一种用于评估成年大鼠创伤性脑损伤后空间工作记忆的度量测试

摘要

创伤性脑损伤（TBI）常伴随记忆功能障碍。本文介绍了一种通过度量任务评估TBI后空间工作记忆的实验方案。度量测试是研究TBI后空间工作记忆障碍的有效工具。

摘要

创伤性脑损伤（TBI）后，感觉、短期和长期记忆受损是常见的副作用。由于人类研究存在伦理限制，动物模型为测试治疗方法以及研究该疾病的机制和相关并发症提供了合适的替代方案。实验性啮齿类动物模型因其易获得性、低成本、可重复性以及经过验证的方法，历来被最广泛使用。度量测试是一种用于研究TBI后空间工作记忆（SWM）受损情况的技术，通过检测动物对两个物体之间不同距离和角度位置的记忆能力来进行评估。度量任务的显著优势包括可实现动态观察、成本低、可重复性强、实施相对简便以及对动物造成的应激较小。本文介绍了一种用于测量成年大鼠在TBI后SWM功能受损的度量测试方案。该测试为更有效地评估脑功能的生理与病理生理状态提供了一种可行的方法。

引言

中度创伤性脑损伤（TBI）后出现注意力、执行功能及某些记忆缺陷等神经功能缺损的患病率超过50%^{1,2,3,4,5,6,7,8}。TBI可导致空间短时记忆、长时记忆和工作记忆的严重损害⁹。这些记忆功能损害已在TBI的啮齿类动物模型中被观察到。啮齿类动物模型推动了记忆检测技术的发展，使得研究人员能够更深入地探究TBI对神经记忆系统中记忆处理过程的影响。

两项分别与拓扑和度量空间信息处理相关的测试有助于测量空间工作记忆（SWM）。拓扑测试依赖于环境空间或物体周围连接或封闭空间的大小变化，而度量测试则评估物体之间角度或距离的变化^10,11。Goodrich-Hunsaker 等人首次将人类的拓扑测试改编用于大鼠¹⁰，并应用度量任务来区分顶叶皮层（PC）和背侧海马在空间信息处理中的作用¹¹。类似地，Gurkoff 及其同事在侧向液体冲击损伤后评估了度量、拓扑以及时间顺序记忆任务的表现⁹。特定脑区的损伤与度量或拓扑记忆障碍之间存在相关性。研究表明，度量记忆障碍与双侧背侧齿状回以及海马 cornu ammonis（CA）亚区 CA3 的病变相关，而拓扑记忆障碍则与双侧顶叶皮层的病变相关^10,12。

本实验方案的目的是通过度量任务评估大鼠群体中的空间记忆缺陷。该方法是研究脑损伤后SWM机制的合适替代方案，其优点包括操作相对简便、灵敏度高、可重复性成本低、可实现动态观察以及处于低应激环境。与其他行为学任务（如Barnes迷宫^13,14、Morris水迷宫导航任务^15,16,17或空间迷宫任务^18,19）相比，该度量测试更为简单。由于操作简便，度量测试所需的训练周期更短，应激性更低，且仅需2天完成⁹：1天用于适应性训练，1天用于正式任务。此外，我们提出的测试比其他低应激测试（如新物体识别（NOR）任务）更容易实施，且无需额外的适应性训练日²⁰。

本文提供了一种评估脑损伤后空间工作记忆（SWM）的简便模型。该对创伤性脑损伤（TBI）后SWM的评估方法可能有助于更全面地研究其病理生理机制。

方案

实验遵循《赫尔辛基宣言》和《东京宣言》以及欧洲共同体实验动物使用指南进行。本实验已获得内盖夫本-古里安大学动物护理委员会的批准。实验方案的时间线如图1所示。

1. 手术操作与液体脉冲性创伤性脑损伤（TBI）

1. 选择成年雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠，饲养于室温22 ± 1 °C、相对湿度40%–60%、12小时光照/12小时黑暗循环的环境中。
2. 提供饲料和饮水 随意摄取在上午时段（即6:00至12:00）进行实验。
3. 在实验开始前，对对照组和TBI组进行基线神经功能评估（见下文第2节）。
4. 使用4%异氟烷吸入麻醉诱导，1.5%异氟烷维持麻醉。通过测试足底反射或对刺激物的运动反应，确认大鼠已完全固定。
   ​注意：使用持续异氟烷给药系统进行麻醉。所有操作均须在无菌条件下进行。
5. 按照先前所述方法进行矢状旁路液体冲击损伤实验^21,22.
6. 在切口前，沿预计切口部位皮下注射 0.2 mL 的 0.5% 布比卡因。将大鼠转移至恢复室，并持续监测其神经功能（如瘫痪）、呼吸状态（如呼吸停止）和心血管状态（如软组织灌注减少、瞳孔颜色改变及心动过缓）达 24 小时。在麻醉苏醒前，给予 0.01–0.05 mg/kg 肌内注射布伦诺啡作为术后镇痛。每 6–12 小时重复给药一次，至少持续 48 小时。

