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用于SARS-CoV-2检测与定量的两步法逆转录微滴数字PCR方案

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DOI：

10.3791/62295

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2021年3月31日

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1Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Center for Biosafety Mega-Science, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2International College, University of Chinese Academy of Sciences, 3Sino-Africa Joint Research Center, 4CAS Key Laboratory of Molecular Virology & Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, 5Center for Infectious and Parasitic Diseases Control Research, Kenya Medical Research Institute

本文内容

摘要

本工作总结了使用双色数字PCR（ddPCR）系统开发不同SARS-CoV-2检测方法的步骤。这些步骤详尽，并包含了如何改进检测方法和实验性能的说明。这些检测方法可用于多种SARS-CoV-2逆转录-数字PCR（RT-ddPCR）应用。

摘要

诊断当前的 SARS-CoV-2 大流行是全球各国的首要任务。目前，逆转录定量 PCR（RT-qPCR）是 SARS-CoV-2 诊断的金标准，因为尚无永久性解决方案。然而，尽管该技术有效，已有研究指出其在检测和诊断方面存在局限性，尤其是在靶标含量较低的情况下。相比之下，微滴数字 PCR（ddPCR）是一种新兴技术，相较于 qPCR 具有显著优势，已被证明能够克服 RT-qPCR 在低丰度靶标样本中检测 SARS-CoV-2 时所面临的挑战。本文前瞻性地进一步拓展了 RT-ddPCR 的能力，展示了如何利用双色检测系统开发单重、双重、三重探针混合物以及四重检测方法。通过使用靶向 SARS-CoV-2 基因组特定位点（N、ORF1ab、RPP30 和 RBD2）的引物和探针，证明了这些检测方法的可行性。此外，还提供了详细的逐步操作流程、注意事项以及优化检测流程和数据分析的建议。在未来的研究中采用此工作流程，将能够在少量样本中高灵敏度地检测最大数量的靶标，显著降低成本并提高样本通量。

引言

聚合酶链式反应（PCR）是一种广为人知的技术，自问世以来经历了多次变革，发展成为一种能够解答核酸研究问题的强大技术。这些变革是对原有技术的持续改进，可概括为三代1。第一代为常规PCR，依赖凝胶电泳对扩增产物进行检测和定量。第二代为定量实时PCR（qPCR），可实时检测样品，并依赖标准曲线对样本中的目标物进行直接定量。第三代为数字PCR（dPCR），能够在无需标准曲线的情况下实现对核酸目标物的检测和绝对定量。dPCR技术进一步发展，反应腔室从物理孔壁分隔演变为在同一孔内通过油、水和稳定化学物质形成的乳浊液进行分隔，如基于液滴的数字PCR所示2。在液滴数字PCR（ddPCR）中，样本被分割成数千个纳升级别的液滴，每个液滴包含单独的目标分子，随后通过泊松统计学进行定量2,3,4。与前两代PCR技术相比，该技术在定量低丰度目标分子方面具有显著优势。

近年来，多项应用表明，在检测和定量低丰度靶标时，数字滴定PCR（ddPCR）相较于常用的定量PCR（qPCR）具有显著优势1,5,6。SARS-CoV-2的检测也不例外7,8,9,10,11,12。自SARS-CoV-2暴发以来，科研人员一直在多方面努力，寻求高效诊断和检测该病毒的方法。目前的金标准仍然是qPCR13。然而，与RT-qPCR相比，RT-ddPCR在检测环境样本和临床样本中低丰度SARS-CoV-2靶标方面已被证明具有更高的准确性7,8,9,10,11,12。目前已发表的SARS-CoV-2 ddPCR研究大多依赖于单重检测，而少数多重检测则依赖于商业试剂盒。因此，有必要进一步阐明如何开发用于SARS-CoV-2检测的多重RT-ddPCR检测方法。

在合理的检测设计中，多重检测可用于降低成本、提高样本通量，并在少量样本中最大限度地灵敏检测更多靶标。使用数字滴落式PCR（ddPCR）进行多重检测时，必须考虑特定系统能够检测的荧光染料数量。某些ddPCR平台最多支持三个通道，而其他平台仅支持两个通道。因此，在使用双通道进行多重检测时，必须采用不同的策略，包括高阶多重检测方法，以实现对两个以上靶标的检测14,15,16。本研究采用双色ddPCR检测系统，展示开发多种SARS-CoV-2逆转录-数字滴落式PCR（RT-ddPCR）检测方法的步骤，这些方法可适用于不同的科研应用。

