使用rx3:GFP转基因斑马鱼通过光片显微镜可视化眼部形态发生

Summary

在这里，提供了一种方案，用于使用市售的光照相显微镜和图像处理工作站对眼部形态发生进行延时成像，以分析结果数据。该协议详细说明了胚胎麻醉的程序，嵌入低熔点温度琼脂糖，悬浮在成像室中，设置成像参数，最后使用图像分析软件分析成像数据。

Abstract

脊椎动物的眼睛发育是一个复杂的过程，在胚胎原肠胚形成结束时开始，需要细胞迁移，增殖和分化的精确协调。延时想象为眼睛发育过程中细胞的行为提供了独特的见解，因为它使我们能够可视化体内的动眼发生。斑马鱼是可视化这一过程的绝佳模型，因为它们具有高度保守的脊椎动物眼睛，并且能够在保持光学透明的同时快速和外部发育。使用转基因斑马鱼系Tg（rx3:GFP）极大地促进了斑马鱼眼睛发育的延时成像研究。在发育中的前脑中，rx3:GFP表达标记单眼视野的细胞，并且GFP继续表达为眼场疏散形成视囊泡，然后浸入形成视杯。因此，rx3:GFP表达的高分辨率延时成像使我们能够在眼睛发育到视网膜时跟踪眼睛原基。光片显微镜是随着时间的推移对眼部形态发生进行成像的理想方法，因为它能够穿透较厚的样品进行荧光成像，最大限度地减少光漂白和光毒性，并以高速成像。在这里，提供了一种方案，用于使用市售的光照相显微镜和图像处理工作站对眼部形态发生进行延时成像，以分析结果数据。该协议详细说明了胚胎麻醉的程序，嵌入低熔点温度琼脂糖，悬浮在成像室中，设置成像参数，最后使用图像分析软件分析成像数据。由此产生的数据集可以为眼部形态发生过程提供有价值的见解，以及由于基因突变，暴露于药理学药物或其他实验操作而导致的对这一过程的扰动。

Introduction

胚胎发育是一个复杂的过程，需要精确协调许多不同的事件。脊椎动物眼的形成始于发育中的前脑，其中一部分细胞被指定为眼场。这些细胞将向外胚层表面脱落，产生两个双侧视囊泡^1，2，^{3，4，5，6，7，8，9，10}。然后与表面外胚层接触，诱导视囊泡侵入视杯。表面外胚层将产生眼睛的前部结构，如晶状体和角膜，而视杯将产生神经视网膜和视网膜色素上皮^1，2，^{3，5，6，7，8，9，10，11，12}.该过程的中断可导致先天性缺陷，例如小眼症，眼炎和结肠瘤（MAC）。目前，没有选项来纠正这些缺陷^{3，5，6，7，9，10，11，12}。进一步研究眼部形态发生机制和可能导致MAC的问题将提供可能导致治疗的知识基础。研究眼睛发育过程中细胞动态行为的一个强大工具是延时想象，它允许在体内实时可视化和表征这一过程。

斑马鱼（Danio rerio）是一种使用延时成像可视化早期眼发育的优秀模型。它们具有高度保守的脊椎动物眼睛，并具有快速和外部发育的能力，同时保持光学透明¹。斑马鱼为延时成像提供了很好的资源，因为哺乳动物模型缺乏这些特征。使用转基因斑马鱼系Tg（rx3:GFP）¹³极大地促进了斑马鱼眼睛发育的延时成像研究。Rx3（视网膜同源盒蛋白3）是眼睛发育所必需的转录因子¹⁴。Rx3是斑马鱼中三个rx基因中第一个被表达的，在原肠胚形成中期开始表达，受精后约8小时（hpf）^15，16。rx3:GFP转基因可以在发育中的前脑中可视化，从1 somite阶段（ss）开始，大约10 hpf^{15，17，18，19，20}。在发育中的前脑中，rx3:GFP表达标记单眼视野的细胞，并且GFP（绿色荧光蛋白）通过眼部形态发生的其余部分继续表达。因此，rx3:GFP表达的高分辨率延时成像使我们能够在单眼场发育成视网膜^17，18，20时跟踪它。