2. 神经功能缺损评分（NSS）的评估

注意：神经功能缺损的评估采用神经功能评分系统（NSS）进行评分，方法如前所述^23,24。运动功能和行为改变的最高评分为24分。评分为0分表示神经功能正常，24分表示严重神经功能障碍，如先前所述²⁴。

1. 测试大鼠被放置于直径为50 cm的圆圈中心时无法离开该圆圈的能力。每轮实验分别持续30分钟、60分钟及超过60分钟，共进行三次。
   注意：若通过尾巴抓取大鼠，应握住尾巴基部。
2. 测试大鼠翻正反射的丧失情况。
   1. 将动物仰卧置于研究人员手掌中。若动物能够自行翻正（四肢着地站立），则记为1分²⁵。
3. 测试大鼠是否存在偏瘫，即无法抵抗被动强制体位的能力。
4. 通过尾巴提起大鼠，以检测后肢的反射性屈曲反应。
5. 将大鼠置于地面，测试其直线行走能力。
6. 进行三项反射行为测试：耳廓反射、角膜反射和惊吓反射。
   1. 进行耳廓反射测试时，施加轻触刺激，检测耳朵回缩反应，方法如前所述²⁵。
   2. 测试角膜反射时，用柔软细棒轻触眼部，观察眨眼反应，并按0分（无反应）至三次眨眼（3分）的评分标准进行测量，方法如前所述²⁵。
   3. 进行惊吓反射测试时，将笔沿金属笼顶部快速划过，记录反应程度，评分标准为0分（无反应）至3分（跳跃1 cm或以上），方法如前所述²⁵。
7. 根据大鼠探索行为的丧失及卧倒状态（转移至新环境后不移动胡须、不嗅探、不跑动）对其进行评分²⁴。
8. 测试左右前肢及左右后肢的肢体放置反射。
9. 通过平衡木实验评估功能，使用宽度为1.5 cm的横梁。测试时分别记录持续20秒、40秒及超过60秒的实验阶段。
10. 进行横梁行走测试，使用三种不同宽度的横梁：8.5 cm、5 cm 和 2.5 cm。

3. 准备度量任务

1. 设备
   1. 将一个直径为200 cm、厚度为1 cm的黑色圆形平台放置在桌面上。桌面高度应距离地面80 cm。
   2. 在圆形平台中心位置设置两个不同的物体，两者相距68 cm。
      注意：本实验中使用两个玻璃瓶作为物体，其中一个为高13.5 cm的圆柱形瓶，另一个为高20 cm的多面形瓶。向瓶内注水以确保其稳定性。
   3. 准备一台摄像机，并安装用于采集、保存和处理数据所需的计算机软件。将摄像机安装在距离地面290 cm的高度。
      注意：平台与摄像机之间的距离取决于摄像机的规格。摄像机画面应覆盖测试区域的整个范围。本实验中平台与摄像机之间的距离为210 cm。
2. 适应性训练
   1. 在正式实验前一天，将大鼠置于测试区域内，使其适应新环境10分钟，期间不进行视频录制。
      注意：神经学任务与度量任务不应在同一天进行。 
      注意：度量测试应在红光环境下进行。

4. 执行度量任务

注意：进行度量任务包括两个阶段：1）适应期（15 分钟）和 2）测试期（5 分钟）。

1. 适应期
   1. 在圆形平台中央放置两个不同的物体，两物体相距 68 cm。
   2. 将大鼠置于平台一端，使其距两个物体距离相等，持续 15 分钟，并录制视频。
   3. 将大鼠从平台上移开，放入单独的笼子中静置 5 分钟。
   4. 用 5%-10% 的酒精清洁平台。
      ​注意：在通风良好的区域，可使用高达 70% 的酒精清洁平台。
2. 测试期
   1. 将两个物体之间的距离缩短至 34 cm。
   2. 将大鼠放回平台，持续 5 分钟，并录制其探索行为的视频。
   3. 用 5%-10% 的酒精清洁平台。

5. 数据分析

注意：数据分析由专为动物行为研究设计的视频追踪软件完成，该软件可自动记录动物的活动和运动情况（参见材料表）。该软件可自动分析多种行为学参数，包括运动能力、活动水平和探索行为。

1. 在分析视频文件之前，插入软件硬件密钥。启动视频追踪软件并打开预设 模板.
2. 在 设置 切片，按如下方式核对设置： Arena，试验控制，以及 检测设置 （参见 图 2a) .
   注意：本实验中，探索区域的参数定义为围绕目标物体周围6 cm的范围，记录大鼠进入该区域的时间。
3. 在确认设置后，复制并重命名这些设置。
4. 在程序的主界面上 抓取背景 通过鼠标右键单击。
5. 选择一个视频文件作为背景图像。在 浏览 菜单中，选择视频文件的位置。
6. 拍摄图像并标记待研究的区域和范围，对图像进行校准以供分析。对后续样本执行相同的步骤 试验控制 和 检测设置.
7. 在主菜单中，选择 试验列表 并下载视频文件列表以供分析。
8. 添加视频并使用所需设置标明位置。
9. 选择采集和 开始试用 （参见 图2b，c）。将所有数据导出为 Excel 文件（参见 图 2d).
   注意：在适应期和测试期执行所有计算。指标任务评估使用高级模板进行准备。