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方案

伦理声明
中国科学院武汉病毒研究所（WHIOV）是经中国疾病预防控制中心武汉市批准开展新型冠状病毒（SARS-CoV-2）研究并从临床样本中检测新型冠状病毒感染（COVID-19）的实验室和研究机构之一。使用临床样本开展针对新型冠状病毒感染（COVID-19）新型诊断技术的研究，也已获得中国科学院武汉病毒研究所伦理委员会的批准（批准编号：2020FCA001）。

1. 样品处理流程（图1A）

注意：在整个实验过程中，必须使用独立的房间，并配备专用移液器，分别用于样本处理（提取和保存）、试剂/主混合液的配制与储存、反应混合液的配制（样本加主混合液）以及检测，以避免交叉污染。所开发的检测方法可用于临床样本或科研样本的检测。即使采用安全的实验操作程序，所有样本均应被视为具有传播感染性病原体的潜在风险。样本处理步骤应在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行，并严格遵守BSL-2规范，包括穿戴适当的个人防护装备（PPE）。

  1. 样本灭活
    1. 取1 mL SARS-CoV-2样本送至BSL-2实验室，于65 °C加热灭活30分钟。
      注意：样本可能来自不同来源，因此应确保灭活的样本体积足够，以满足后续RNA提取需求。大多数提取试剂盒仅需最多200 µL的样本量，因此约1 mL的样本体积足以用于灭活。根据实验室自身的标准操作程序（SOP），也可使用表面活性剂、试剂盒或裂解缓冲液进行直接灭活和RNA提取。
    2. 将样本转移至生物安全柜（BSC）中，室温静置10分钟，使潜在气溶胶沉降。若不能立即处理，可将样本在4 °C保存不超过24小时。
      注意：样本保存无需特定容器，可使用灭活过程中所用的离心管或容器。本研究中，大多数样本保存于病毒运输介质（VTM）管或1.5 mL离心管中。
  2. RNA提取
    注意：市面上有多种配备特定操作流程的RNA提取仪器和试剂盒可供直接使用。此处介绍一种按照制造商说明书进行的自动化操作流程。
    1. 取出预装填的96深孔板，轻轻倒置以混匀磁珠。混匀后，在平坦表面上轻摇该板，使附着在孔壁上的试剂和磁珠集中至孔底。
    2. 小心撕去铝箔密封膜，避免震动板体或造成液体溢出。在96孔板的第2行和第8行每孔分别加入20 µL蛋白酶K和200 µL样本。随后，将96孔板放置于32通道全自动核酸提取仪的底座上。
      注意：加样后应在1小时内启动计算机程序。
    3. 将磁棒套插入32通道全自动核酸提取仪的卡槽中，选择程序GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH（快速版本）并运行。
    4. 提取完成后，取出第6行和第12行的核酸样本（每样本约100 µL），转移至洁净无核酸酶的96孔板中。样本可在4 °C保存不超过24小时以备使用，或在-20 °C长期保存。
      注意：建议使用100 µL多通道移液器将样本转移至新的100–200 µL板中，因其可与样本板的列孔直接匹配。
  3. cDNA合成
    注意：对于长期储存的样本，应避免反复冻融。请使用cDNA合成试剂盒，并按照制造商说明书进行cDNA合成。
    1. 在置于冰上或冷却块上的100或200 µL PCR管中，每反应加入2 µL 5x RT预混液（例如Perfect Real Time）、5 µL样本RNA以及3 µL无RNase的ddH2O（总体积10 µL）。
    2. 将PCR管放入已设定程序的热循环仪中，运行以下程序：37 °C 15分钟（逆转录），85 °C 5秒（逆转录酶热失活），4 °C无限期保持。
      ​注意：应立即处理样本，或在4 °C保存不超过24小时以备使用，或在-20 °C保存不超过6个月。