斑马鱼发育的延时成像研究主要使用共聚焦或光照片显微镜进行。共聚焦显微镜的优势在于它允许沿z轴对样品进行精确成像并减少荧光背景信号。然而，它受到获取图像所需的时间，样品位置刚性以及其对活样品的光漂白倾向和光毒性的限制。光片显微镜是一种理想的成像眼部形态发生随时间推移的方法，因为它能够穿透较厚的样品进行荧光成像，提高样品取向的灵活性，最小化光漂白和光毒性，并以高速成像^{21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31}.使用当前的光片显微复印系统可实现的空间分辨率约为250-500纳米（nm）。虽然这与共聚焦显微镜获得的相似性没有显着差异，但样品可以从多个角度自由旋转和成像，从而提高成像深度和分辨率，并为体内延时成像实验提供比共聚焦平台更大的灵活性^27，32.由于这些原因，Lightsheet显微镜正迅速成为斑马鱼发育延时成像研究的首选方法。该协议描述了通过使用市售的Lightsheet^显微镜33对Rx3:GFP转基因斑马鱼进行成像来量化眼球发生的步骤，并详细介绍了使用arivis软件平台进行图像分析的管道。

Protocol

所有涉及使用斑马鱼的实验都是根据肯塔基大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的协议进行的。

1. 样品制备

1. 在计划成像的前一天晚上，在门控杂交池中设置一对Tg（Rx3:GFP）斑马鱼的交配。第二天早上，当^34，35号鱼设施的灯亮起时，拉上大门。
   注意:选择的交配鱼应在4个月至2岁之间，并且根据体型和颜色³⁵很容易区分为雄性或雌性。
2. 每半小时检查一次胚胎的杂交，并注意胚胎在交叉罐底部首次可见的时间。将胚胎转移到培养皿中，并将胚胎保持在28.5°C约10小时以发育到1-2 somite阶段（ss）。在1-2 somite阶段（ss）开始成像。
3. 为了筛查体质的存在，在10 hpf的立体镜下观察胚胎，并计算体质的数量¹。
   注意:任何超过单个somite阶段的胚胎都不应用于此实验。
4. 在处于单个体温阶段的胚胎中，使用荧光适配器与立体显微镜结合筛选GFP表达，以确认Rx3:GFP转基因的存在。一旦确定了3-5个GFP阳性个体，使用细镊子将胚胎去皮化，并用玻璃移液器³⁵将它们转移到含有E3胚胎缓冲液的小培养皿中。
5. 通过将胚胎转移到含有0.168mg / mL三卡因（MS222）的0.5mL E3胚胎缓冲液（pH 7）中在微量离心管^35，36中来麻醉胚胎。自发肌肉运动早在17 hpf³⁷就开始了。确保对胚胎进行麻醉，以成像超过此时间点。
6. 将胚胎嵌入1%低熔点温度琼脂糖中，在0.168mg / mL三卡因和E3中。
   注意:这是低熔化温度琼脂糖的最佳浓度，允许胚胎保持在原位，但保持足够的柔韧性，允许胚胎在成像时间过程中生长^30，31。
7. 在E3缓冲液中制备10mL 2%低熔点温度琼脂糖溶液。在微波炉中加热，每隔15秒溶解琼脂糖，以防止溶液沸腾。让溶液足够冷却以保持而不会感到不适，但不要太多以使其固化，并且不会对胚胎造成伤害。一旦琼脂糖足够冷却，在E3中向Tricaine管中的胚胎中加入0.5mL，并轻轻移液溶液和胚胎以混合。
8. 使用1mm玻璃毛细管和聚四氟乙烯（PTFE）柱塞，将琼脂糖溶液中的胚胎拉入毛细管中。确保总共将3-5个胚胎（多个胚胎）拉入毛细管中，以增加拥有良好位置的胚胎的可能性。
   注意:由于胚胎在此时间点的圆形性质，保证毛细管中的特定方向具有挑战性。理想情况下，胚胎的身体将横向定位在毛细管中，从而在显微镜内最容易定位。
9. 让琼脂糖在室温下固化30-60秒。将毛细管置于0.168mg / mL Tricaine的烧杯中E3缓冲液中，直到准备好成像（图1A）。
   注意:过量的2%低熔点温度琼脂糖溶液可以固化，然后在未来的实验中重新加热。
10. 将毛细管放入样品架（图1B-F）中，如步骤2.5中所述。