结果

组间比较的显著性通过Mann-Whitney检验确定。结果的统计学显著性定义为P < 0.05，而高度统计学显著性定义为P < 0.01。

结果显示，在干预前和创伤性脑损伤（TBI）后28天，各组之间的神经功能缺损评分（NSS）无差异。每组包括12只雌性或12只雄性大鼠。TBI后48小时获得的NSS评分见表1。在损伤后第28天表现出明显神经功能缺损的TBI组大鼠被排除在实验之外。数据以计数形式测量，表示为中位数±范围。

假手术对照组在研究开始后的第48小时未表现出任何神经功能缺损（NSS-0）。根据Mann-Whitney检验（表1），创伤性脑损伤（TBI）雄性大鼠在TBI后48小时的神经功能缺损显著高于假手术雄性大鼠（5.5(4–7) vs. 0(0–0)，U = 0，p < 0.01，r = -0.89），雌性TBI大鼠也显著高于假手术雌性大鼠（4.5(3.25–6) vs. 0(0–0)，U = 0，p < 0.01，r = -0...

讨论

通过特异性靶向度量空间信息处理过程，该度量测试为理解创伤性脑损伤（TBI）后的记忆缺陷提供了必要的工具。本文所述方案是对先前描述的行为学任务的一种改进¹¹。此前描述的一种度量任务采用了两种不同的范式，每种范式均包括三次适应期阶段和一次测试阶段。第一种范式在适应期后将熟悉的物体移得更近，而第二种范式则将物体移得更远¹¹。

与需要5天¹³或14天¹⁴完成的巴恩斯迷宫相比，本文介绍的度量任务在2天内完成，第1天用于适应，第2天进行任务测试⁹。本实验方案中的任务比莫里斯水迷宫等类似行为学任务的应激性更低，因为后者涉及动物在水中游泳所产生的应激以及更长的实验持续时间^15,16,1

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70% 酒精溶液中的 2% 氯己定	SIGMA - ALDRICH	500 cc	用于手术区域皮肤的一般消毒
0.1% 布比卡因
四种不同厚度的板（1.5 cm、2.5 cm、5 cm 和 8.5 cm）	用于评估神经功能缺陷
4-0 尼龙缝合线	4-00
瓶子	Techniplast	ACBT0262SU	150 ml 瓶子，分别装有 100 ml 水和 100 ml 1% (w/v) 蔗糖溶液
用于拓扑与度量任务的四个瓶子			使用两个小瓶作为物体，第一个为圆形（高 13.5 cm），第二个为刻面形（高 20 cm）；另使用两个大刻面瓶，第一个为 9×6 cm（高 21 cm），第二个为 7×7 cm（高 21 cm）
直径 3 mm 的金刚石空心钻头		玻璃空心钻头套装	可选
电子天平	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
解剖剪刀	SIGMA - ALDRICH	Z265969
99.9% 乙醇	药房		使用 5%-10% 溶液清洁设备并去除异味
EthoVision XT（视频分析软件）	Noldus, Wageningen, 荷兰		可选
液体冲击装置	由大学车间定制		不推荐特定品牌
纱布海绵	Fisher	22-362-178
手套（薄型实验手套）			可选
带温度计的加热器	Heatingpad-1	型号：HEATINGPAD-1/2	不推荐特定品牌
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
异氟烷，USP 100%	Piramal Critical Care, Inc	NDC 66794-017	用于吸入麻醉的麻醉液体
Office 365 ProPlus	Microsoft	-	Microsoft Office Excel
Olympus BX 40 显微镜	Olympus
手术 镊子	SIGMA - ALDRICH
手术 剪刀	SIGMA - ALDRICH
用于超声波发声记录和数据分析的 PC 计算机	Intel		Intel® Core i5-6500 CPU @ 3.2GHz，16 GB 内存，64 位操作系统
由狭窄通道连接的有机玻璃箱			两个透明的 30 cm × 20 cm × 20 cm 有机玻璃箱，由一条 15 cm × 15 cm × 60 cm 的狭窄通道连接
Purina Chow	Purina	5001	提供给大鼠、小鼠和仓鼠的啮齿类动物实验饲料，是一种生命周期营养饲料，已在生物医学研究中使用超过 5 年
大鼠笼子 （大鼠居住笼或其他围栏）	Techniplast	2000P	不推荐特定品牌
11 号手术刀片	SIGMA - ALDRICH	S2771
SPSS	SPSS Inc., Chicago, IL, 美国	20 版本
立体定位仪	由大学车间定制		不推荐特定品牌
计时装置	间隔计时器：用于记录超声波发声		可选。任何计时器均可使用，但如果同时对多只大鼠进行搔痒刺激，使用间隔计时器更为方便
拓扑与度量任务装置	由内盖夫本-古里安大学自制		直径 200 cm、厚 1 cm 的白色圆形平台置于桌面上
视频摄像机	Logitech	C920 HD PRO WEBCAM	用于在十字迷宫实验中高清记录大鼠行为的数码摄像机
Windows 10	Microsoft