环；反之则系统转为开路循环配置。 - 准备三个容器：一个可容纳300 mL液体的容器（用于闭路循环），另两个各为1 L的容器：一个用于冲洗，另一个用于盛放废液（用于开路循环）。
4. 闭路配置：灌注实验与成像
- 向闭路容器中加入 300 mL PBS，足以充满整个系统，包括管路和模型。将一根进样管和一根出样管（打开夹子 b 和 c）放入容器内。
- 将 1 L 清洗容器中装满蒸馏水（用于实验结束后的清洗），另一个 1 L 废液容器保持空置。将另一根进样管和出样管（关闭夹子 a 和 d）分别放入清洗容器和废液容器中。
- 从 4 °C 保存环境中取出固定的细胞培养颈动脉模型，并倒出 PBS。按照步骤 3.3–3.4 所述连接颈动脉的进样口和出样口。切勿让模型长时间处于干燥状态。一旦模型连接完成，立即启动泵以灌注液体。
- 将颈动脉模型置于显微镜下。打开颈动脉模型进样口前和出样口后的管路。将蠕动泵设置为 10 rpm 并启动。每 4–5 分钟以 5 rpm 的增幅逐步提高转速。确保系统无泄漏。
- 当转速达到 100 rpm 时（相当于人颈动脉生理波形的最大流速，约 400 mL/min），向闭路容器中的 300 mL PBS 中加入荧光羧基化聚苯乙烯（PS）颗粒（2 µm，浓度为 1.6 µg/mL）。每 10 秒对目标区域成像一次，持续 1.5 小时（根据需要采集单张图像或视频）。
5. 开路配置：洗涤步骤
- 打开1 L容器中清洗管和废液管的夹子（夹子a和d），并立即关闭300 mL容器中进样管和出样管的夹子（夹子b和c），以将系统从封闭回路转换为开放回路配置。
- 以100 rpm的转速使大部分水从清洗容器流入废液容器。在液体完全转移之前，按停止键关闭蠕动泵，并关闭颈动脉模型入口前和出口后的管路夹。
- 使用适当的滤光片，在感兴趣区域拍摄模型图像，以显示颗粒在细胞上的沉积与黏附情况。断开颈动脉模型，通过模型入口，用10 mL注射器缓慢而小心地加入4 mL PBS。
- 连接 "假模型"，（该模型也是一种硅橡胶3D颈动脉模型，仅用于清洗，不含培养细胞）替代颈动脉模型，并冲洗系统。加入另外1升水，再次清洗系统，直至所有水从清洗容器转移至废液容器。关闭蠕动泵。
6. 数据采集与分析
- 使用定制软件代码（参见材料表），采集实验过程中感兴趣区域颗粒沉积的数字视频图像。
- 为绘制颗粒在模型上的沉积分布图，需拼接多幅图像以覆盖所研究的感兴趣区域（图4A、B）。
注意：可编写定制软件代码以量化特定位置黏附的颗粒数量（示例文件已作为补充信息提供）17。
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结果
本文介绍了一种用于绘制颗粒在真实尺寸的三维人体动脉模型内沉积分布的新方案，该方案可能为药物递送研究提供一个新平台。利用三维打印技术，制备了人体颈动脉分叉段的模型（图2）。该模型由硅橡胶制成，并接种了人源内皮细胞（ECs）（图3）。重要的是，本方案能够模拟生理条件，尤其是在流体动力学方面的条件。设计了一套灌注系统，用于在与颈动脉生理波形特征相符的恒定流量条件下，将颗粒灌注至颈动脉分叉处。图1展示了该灌注系统，其组成部分包括蠕动泵、脉动阻尼器、培养的分叉模型、管路以及流体容器。
为了确定灌注颗粒的沉积和黏附情况，在实验结束时以及清洗后（步骤5.3），于体视显微镜下对动脉模型进行成像。使用2倍物镜采集图像，并拼接形成模型的整体图像。随后，采用定制的软件代码计算黏附颗粒的数量。为了观察分叉处再循环模式的形成，将10 µm荧光玻璃微珠注入模型中。图4A展示...
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讨论
目前研究颗粒血管靶向性的方法在模拟人体内存在的生理条件方面存在不足。本文介绍了一种用于构建人动脉三维重建模型的方案，结合定制的灌注系统施加生理流动条件，以研究颗粒在动脉内皮细胞层上的靶向行为。在选择3D打印材料时，最好使用透明塑料，以避免颜料转移到硅胶模型中，模型应尽可能透明。此外，重要的是选择一种在丙酮中不溶解的材料，该材料在丙酮中会变软并变脆，随后可轻松从模型中去除。
所展示的3D模型由硅橡胶（一种透明硅胶）与其固化剂混合制成。必须确保混合物始终处于室温或更低温度，否则硅胶与固化剂之间的交联反应将在脱气和浇注到模具之前提前开始。尽管聚二甲基硅氧烷也可用于制备此类模型（与其交联剂按1:10比例混合），但硅橡胶更耐用。将模型浸入丙酮中以溶解塑料后，必须在60 °C下孵育至少4天，以确保所有丙酮残留物完全蒸发。如果模型内部残留丙酮，细胞将无法正常生长。在24小时后更换培养基以及48小时后固定细胞，这两个步骤需要使用10 mL注射器手动注入液体。因此，灌注过程必须缓慢进行，否则可能导致细胞被冲出。
灌注系统具有两个入口和两个出口管...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由以色列科学基金会（ISF 资助号 #902/18）资助。玛丽亚·库里的奖学金由芭芭拉·阿里亚娜·德·罗斯柴尔德女性博士项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3D 打印机 | FormLabs | PKG-F2-REFURB | |
| 丙酮，分析纯（AR 级） | |||
| 连接器 | Nordson Medical | FTLL013-1 | 雌性鲁尔接头 |
| FTLL230-1 | 雌性鲁尔接头 | ||
| FTLL360-1 | 雌性鲁尔接头 | ||
| LP4-1 | 带整体锁的雄性鲁尔接头 | ||
| 阻尼器 | Thermo-Fisher Scientific | DS2127-0250 | Nalgene 聚碳酸酯验证瓶 |
| 阻尼器盖 | Thermo-Fisher Scientific | 2162-0531 | Nalgene 填充/通气密封盖 |
| Elastosil Elastosil RT 601 A | Wacker | 60003805 | |
| Elastosil RT 601 B | Wacker | 60003817 | 交联剂 |
| 内皮细胞培养基 | ScienCell | 1001 | |
| 纤维连接蛋白 | Sigma Aldrich | F0895-5mg | |
| HUVEC | Lonza | CC-2519 | |
| 异丙醇，分析纯，99.5% | 去除砂磨模型上的塑料粉尘 | ||
| 清漆 | Rust-Oleum | 2X-超覆盖高光透明漆 | |
| Matlab | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| 显微镜 | Nikon | SMZ25 | |
| 显微镜相机 | Nikon | DS-Qi2 | |
| 蠕动泵 | Watson Marlow | 530U IP31 | 配备两个泵头：313D |
| 塑料管夹 | Quickun | 1-2240-stopvalve-2pcs | |
| 聚苯乙烯微粒 | Thermo-Fisher Scientific | F8827 | 直径 = 2 µm |
| 打印机树脂 | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| 旋转混合仪 | ELMI Ltd. | Intelli-Mixer RM-2 | |
| Solidworks | SolidWorks Corp., Dassault Systèmes | https://www.solidworks.com/ | |
| 泵用软管 | Watson Marlow | 933.0064.016 | 泵用软管：内径 6.4 mm |
| 其余所有软管：硅胶管：内径 4 mm |
参考文献
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