2. 蔡司光照表Z.1设置

1. 按以下顺序打开显微镜和计算机的每个组件:1）系统，2）PC，然后3）孵育（图2A）。
2. 将20倍成像物镜和10倍照明物镜放入显微镜室中。匹配" 维护 "选项卡下Zen软件界面中的目标设置。
3. 将腔室（图2C）滑入履带上的外壳（图2B），管子朝外。卡套管连接到右侧的相应端口，如图 2E 所示。
4. 使用鲁尔锁定机构将延长线连接到注射器上（图2D）;在E3中用三卡因填充它，并将其放在显微镜³⁵右侧的支架中。使用鲁尔锁定机制将连接到E3中充满Tricaine的注射器上的延伸部分连接到腔室的右下角。推动柱塞，用三卡因/E3缓冲液填充腔室。关上房间的门。
5. 将毛细管与样品一起放入毛细管样品架中。毛细管样品架包括两个橡胶套管、一个金属样品架盘、一个金属杆和一个金属盖（图1B）。单击金属刀鞘进入金属盘的中心（图1C）。将两个橡胶塞放入鞘中，狭缝朝向鞘的末端，然后是毛细管。将毛细管滑过橡胶塞的中间。一旦标记位于金属护套的底部，用金属盖将其固定到位（图1D）。
6. 将毛细管样品架放在显微镜的顶部，白色标记对齐（图1E，F）。合上盖子。
7. 单击软件界面上的 定位毛细管 按钮（图3A）。使用ErgoDrive控制面板（一种控制毛细管方向的手动设备）（图3E）移动毛细管并将其放置在物镜正上方（图3B）。
8. 打开盖子，轻轻推动柱塞，直到含有胚胎的琼脂糖部分悬挂在毛细管底部下方并且位于物镜的前面（图3C）。
9. 关闭 "定位毛细管 "，然后单击" 定位样品 "按钮（图3A）。这将视图从样品室的网络摄像头切换到显微镜物镜（图3D）。使用此视图可以更精确地调整样品的位置。关闭 定位样品 （图3A）。
10. 切换到" 采集 "选项卡。选中 Z 堆栈 和 时间序列的框。
11. 在 "采集模式 参数"窗口中，选择" 双面光照表 "设置，然后选中" 在线双面融合 "和 "透视扫描"框。
12. 在 通道 窗口中，选择 488通道，将激光功率设置为1，曝光时间设置为7.5毫秒。
13. 接下来，单击" 连续 "按钮以获取胚胎的实时视图。使用ErgoDrive控制面板调整胚胎的位置，直到眼场直接面向相机。继续在通道参数中调整左右光照表，直到眼场充分聚焦。
14. 使用 ErgoDrive 控制面板设置 Z-Stack 参数以在 Z 平面中移动。将第一个和最后一个 Z 位置设置为比最后一个可检测荧光信号高 500 μm 左右。这为眼场留出了空间，因为胚胎在整个延时成像过程中生长。设置 Z-Stack 的范围后，单击 "最佳 "按钮将步长设置为 0.477 μm，这是最佳设置。
15. 通过选中帕尔贴单元的框来设置 孵育 参数，以将温度保持在28°C。 在 时间序列 窗口中，选择采集图像的频率和时间间隔。在该协议中，参数设置为每5分钟成像一次，总共166个间隔。
16. 点击 开始实验 按钮。选择要保存图像集的文件夹。设置映像前缀并点击 "保存" 以开始映像。
    注意:显微镜现在将以指定的间隔穿过每个图像集。
17. 延时成像过程完成后，将载物台发送到加载位置，并取下毛细管样品架。按照与组装顺序相反的顺序拆开毛细管样品架，并使用柱塞从毛细管中除去样品和多余的琼脂糖。打开腔室门。使用注射器从腔室中取出腔室液体，断开并取出腔室，然后用水冲洗并风干。

