本工作总结了使用双色数字PCR（ddPCR）系统开发不同SARS-CoV-2检测方法的步骤。这些步骤详尽，并包含了如何改进检测方法和实验性能的说明。这些检测方法可用于多种SARS-CoV-2逆转录-数字PCR（RT-ddPCR）应用。
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本文内容
摘要
摘要
诊断当前的 SARS-CoV-2 大流行是全球各国的首要任务。目前，逆转录定量 PCR（RT-qPCR）是 SARS-CoV-2 诊断的金标准，因为尚无永久性解决方案。然而，尽管该技术有效，已有研究指出其在检测和诊断方面存在局限性，尤其是在靶标含量较低的情况下。相比之下，微滴数字 PCR（ddPCR）是一种新兴技术，相较于 qPCR 具有显著优势，已被证明能够克服 RT-qPCR 在低丰度靶标样本中检测 SARS-CoV-2 时所面临的挑战。本文前瞻性地进一步拓展了 RT-ddPCR 的能力，展示了如何利用双色检测系统开发单重、双重、三重探针混合物以及四重检测方法。通过使用靶向 SARS-CoV-2 基因组特定位点（N、ORF1ab、RPP30 和 RBD2）的引物和探针，证明了这些检测方法的可行性。此外，还提供了详细的逐步操作流程、注意事项以及优化检测流程和数据分析的建议。在未来的研究中采用此工作流程，将能够在少量样本中高灵敏度地检测最大数量的靶标，显著降低成本并提高样本通量。
引言
聚合酶链式反应（PCR）是一种广为人知的技术，自问世以来经历了多次变革，发展成为一种能够解答核酸研究问题的强大技术。这些变革是对原有技术的持续改进，可概括为三代1。第一代为常规PCR，依赖凝胶电泳对扩增产物进行检测和定量。第二代为定量实时PCR（qPCR），可实时检测样品，并依赖标准曲线对样本中的目标物进行直接定量。第三代为数字PCR（dPCR），能够在无需标准曲线的情况下实现对核酸目标物的检测和绝对定量。dPCR技术进一步发展，反应腔室从物理孔壁分隔演变为在同一孔内通过油、水和稳定化学物质形成的乳浊液进行分隔，如基于液滴的数字PCR所示2。在液滴数字PCR（ddPCR）中，样本被分割成数千个纳升级别的液滴，每个液滴包含单独的目标分子，随后通过泊松统计学进行定量2,3,4。与前两代PCR技术相比，该技术在定量低丰度目标分子方面具有显著优势。
近年来，多项应用表明，在检测和定量低丰度靶标时，数字滴定PCR（ddPCR）相较于常用的定量PCR（qPCR）具有显著优势1,5,<....
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方案
伦理声明
中国科学院武汉病毒研究所（WHIOV）是经中国疾病预防控制中心武汉市批准开展新型冠状病毒（SARS-CoV-2）研究并从临床样本中检测新型冠状病毒感染（COVID-19）的实验室和研究机构之一。使用临床样本开展针对新型冠状病毒感染（COVID-19）新型诊断技术的研究，也已获得中国科学院武汉病毒研究所伦理委员会的批准（批准编号：2020FCA001）。
1. 样品处理流程（图1A）
注意：在整个实验过程中，必须使用独立的房间，并配备专用移液器，分别用于样本处理（提取和保存）、试剂/主混合液的配制与储存、反应混合液的配制（样本加主混合液）以及检测，以避免交叉污染。所开发的检测方法可用于临床样本或科研样本的检测。即使采用安全的实验操作程序，所有样本均应被视为具有传播感染性病原体的潜在风险。样本处理步骤应在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行，并严格遵守BSL-2规范，包括穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
- 样本灭活
- 取1 mL SARS-CoV-2样本送至BSL-2实验室，于65 °C加热灭活30分钟。
注意：样本可能来自不同来源，因此应确保灭活的样本体积足够，以满足后续RNA提取需求。大多数提取试剂盒仅需最多2....
- 取1 mL SARS-CoV-2样本送至BSL-2实验室，于65 °C加热灭活30分钟。
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结果
在一项概念验证研究中，多重检测方法的分析性能在临床和科研样本上进行了测试19。多重检测方法的性能优于RT-PCR19。由于液滴数量过少可能提示液滴生成过程中存在问题，本文根据实证数据设定每孔液滴数的阈值为10,000个。
阳性与阴性液滴之间良好的分离效果，且极少受到拖尾干扰，有助于数据分析。因此，在一个成功的实验中，检测方法的优化至关重要19如温度梯度分析结果所示 图 2D，高退火温度（例如， 65 °C无法在双重检测（N（FAM）和RPP30（HEX））中清晰区分阳性液滴与阴性液滴。然而，随着退火温度降低，阳性与阴性液滴之间实现了最佳分离。最佳温度为 57 °C 为最佳。在其他检测中也可观察到这一现象19.
利用双色（FAM/HEX）RT-ddPCR 检测系统，可在单个样本中检.......
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讨论
目前关于如何开发用于SARS-CoV-2检测的RT-ddPCR检测方法的资源较少。尽管本文未使用，但含有已知拷贝数的标准样品可用于检测方法的开发和优化。在本研究中，将SARS-CoV-2样本在Vero-E6细胞中培养后，加入人基因组RNA背景中，作为标准样品用于检测方法的建立。在开发检测方法时，合适的引物和探针序列至关重要。由于大多数关于SARS-CoV-2 RT-ddPCR的初步研究采用了中国疾病预防控制中心（China CDC）针对ORF1ab和N基因设计的引物和探针，因此这些引物和探针被认为适用于本研究7,8,9,10,11。这些引物的分析特异性和灵敏度也已在先前的研究中通过ddPCR进行了比较7。RBD2引物和探针13
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由中华人民共和国国家卫生健康委员会传染病防治重大专项（项目编号：2017ZX10302301-005）和中非联合研究中心（项目编号：SAJC201605）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 32通道全自动核酸提取仪 Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | RNA 自动化提取仪 |
| Probes 用 AutoDG 油 | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG 耗材 |
| ddPCR 96孔板 | BioRad | 12003185 | |
| 探针法 ddPCR 超混合液（不含 dUTP） | BioRad | 1863024 | 制备 ddPCR 检测主混合液 |
| DG32 AutoDG 微滴生成卡盒 | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG 耗材 |
| 电子恒温水浴锅 | 北京长风仪器仪表公司 | XMTD-8000 | 样本热灭活 |
| FineMag 快速磁珠病毒 DNA/RNA 提取试剂盒 | Genfine Biotech | FMY502T5 | 磁珠法提取灭活 RNA 样本 |
| 可穿刺铝箔热封膜 | BioRad | 1814040 | |
| AutoDG 专用吸头 | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG 耗材 |
| AutoDG 吸头废弃盒 | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG 耗材 |
| PrimeScript 逆转录主混合液（完美实时） | TaKaRa | RR036A | cDNA 合成 |
| PX1 PCR 板封膜机 | BioRad | 1814000 | 对 AutoDG 生成的微滴板进行封膜 |
| QuantaSoft 1.7 软件 | BioRad | 10026368 | 数据采集与分析 |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | 数据分析 |
| QX200 自动微滴生成仪（AutoDG） | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG 耗材 |
| QX200 微滴读取仪 | BioRad | 1864003 | 微滴读取与数据采集 |
| T100 梯度PCR仪 | BioRad | 1861096 | 微滴靶标扩增（PCR）与 cDNA 合成 |
参考文献
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
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重印与许可
