包封固体材料的细菌纤维素微球

摘要

本方案介绍了一种简单且低成本的细菌纤维素（BC）微球制备方法。该生物材料可作为固体物质的包封介质，包括生物炭、聚合物微球和矿山废弃物。

摘要

自细菌纤维素（BC）作为一种新型材料普及以来，BC微球的研究日益增多。本实验方案介绍了一种经济且简便的BC微球制备方法。除了制备这些微球外，还开发了一种用于固体颗粒包封的方法。制备BC微球时，将水、红茶、糖、醋和细菌培养物加入带挡板的锥形瓶中，并对内容物进行振荡培养。在确定了适宜的BC微球形成培养条件后，采用生物炭、聚合物微珠和矿山废弃物测试了微球对固体颗粒的包封能力。利用ImageJ软件和热重分析（TGA）对所制得的微球进行了表征。结果表明，直径为7.5 mm的微球可在7天内形成。添加不同颗粒可增加BC微胶囊的平均尺寸范围。微球包封量可达其干重的10–20%。该方法展示了利用易得材料实现低成本微球制备与包封的可行性。未来，BC微球可望用于污染物去除辅助剂、控释肥料包衣或土壤改良剂。

引言

细菌纤维素（BC）因其机械强度高、纯度高、结晶度高、保水能力强以及复杂的纤维结构，被认为在工业应用方面具有巨大潜力^1,2,3,4这些特性使BC成为多种应用中的理想生物材料，包括生物医学、食品加工和环境修复领域¹BC薄膜的形成可使用单一微生物培养物或混合培养物（如用于康普茶的培养物）来完成。⁵，一种发酵茶饮料。制作康普茶依赖于一种 "细菌与酵母的共生培养"，通常称为SCOBY。利用这种共生微生物培养物，可采用类似技术制备细菌纤维素（BC）微球。该生物材料可用于帮助分离环境污染物，并固定生物炭等农业改良剂，以实现更高效的农作物生产。

先前的文献已讨论了在振荡条件下产生的细菌纤维素（BC）与在静止培养条件下产生的细菌纤维素之间的特性差异。静止培养会在液-气界面形成一层膜，而振荡培养则产生悬浮于液体中的不同形态的细菌纤维素颗粒、纤维束和球状结构⁶。许多研究指出，在动态条件下进行细菌纤维素的商业化生产更具可行性^6,7，这为本论文所采用方法的应用提供了依据。此外，已有多种关于细菌纤维素球状结构及其特性的研究。Toyosaki 等人⁶比较了在振荡条件下使用带挡板和光滑壁的锥形瓶进行细菌纤维素生产的效果。Hu 和 Catchmark 的一项研究⁴确定了细菌纤维素球形成的条件，这些条件被用作当前细菌纤维素球制备过程的指导参数，其结果表明，球体尺寸在培养60小时后不再继续增大。Mohammad 等人¹对细菌纤维素生产的综述指出，振荡培养可确保氧气的均匀供应与分布，这对于细菌纤维素的成功生长至关重要。Holland 等人⁸利用X射线衍射和傅里叶变换红外光谱技术研究了细菌纤维素的结晶度和化学结构。可以推测，细菌纤维素微胶囊将表现出类似的特性，未来的研究将进一步探讨其结构特性。此外，已有研究探索了利用细菌纤维素制备性能更优的生物复合材料的有益效果。以环氧树脂为基体，研究人员已证明添加细菌纤维素可改善材料的疲劳寿命、断裂韧性以及拉伸和弯曲强度^9,10。如过去和当前的研究所示，目前许多人对推动细菌纤维素的商业化应用表现出浓厚兴趣。

许多研究人员已对细菌纤维素在控释系统中的应用进行了研究，本文所述方法制备的微胶囊可作为控释系统使用。这些研究大多集中于生物医学领域的控释应用，同时也探索了其在控释肥料（CRF）施用中的潜力。基于细菌纤维素（BC）成功实现阿莫西林¹¹、利多卡因¹²和布洛芬¹³的控释，BC可能对其他物质（如颗粒状肥料）也表现出类似的递送特性。Shaviv和Mikkelsen¹⁴对控释肥料（CRF）的综述指出，与传统施肥方式相比，CRF效率更高、节省劳动力，且通常对环境造成的破坏更小。细菌纤维素可能是一种适用于CRF的理想包封材料。肥料可通过BC膜渗出，或在BC生物降解过程中释放^15,16。BC具有高吸水溶胀能力，也可作为有益的土壤改良剂^17,18,19，因为通过施用BC微球，肥料养分和水分均可逐步释放至土壤中。具备这些特性后，由BC微球包封形成的控释肥料可能优于其他肥料包膜材料——后者在生产和废弃阶段可能带来负面影响。将BC应用于肥料包膜有望进一步提升CRF技术。通过降低肥料释放速率，作物将有充足时间吸收养分，避免过量养分流入水体，从而减少水体富营养化及缺氧区域的形成。已有研究采用聚合物包膜制备并试点应用了类似的缓释肥料²⁰。