3. 图像分析

1. 打开阿里维斯Vision4D软件程序。
2. 单击" 文件"，然后选择" 导入文件"。从延时成像会话中选择所有 .czi 文件并打开。下一个窗口打开，其中包含有关如何导入文件的选项;选择 Z 堆栈作为帧 ，以按获得的顺序对 z 堆栈进行排序。导入文件后，软件将另存为单个 .sis 文件。要指定要保存的文件的位置，请在单击" 导入"之前选择文件夹。
3. 导入文件后，arivis 现在已准备好渲染延时图像的视频。单击左下角的 4D 查看器立方体和比例尺图标（图 4D-E）。单击视频图标，将情节提要任务栏置于屏幕底部（图 4C）。
4. 在 情节提要 任务栏中，选择" 添加关键帧序列 "（图 4F）。指定视频的持续时间（以秒为单位），取消选中 创建旋转 框，然后选中 使用时间进度 以在视频中包含特定时间点。该软件将这些参数显示在 情节提要 任务栏的右侧，以便随时进行任何调整。保存序列图像板以将相同的参数应用于多个图像集（图 4F）。
5. 单击" 导出影片 "以保存延时成像的视频（图4F）。指定影片导出设置，包括文件名和位置、视频格式（.mp4）、视频分辨率 （1，080 p）、帧速率 （60 FPS） 和数据分辨率 （1，297 x 1，297 x 784）。如果需要，请在此处添加时间戳。设置这些参数后，选择 "记录 "（图 4F）。
6. 步骤3.4和3.5可以通过修改步骤3.4重复，以在特定时间点创建旋转视频。将关键帧序列添加到情节提要时，请选中 创建旋转 框，然后取消选中 使用时间进度。然后，按照步骤 3.5 中的相同说明进行操作。
7. 要在任何单个时间点以任何方向渲染高分辨率图像，请在 4D 查看器中选择 "相机 "图标以获得高分辨率图像（图 4C）。
8. 要构建用于分析的管道，请选择 Flask 图标以访问" 分析 "面板（图 4B）。在 "分析 "面板中，单击" 分析操作 "下拉菜单。例如，该协议在下面演示了体积分析管道的操作顺序。分别运行或撤消管道的每个步骤以微调每个参数（表 1）。
9. 单击管道顶部的蓝色三角形以允许管道运行。
   注意:这将需要一些时间，具体取决于计算机的速度。优化管道后，可以轻松将管道导出和导入到 arivis，并在批处理分析中应用于多个数据集。
10. 要访问批处理分析，请单击" 分析 "选项卡下的"批处理 分析 "。
11. 管道运行后，将拉出一个窗口，其中包含找到的所有对象。通过 表 图标手动访问此图标（图4B）。在此窗口的顶部，单击标记为" 特征列" 的框以提取可提供有关感兴趣对象的信息的特征列表。对于眼场体积分析，这些特征包括表面积、体积（体积、体素计数）、强度 #1（平均值）、属性（ID、类型）和时间点（第一）。单击" 导出 "将数据导出到电子表格。

Results

此处显示的数据集是使用上述协议进行成像的。从1 somite阶段（ss）到24 hpf对Tg（Rx3:GFP）胚胎进行成像，总时间段为14小时，并以5分钟的间隔获取图像。延时成像允许轻松选择和比较显示感兴趣表型的任何时间点。图5显示了一组高分辨率图像，这些图像是在选定的发育时间点从背侧有利位置渲染的。在arivis Vision4D中运行的管道构建了一个掩模，该掩模代表由荧光信号识别的发育中的眼睛。在图5和视频1-6中，与发育中的眼睛的荧光渲染相比，可以可视化该面罩。此外，表2显示了每个成像点的显影眼的体积数据。该数据集包括片段名称、id、μm³ 和体素计数中的体积、物体的平均荧光强度、识别物体的时间点以及物体的表面积（以 μm² 为单位）。重要的是要注意，当眼场分离成两个视囊泡时（从时间点64开始），前脑中仍然存在第三个区域Rx3:GFP阳性，这将有助于下丘脑^38，39，40（图5D-M）。这显示在表2中表示的体积数据中（从时间点71开始以黄色突出显示），并且可以很容易地从视囊泡中分离出来，因为它的体积比任一光学囊泡小得多。