2. 数字PCR检测方法与流程的优化

注意：在读取液滴之前/之后优化检测。根据结果，可在实验的任何阶段进行优化，以获得更佳的结果。以下是优化微滴数字PCR实验时需考虑的一些常见因素。

  1. 验证 ddPCR 引物和探针（表 1）。
    注：ORF1ab 和 N 引物改编自中国疾控中心17，人内源性对照基因（RPP30）引物来自 Lu 等人18，RBD2 引物来自 Nyaruaba 等人13。除 RBD2 外，所有引物和探针均已通过 ddPCR 测试并优化7,8,18。
  2. 运行 ddPCR 检测样本的对照，包括阳性对照（包含全部四个靶标的样本）、无模板对照（NTC；核酸酶-free 水或不含靶标的样本）以及提取/阴性对照（从非感染性培养的人类细胞或健康志愿者 的混合样本中提取的总核酸）。
    注：优先使用已知靶基因拷贝数的标准对照样本。若无标准品，可使用现有样本定义其对照或样本基质。应将对照与检测样本同时运行。
  3. 通过在 PCR 的退火步骤（步骤 3.2）中设置 55 °C 至 65 °C 的温度梯度来优化退火温度（图 2D）。
    注：退火温度优化有助于找到液滴分离最明显（靶标易于识别）且“雨滴”现象最少的最佳温度。获得结果后，可进一步缩小温度范围以实现更佳优化，例如 55 °C 至 60 °C。
  4. 优化引物和探针浓度。如果在检测中未能实现阳性和阴性液滴之间的最佳分离，则可调整引物（300–900 nM）和/或探针（100–400 nM）的浓度。
    注：降低引物/探针浓度会导致靶标液滴信号幅度降低，而增加浓度则会提高信号幅度。这在基于信号幅度的多重检测中可能具有帮助。
  5. 使用标准样本和检测样本（根据需要选择），结合空白限（LoB）、检出限（LoD）、特异性和灵敏度等不同参数，测试分析灵敏度。