与以往研究中所述的方案不同，本方案侧重于制备均匀且结构完整的球形颗粒，而非追求高纤维素产率。此外，尽管已有研究利用纤维素薄膜实现对其他固体物质的包封，但尚未见有关球形结构包封的报道²¹。通过拓展细菌纤维素球形颗粒的研究，可进一步推动细菌纤维素的商业化生产，这得益于细菌纤维素环境友好的特性。本细菌纤维素球体制备方法采用价格低廉且易于获取的食品级原料。在初始组装完成后，无需干预，细菌纤维素球体即可在2天内开始形成。该策略制备细菌纤维素球体所需空间小，并产生一种可食用副产物——发酵茶“康普茶”（kombucha）。其他研究中提到的包封技术包括通过相转化技术形成的涂层^22,23、基质形成法²⁴、喷雾干燥法²⁵以及合成过程中的直接包封法²⁶。本文所述的直接包封方法适用于希望采用简便、低成本且原料易得工艺的研究者。

通过本项研究，成功建立了一种用于细菌纤维素（BC）微球制备与包封的实验方案。BC微球可在其独立结构中包封生物炭、矿山尾矿和聚苯乙烯微珠等固体颗粒。尽管目前在工业中尚未广泛应用，但BC是一种实用、可持续制备且天然存在的材料，具有未来应用的潜力。

方案

1. 细菌纤维素启动菌种的制备与维护

1. 获取约 50 g 的细菌纤维素起始培养物，形式为 SCOBY。可通过商业途径购买（例如，从 Cultures for Health 购买）。将 SCOBY 放入一个 1 L 的烧杯中，并用纸巾覆盖。
2. 将 700 mL 去离子水煮沸，转移至另一个与 SCOBY 分开的容器中，加入 85 g 蔗糖。
3. 待蔗糖完全溶解后，加入 2 袋红茶（4.87 g）。浸泡茶叶 1 小时，然后用搅拌棒小心取出茶包。
4. 向茶液中加入 200 mL 蒸馏白醋。让混合物冷却至 25 °C。冷却后，将 700 mL 室温茶液加入含有 SCOBY 的烧杯中。
   ​警告：若在茶液温度过高时加入酸性茶液，可能会损害 SCOBY 中的微生物。
5. 用纸巾覆盖烧杯，并用橡皮筋固定，然后将烧杯置于保持 25 °C 温度的储存区域。该容器通常被称为储备培养物或“菌种酒店”（hotel）。
6. 为保持 SCOBY 健康，每月需进行约 2 次维护。
   1. 戴上手套固定 SCOBY 膜，将“菌种酒店”中的液体倒入另一个烧杯中。在盛有液体的容器中，加入足量的酸性茶液，使溶液总体积达到 700 mL。
   2. 在酸性茶液容器中溶解 65 g 蔗糖。在等待蔗糖溶解期间，用去离子水小心冲洗 SCOBY 膜。
   3. 待蔗糖完全溶解后，可将液体加入含有已冲洗 SCOBY 膜的烧杯中。盖上烧杯，并放回培养区域。

2. 细菌纤维素球的制备

注意：使用沸水时需谨慎操作。确保玻璃器皿能够耐受沸水温度，无缺陷，并且尺寸合适。细菌纤维素（BC）球体生产的示意图见图1。

1. 使用烧水壶将 350 mL 去离子水煮沸。将热水转移至 500 mL 烧杯中，用玻璃棒搅拌溶解 42.5 g 颗粒蔗糖。
2. 待蔗糖完全溶解后，将 1 袋红茶（2.54 g）浸入含有蔗糖和水的烧杯中，浸泡 1 小时。之后用玻璃棒取出茶包，注意避免弄破茶包，然后将其丢弃至垃圾桶中。
3. 向烧杯中加入 100 mL 蒸馏白醋，充分搅拌混合物。将 80 mL 酸性茶混合液转移至 250 mL 带挡板锥形瓶中。让茶混合液冷却至室温（20 - 25 °C）。
   注意：此时可将混合液静置过夜，或直至准备进行下一步操作。
4. 当液体温度降至室温（20 - 25 °C）后，向带挡板锥形瓶中加入 20 mL 微生物起始培养液。该培养液可从 SCOBY 培养液中获得。用封口膜覆盖瓶口。
5. 将带挡板锥形瓶置于摇床平台上，设置转速为每分钟 125 转（rpm）。在温度为 20 - 25 °C 的室温环境或培养箱中振荡培养 3 天，以生成细菌纤维素（BC）球体。
   注意：若瓶内出现不规则形状，或纤维素团块附着在瓶壁上，应将其移除，以防止进一步形成不规则的 BC 团块。使用镊子去除不需要的 BC 团块，包括细丝、环状、管状及其他明显非球形的结构。
6. 待球体形成后，轻柔地将它们从锥形瓶中倾倒出，并进行分析、处理或用于本文未描述的其他用途。