图1:样品制备。 （A）胚胎在玻璃毛细管中的定位。箭头指向毛细血管中的胚胎。（B）玻璃毛细管和毛细管支架部件。（C） 部分组装的毛细管支架。（D） 完全组装的毛细管支架。（E） 灯板安装室。箭头表示用于定向毛细管支架的白线。（F） 毛细管支架正确安装在灯罩中。箭头显示匹配的白线，指示毛细管支架的正确方向。 请点击此处查看此图的大图。

图 2:光照表成像设置。 （A） 用于打开光照表、计算机和孵化单元的切换板。数字表示操作的顺序。（B） 光片物镜室。（C） 成像室。（D）将连接到成像室的注射器和管道。（E）成像室正确定位在物镜室内，所有管子都连接到右侧的适当端口。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:样品定位。 （A） 在 Zen 软件中 定位毛细管 和 定位样品 按钮，如箭头所示。（B）在玻璃毛细管上的定位。箭头表示位于物镜正上方的玻璃毛细管边缘。（C）胚胎悬浮液超出玻璃毛细管。箭头表示胚胎悬浮在物镜前玻璃毛细管下方的琼脂糖中。（D）通过目标观察胚胎。（E） 尔格驱动器控制面板。 请点击此处查看此图的大图。

图 4:用于导航 arivis Vison4D 的重要图标。 每个面板都具有从左到右标识的图标功能。（A）打开，保存，关闭。（B） 分析面板、显示对象表、打开轨道编辑器。（C） 将当前查看器内容作为图像复制到剪贴板、切换书签、为当前视图创建高分辨率图像、切换情节提要。（D） 显示测量框、显示方向交叉、显示图例、显示比例尺。 （E） 显示为 2D 查看器、显示为库查看器、显示为 4D 查看器、显示为信息查看器、显示为投影查看器。 F）刷新所有关键帧，添加关键帧，添加关键帧序列，插入关键帧，删除所有关键帧，导出电影，加载情节提要，保存情节提要，调整整个电影的目标时间，第一个关键帧，播放，暂停，停止，最后一个关键帧。 请点击此处查看此图的大图。

图5:高分辨率图像和眼场掩模（A-M）从背侧有利位置渲染的一组高分辨率图像;（A'-M'） 每个相应时间点的眼场遮罩。每个图像集都按从成像开始获取的时间以及受精后数小时（ss）或受精后小时数（hpf）的相应发育阶段进行标记。请点击此处查看此图的大图。

视频1:Tg（rx3:GFP）斑马鱼胚胎的延时视频，来自1 ss-24 hpf。请右键单击此处下载视频（将链接另存为）。

视频2:Tg（rx3:GFP）斑马鱼胚胎的延时视频，来自1 ss-24 hpf，其眼场由arivis Vision4D管道识别。请右键单击此处下载视频（将链接另存为）。 

视频3:Tg（rx3:GFP）斑马鱼胚胎在1 ss处360°旋转。 请右键单击此处下载视频（将链接另存为）。

视频4:Tg（rx3:GFP）斑马鱼胚胎眼场面罩在1秒内360°旋转。 请右键单击此处下载视频（将链接另存为）。

视频5:Tg（rx3:GFP）斑马鱼胚胎以24 hpf的360°旋转。 请右键单击此处下载视频（将链接另存为）。

视频 6:Tg（rx3:GFP） 斑马鱼胚胎眼场面罩以 24 hpf 旋转 360°。 请右键单击此处下载视频（将链接另存为）。

表 1:用于发育眼场体积分析的 arivis Vision4D 管道。请按此下载此表格。

表2:arivis Vision4D获得的发育眼场的体积和表面积。与推定下丘脑有关的行以黄色突出显示，以将其与视囊泡区分开来。请按此下载此表格。

Discussion

在该协议中，使用Lightsheet显微镜对眼睛发育进行延时成像，并对结果数据进行分析。由此产生的数据集可以为眼部形态发生过程提供有价值的见解，以及由于基因突变，暴露于药理学药物或其他实验参数而导致的对这一过程的扰动。在这里，该协议演示了如何获得该数据集，并提供了如何通过早期开发分析眼场体积的示例。发现这些数据在生物重复中是可重复的和一致的（体积变化小于10%），请记住，在运行开始之前胚胎分期的微小差异可能导致最终体积测量的一些变化。