3. 数字滴落式PCR工作流程（图1B）及检测方法开发（表2）

注意：与其他数字PCR检测系统类似，该实验流程也包含四个步骤（图1B），分别为反应体系配制、液滴生成、PCR扩增和液滴读取。

  1. 反应体系配制
    注意：所有检测均需在洁净的独立房间内并在生物安全柜（BSC）中进行。遵守标准防护措施，包括使用洁净手套、洁净移液器、无核酸酶水和消毒剂。将试剂分装至独立离心管中，并于 -20 oC 保存，以避免反复冻融。按照表2所示配制检测反应体系。引物和探针的储备液应以100 µM的高浓度储存。工作液可分装为20–40 µM的浓度（用无核酸酶水稀释后储存）。
    1. 所有检测的通用步骤
      注意：在配制检测反应前，根据样本数量计算所需总预混液（mastermix）体积。此处，每种预混液组分的体积均乘以1.05，以补偿可能的移液误差。
      1. 将反应试剂解冻并平衡至室温。短暂涡旋（30 s）以确保均匀混合，然后短暂离心，使管内液体全部沉降至管底。
      2. 根据表2中工作液的具体反应体积，配制每种检测专用的引物-探针（PP）混合液。
      3. 通过混合11 µL（1x）2x ddPCR探针预混液（不含dUTP）、PP混合液（根据检测类型，按表2中工作液所示体积）以及无核酸酶水，配制总体积为每孔19.8 µL的预混液。根据样本数量，将预混液分配至无核酸酶的96孔ddPCR板的各孔中。
        ​注意：对于样本板，确保每一列的8个孔均含有溶液。若仅使用部分孔（例如5个样本），则其余3个孔应各加入22 µL无核酸酶水或对照缓冲液。
      4. 为达到最终反应体系体积 （22 µL），向每孔含预混液的反应体系中加入2.2 µL cDNA样本。使用一次性PCR板封膜密封反应板。
        注意：样本加样应在指定房间内进行。应包括阳性对照、无模板对照（NTC）和提取对照。此外，若RNA样本浓度较低，可相应减少预混液中的水体积，并将样本体积最多增加至5.5 µL。
      5. 完成各孔反应体系分配后，短暂涡旋（15–30 s），并离心（10–15 s）使液体沉降至板底。随后进行微滴生成。
  2. 自动化微滴生成（补充图1）
    注意：可使用不同型号的微滴生成仪；但本研究采用自动化微滴生成仪（AutoDG）。为避免扩增子污染，应确保微滴生成仪和读取仪分别置于独立区域。加载耗材时，建议从仪器后部开始向前部依次加载，避免手部在耗材上方移动，以防交叉污染。
    1. 准备AutoDG所需全部耗材，包括探针用AutoDG油、DG32微滴生成卡盒、移液器吸头、冷却块、样本板、微滴生成板（新的洁净ddPCR板）以及废液桶。
    2. 在AutoDG触摸屏上点击配置样本板，选择样本板上样本所在列，然后点击确定。
      注意：屏幕将变为黄色，提示“LOAD”，表示应在此处加载耗材。
    3. 打开AutoDG门，将耗材放入对应位置。
      注意：各耗材应放置于有黄色指示的位置，正确加载后指示灯将变为绿色。此逻辑与触摸屏显示一致。
    4. 加载样本板和微滴生成板。
      注意：微滴生成板应置于冷却块上。确保冷却块呈紫色（可使用状态），而非粉色（若为粉色，需放回冷冻保存直至恢复紫色）。
    5. 关闭AutoDG门，确认屏幕显示为绿色（表示耗材已加载），在点击开始微滴生成前，选择或确认油类型为 探针用油。
    6. 等待微滴生成完成。当屏幕显示微滴已就绪时，打开门并取出含微滴的反应板。
    7. 使用可穿刺铝膜封板机（设定为185 oC、5 s）密封反应板。随后进行PCR扩增。
      注意：微滴生成后应在30分钟内开始PCR扩增。
  3. PCR扩增
    1. 将密封后的微滴板插入96孔深孔PCR仪，设置样本体积为40 µL，盖温为105 °C。
    2. 采用以下程序进行PCR扩增：95 °C 酶活化10 min；40个循环的变性（94 °C、30 s）和退火/延伸（57 °C、1 min）；98 °C 酶失活10 min；最后在4 °C 无限期保持。PCR结束后立即读取微滴，或于4 °C 保存不超过24小时。
      注意：所有步骤的升降温速率应设为2 °C/s，因不同PCR仪的升降温速率可能存在差异。PCR结束后，应在4 °C 至少保持30分钟，以利于微滴稳定，再进行读取。
  4. 微滴读取
    1. 将完成热循环的96孔板转移至微滴读取仪，并在连接读取仪的计算机上打开配套软件。
    2. 在设置模式下，选择新建，然后双击任意孔以打开孔编辑器对话框。选择待读取的孔，并设置实验类型：ABS，预混液：ddPCR探针预混液（不含dUTP），目标1类型：Ch1未知，目标2类型：Ch2未知。
      注意：对照样本的目标1/2类型可从下拉菜单中选择“阴性”、“空白”、“NTC”或“阳性”。
    3. 根据板布局分配目标或样本名称，点击应用。完成后点击确定，并保存所创建的模板。点击运行，提示时选择正确的荧光通道颜色（FAM/HEX）。
      注意：建议每天首次运行前对系统进行预冲洗。同时检查读取仪所有指示灯是否为绿色，若非绿色，请根据工具提示状态执行推荐操作。
    4. 数据采集完成后，从读取仪中取出反应板。按需分析数据。
      注意：由于初步结果可在屏幕上实时查看，建议将阳性样本置于前几孔，以便进行实时质量控制。

4. 数据分析（补充图 2 和 3）

  1. 检查所有孔的总液滴数量数据。如果液滴数 <10,000，则弃用结果并重复实验。设定阈值以判断阳性与阴性结果。例如，可将3个或以上阳性液滴的液滴数作为阳性结果的判定阈值。
    注：所有实验（包括单重、双重、三重探针混合及四重实验）的数据均由配套软件生成。然而，该软件仅适用于单重和双重实验。对于高重数多重实验（>3个靶标），需要使用外部软件。
  2. 单重和双重实验
    注：外部软件也可用于分析单重和双重实验数据。但对于这些实验，使用配套软件更为简便，因此本文采用配套软件。
    1. 双击要分析的 .qlp 文件以打开，并选择 分析。
    2. 在 1D 振幅 和 2D 振幅 中使用阈值工具，在正确的通道中区分每个孔的阳性与阴性液滴。可参考阴性对照（NTC）和阳性对照样本设置阈值。
      ​注：FAM 结果显示在通道1，HEX/VIC 显示在通道2。
    3. 完成阈值设定后，可将结果导出为 .csv 文件，进一步在 Excel 中分析，或直接在结果窗口读取记录。
  3. 三重探针混合实验（补充图2）和四重实验（补充图2）
    注：在分析三重探针混合实验和四重实验前，请下载外部软件。安装前请参考最低系统要求。
    1. 右键单击 .qlp 文件并选择使用外部软件 打开，或先打开外部软件后点击 浏览 选项以在文件夹中定位 .qlp 文件，也可直接将 .qlp 文件拖拽至已打开的外部软件界面中。
    2. 在“板编辑器”标签页的右侧，选择需要分析的孔。
      1. 对于三重探针混合实验，选择 直接定量（DQ） 作为实验类型，选择 探针混合三重 作为实验信息，并相应输入靶标名称，然后点击 应用。
      2. 对于四重实验，选择 直接定量（DQ） 作为实验类型，选择 振幅多重 作为实验信息，并相应输入靶标名称，然后点击 应用。
    3. 在 2D 振幅标签页左侧，使用 图形工具，根据弹出的 选择以分配簇 窗口提示，为不同靶标簇分配特定颜色。
      注：可根据用户偏好应用首选的簇模式。
    4. 完成靶标颜色分配后，可在右下角的 孔数据窗口 中读取定量数据。使用孔数据表右上角的三横线图标将数据导出至 Excel 或 csv 文件，以便进一步分析。