3. 利用细菌纤维素微球包封颗粒或污染物

1. 按照上述步骤 2.1-2.5进行操作。
2. 振荡3天后，向带挡板的烧瓶中加入约0.01 g精细研磨的颗粒物。合适的固体材料包括生物炭（260 ± 140 µm）、矿山废弃物（350 ± 140 µm）和聚苯乙烯微珠（3 µm）。这些材料的数据在代表性结果部分中列出。有关生物炭、矿山废弃物和微珠的进一步描述，请参见附带的材料表。
3. 再次用封口膜覆盖烧瓶，并将其放回摇床，以相同转速和室温（20 - 25 °C）继续振荡3天。之后取出BC包埋的颗粒用于分析、处理或其他用途。

图1．细菌纤维素球体制备及固体颗粒的包封。第1步是将细菌菌种培养物与红茶、糖和醋酸培养基混合加入带挡板的锥形瓶中。菌种培养物中的圆片代表细菌纤维素（BC）膜。随后，将带挡板的锥形瓶置于摇床中振荡培养3天。中间步骤显示在细菌纤维素球体形成后向瓶中加入固体颗粒，并继续振荡培养3天。最后一步中，细菌纤维素球体进一步增大，并将固体颗粒包封在内。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

在培养的前48小时内，细菌纤维素球体的生长速度最快（图2）。图2还显示，球体往往达到一个平均最大尺寸后便保持稳定。在本实验中，球体的平均直径达到7.5 ± 0.2 mm。尽管细菌纤维素球体在整个10天的生长期中从未完全退化，但从第8天左右开始，它们逐渐从球体主干部分伸出细长的须状结构。这一点在图2E中可以观察到，尤其是左上角较大的球体最为明显。

采用本文所述的包封方法，可得到平均57 ± 4个细菌纤维素球体，其直径范围为3至12 mm（图3）。从图3中还可以看出，向细菌纤维素球体中添加固体物质对球体的大小或数量并无一致的影响。轨道摇床转速、环境温度以及不规则颗粒的形成似乎是影响球形颗粒形态、大小和数量的主要因素。图4显示，过高的...

讨论

本方案概述了易于操作且成本效益高的细菌纤维素（BC）球体制备与包封方法。通过对原始方案进行多种优化，已确定出合适的工艺流程。必须遵循关键步骤以确保获得具有活性的球体。参与BC形成的全部成分均对球体的健康状态和耐久性起着关键作用：蔗糖为微生物提供营养，茶叶提供氮源，而醋则降低pH值至适宜范围，从而防止不需要的污染物滋生²⁸。本方法中的另一个重要变量是温度。在加入微生物起始培养物之前，必须将茶液冷却至室温（约25 °C）。若微生物暴露于高温下，BC球体的生长可能受到抑制。培养瓶所处环境的室温也会影响球体的生长^{3, 28, 29}。当振荡培养温度超过30 °C时，会形成不规则形状的BC结构（图4A）。在包封过程中，一个关键步骤是在添加固体颗粒之前，先让BC球体充分形成。这是因为观察发现，若烧瓶中存在异物，会抑制BC的生长。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mL 量筒
1000 mL 烧杯
25 mL 量筒
250 mL 带挡板锥形瓶	Chemglass	CLS-2040-02
500 mL 烧杯
天平
生物炭			花旗松在氩气环境下热处理，以每分钟 15 °C 的速率升温至 800 °C
红茶
去离子水
蒸馏白醋
橡皮筋
微生物起始培养物	Cultures for Health
矿山废弃物			采自蒙大拿州巴特：46.001978,-112.582465。矿山废弃物包含源自以往铜矿开采的土壤和金属。通过X射线衍射分析，测得其中含量最高的五种元素为 Mn、Si、Ca、Al 和 Fe。
研钵和研杵
轨道摇床			使用多个品牌
纸巾
聚苯乙烯微珠	Polybead	17138	直径 3 微米
搅拌棒
蔗糖
烧水壶
TGA	TA Instruments	TA Q500	以每分钟 400 °C 的速率升温至 800 °C，氮气流速 100 mL/min
温度计
XRF 分析仪	ThermoFisher Scientific	10131166