在将胚胎初始定位在毛细血管中以及将嵌入的胚胎定位在目标前时应小心。取向在防止胚胎生长和移出目标视图方面起着重要作用。胚胎具有10 hpf的圆形形状，这使得保证毛细血管中的特定取向具有挑战性。理想情况下，胚胎的身体将横向定位在毛细血管中。在毛细血管中加载多个胚胎将增加拥有良好位置的胚胎的可能性。

在此过程中，胚胎嵌入琼脂糖中，以将其悬浮在成像和照明物镜的前面。选择正确浓度的低熔点温度琼脂糖至关重要。浓度过高会收缩胚胎并阻止其正常发育;浓度太低会导致琼脂糖分崩离析，无法容纳胚胎。该方案的最佳浓度是终浓度为1%低熔点温度琼脂糖^30，31。

应该考虑的另一个因素是饱和度。随着眼场的生长和分化，Rx3:GFP信号的强度增强。因此，在设置初始成像参数时，应降低曝光和激光功率以使图像饱和度不足。这将防止图像变得过饱和，因为Rx3:GFP随着时间的推移变得越来越亮。可以进行修改以校正图像处理中的饱和度不足，但在获取图像后无法校正过饱和度。

可以对此协议进行一些其他修改，这些修改可能对本文未描述的某些项目有利。例如，可以在图像采集设置中设置多视图成像。该参数将允许在每个时间间隔内按顺序成像沿y轴不同位置的多个胚胎。在增加数据集复杂性的同时，这将提高数据收集率。此外，在图像处理方面，可以通过其他参数量化眼场。在这里，我们描述了如何根据眼场体积量化数据。或者，可以制作管道来量化和跟踪单个细胞或确定光学囊泡规避的速率。

如前所述，共聚焦和光片显微镜都用于对斑马鱼进行延时成像研究。该项目特别选择了Lightsheet，因为它具有通过厚（>1 mm）样品成像的卓越能力，因为它配备了一个孵化单元来维持斑马鱼胚胎的理想温度环境，并且因为它能够以比共聚焦显微镜更快的速度成像，从而可以在该方案所需的许多时间间隔内进行图像采集，而不会伴随胚胎²¹的损坏或光漂白^{，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31}.同样重要的是要注意，Lightsheet显微镜能够对来自多个荧光团的信号进行成像。本研究中使用的Lightsheet显微镜具有405，445，488，515，561和638nm的固态激光激发谱线，可用于对表达多个荧光报告基因的转基因胚胎进行成像。

虽然该协议详细说明了使用Lightsheet Z.1双照明显微镜系统和arivis Vision4D分析软件进行图像采集分析的说明，但徕卡，奥林巴斯和Luxendo制造的其他商用光片显微镜以及Imaris的图像分析软件可用于获得类似的结果。该协议的设备和软件的选择取决于我们机构的可用性。

总之，预计该协议将为使用Lightsheet显微镜进行延时成像以及斑马鱼早期眼睛发育的图像量化提供坚实的起点。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
60mL 注射器 Luer-Lok 尖端	BD	309653
琼脂糖，低熔点	Promega	V2111
arivis Vision4D 软件	arivis	https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d
Dumoxel N3C 镊子	Dumont	0203-N3C-PO
E3 鱼缓冲液（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4）
玻璃毛细管 –尺寸 2 （~1mm）	蔡司	黑色/701904
海德堡延长线 100cm	B. Braun	4097262
Light &滤镜集 –皇家蓝	Night Sea	SFA-LFS-RB
培养皿 （100 x 15 mm）	VWR	25384-302
立体显微镜荧光适配器	NightSea
特氟龙尖柱塞 –尺寸 2	蔡司	#701997
Tg（rx3：GFP） 斑马鱼		这条线是由 Rembold 等人建立的13
Tricaine （MS222）	Sigma	A-5040
Z.1 光片	Zeiss
Zen Software	蔡	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html