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结果

在一项概念验证研究中，多重检测方法的分析性能在临床和科研样本上进行了测试19。多重检测方法的性能优于RT-PCR19。由于液滴数量过少可能提示液滴生成过程中存在问题，本文根据实证数据设定每孔液滴数的阈值为10,000个。

阳性与阴性液滴之间良好的分离效果，且极少受到拖尾干扰，有助于数据分析。因此，在一个成功的实验中，检测方法的优化至关重要19如温度梯度分析结果所示 图 2D，高退火温度（例如， 65 °C无法在双重检测（N（FAM）和RPP30（HEX））中清晰区分阳性液滴与阴性液滴。然而，随着退火温度降低，阳性与阴性液滴之间实现了最佳分离。最佳温度为 57 °C 为最佳。在其他检测中也可观察到这一现象19.

利用双色（FAM/HEX）RT-ddPCR 检测系统，可在单个样本中检...

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讨论

目前关于如何开发用于SARS-CoV-2检测的RT-ddPCR检测方法的资源较少。尽管本文未使用，但含有已知拷贝数的标准样品可用于检测方法的开发和优化。在本研究中，将SARS-CoV-2样本在Vero-E6细胞中培养后，加入人基因组RNA背景中，作为标准样品用于检测方法的建立。在开发检测方法时，合适的引物和探针序列至关重要。由于大多数关于SARS-CoV-2 RT-ddPCR的初步研究采用了中国疾病预防控制中心（China CDC）针对ORF1ab和N基因设计的引物和探针，因此这些引物和探针被认为适用于本研究7,8,9,10,11。这些引物的分析特异性和灵敏度也已在先前的研究中通过ddPCR进行了比较7。RBD2引物和探针13

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由中华人民共和国国家卫生健康委员会传染病防治重大专项（项目编号：2017ZX10302301-005）和中非联合研究中心（项目编号：SAJC201605）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
32通道全自动核酸提取仪 Purifier 32Genfine BiotechFHT101-32RNA 自动化提取仪
Probes 用 AutoDG 油BioRad12003017QX200 AutoDG 耗材
ddPCR 96孔板BioRad12003185
探针法 ddPCR 超混合液（不含 dUTP）BioRad1863024制备 ddPCR 检测主混合液
DG32 AutoDG 微滴生成卡盒BioRad1864108QX200 AutoDG 耗材
电子恒温水浴锅北京长风仪器仪表公司XMTD-8000样本热灭活
FineMag 快速磁珠病毒 DNA/RNA 提取试剂盒Genfine BiotechFMY502T5磁珠法提取灭活 RNA 样本
可穿刺铝箔热封膜BioRad1814040
AutoDG 专用吸头BioRad1864120QX200 AutoDG 耗材
AutoDG 吸头废弃盒BioRad1864125QX200 AutoDG 耗材
PrimeScript 逆转录主混合液（完美实时）TaKaRaRR036AcDNA 合成
PX1 PCR 板封膜机BioRad1814000对 AutoDG 生成的微滴板进行封膜
QuantaSoft 1.7 软件BioRad10026368数据采集与分析
QuantaSoft Analysis Pro 1.0BioRadN/A数据分析
QX200 自动微滴生成仪（AutoDG）BioRad1864101QX200 AutoDG 耗材
QX200 微滴读取仪BioRad1864003微滴读取与数据采集
T100 梯度PCR仪BioRad1861096微滴靶标扩增（PCR）与 cDNA 合成

参考文献

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PCR PCR RT ddPCR

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