由人多能干细胞定向诱导视网膜类器官

摘要

采用自组织方法，我们开发了一种通过添加COCO显著提高感光细胞生成的方案。

摘要

视网膜细胞移植是一种前景广阔的治疗策略，有望重建退化视网膜的结构，并稳定甚至改善其视觉功能。然而，目前细胞替代疗法的发展仍面临挑战，其中之一是需要一种即用型、高质量且标准化的人类视网膜来源。因此，实验亟需一种简便且稳定的方案。本文中，我们开发了一种优化的方案，该方案基于自组织方法，结合外源性分子和试剂A的使用，并辅以人工切除，以生成三维人视网膜类器官（RO）。由人多能干细胞（PSCs）衍生的视网膜类器官表达光感受器特异性标志物。通过添加多功能拮抗剂COCO，光感受器前体细胞及视锥细胞的分化效率显著提高。该系统兼具细胞系与原代细胞的优势，同时避免了原代细胞来源受限的问题，可高效产生融合的视网膜细胞，尤其是光感受器细胞。因此，PSCs向视网膜类器官的分化提供了一个理想且具有生物学相关性的平台，可用于疾病建模、药物筛选以及细胞移植研究。

引言

多能干细胞（PSCs）具有自我更新能力，并能分化为各种体细胞。因此，源自多能干细胞的类器官已成为再生医学研究的重要资源。视网膜变性疾病的特征是感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）以及视网膜色素上皮细胞的丧失，而视网膜细胞替代治疗可能为该疾病带来希望。然而，获取人源视网膜组织用于疾病研究和治疗并不可行。因此，源自多能干细胞的视网膜类器官（ROs）能够有效且成功地模拟多层天然视网膜细胞，对基础研究和转化研究均具有重要意义^1,2,3。本研究聚焦于视网膜类器官的分化，旨在为视网膜变性研究提供充足且高质量的细胞资源⁴。

用于类器官（ROs）分化的技术方法不断涌现，其中三维（3D）悬浮分化技术由Sasai实验室于2012年首次建立⁵。我们在人胚胎干细胞（hESCs）中引入了CRX-tdTomato标记，以特异性追踪光感受器前体细胞，并在原有方法基础上添加了COCO——一种针对Wnt、TGF-β和BMP信号通路的多功能拮抗因子⁶。研究表明，COCO可显著提高光感受器前体细胞及视锥细胞的分化效率^6,7。

通过改进经典分化方法，我们建立了一种简便的方案，可从人类视网膜类器官中大量获取光感受器前体细胞和视锥细胞，用于在实验室研究中分析与光感受器相关的视网膜疾病，并进一步应用于临床治疗或细胞移植。

方案

本研究经首都医科大学附属北京同仁医院机构伦理委员会批准。H9 人胚胎干细胞（hESC）购自 WiCell 研究所，并通过基因工程改造为 tdTomato 标记的细胞系。

1. 人类视网膜类器官的生成

1. 在无饲养层条件下培养 hESC。
   1. 按照生产商说明书，用 1 mL 浓度为 0.1 mg/mL 的试剂 A（材料表）在 37 °C 下对 6 孔板的一个孔进行包被，至少孵育半小时。解冻一份含有 1×10⁶ 个 hESC 的细胞冻存液。
      注意：准备 3 mL 预热的试剂 B（材料表），将冻存细胞（1 mL）转移至 3 mL 新鲜培养基中。不要将 hESC 吹打成单细胞悬液。
   2. 以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   3. 将细胞以 2 mL 试剂 B 接种至经试剂 A 包被的孔板中，每天更换 2 mL 试剂 B。当细胞融合度达到约 80% 时（通常约 4 天）进行传代。
2. 第 0 天
   1. 使用培养基 I（表 1）将 hESC 解离为单细胞悬液。通过混合以下成分配制培养基 I：20%（v/v）KnockOut 血清替代物（KSR）、0.1 mM MEM 非必需氨基酸溶液（NEAA）、1 mM 丙酮酸、3 µM IWR-1-endo（IWR1e）、30 ng/mL COCO、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素（PS）、0.1 mM β-巯基乙醇，以及格拉斯哥鹰氏最低必需培养基（GMEM）。
      注意：在开始解离前，准备培养基 I，并将含 20 µM Y-27632 的 12 mL 培养基 I 转移至一个 10 cm 培养皿中，另将含 0.05 mg/mL 试剂 D（材料表）和 20 µM Y-27632 的 500 µL 试剂 C（材料表）加入一个 1.5 mL 离心管中。上述操作需在避光条件下进行，因为培养基 I 中的组分 IWR1e 对光敏感。
   2. 用预热的 1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤 hESC。
   3. 加入已准备好的 500 µL 试剂（置于 1.5 mL 管中），在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 hESC 3.5 分钟。
   4. 轻敲培养板侧壁和底部数秒使细胞脱落，然后从培养皿中取出 500 µL 已准备的培养基 I 加入 hESC 培养板中。
      注意：准备一个含 900 µL 1×DPBS 的 1.5 mL 管，使用血细胞计数板进行细胞计数。
   5. 将细胞收集至一个新的 1.5 mL 管中，上下吹打细胞悬液，然后从中取出 100 µL，加入含 900 µL DPBS 的计数管中用于细胞计数。
   6. 将剩余的 900 µL 细胞悬液分散，并用培养皿中已准备的培养基 I 稀释至 9×10⁴ 个细胞/mL。
      注意：总体积为 12 mL；共需 1.08×10⁶ 个细胞。
   7. 将 100 µL 细胞悬液加入非黏附性 V 型底 96 孔板（材料表）的每孔中。
      注意：使用多通道移液器以缩短操作时间，并确保每孔含有相等数量的细胞。每次取 100 µL 前需轻轻摇晃培养皿。确保细胞均匀分布至关重要。
   8. 将 96 孔板在低速振荡器上轻柔离心 5 分钟，然后在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育。
      注意：将培养板置于避光环境中。将该日记为第 0 天。
3. 第 2 天
   1. 加入 1% 试剂 A（材料表）。通过将 133.4 µL 试剂 A 加入 2 mL 培养基 I 中配制试剂 A（蛋白浓度为 10 mg/mL）。
      注意：使用前需将试剂 A 在 4 °C 下过夜保存，以确保完全且均匀融化。请注意产品信息，并在公司官网查询目录号和批号，以确认每瓶试剂 A 的蛋白浓度，因为不同批次的蛋白浓度可能不同。若蛋白浓度较低，可适当增加试剂 A 的体积。
   2. 向每孔加入 20 µL 已配制的试剂 A，并在孔中央吹打两次以分散死细胞。
      注意：操作过程中需保持试剂 A 和 96 孔板处于低温环境，所有步骤均需在冰上完成。将培养板置于避光环境中。
4. 第 2–12 天
   1. 清洁 96 孔板底部，在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下继续孵育至第 6 天。第 6 天时，通过从每孔中移除 58 µL 培养基并加入 60 µL 培养基 I，更换一半培养基。
      注意：使用多通道移液器完成半量换液操作。操作需轻柔，确保不将细胞团块从孔中移除。将吸出的培养基转移至一个洁净的 10 cm 培养皿中。若其中有细胞团块，应将其重新加回 96 孔板中。
5. 第 12–18 天
   1. 第 12 天将培养基更换为培养基 II（表 1）。通过以下成分配制含 1%（v/v）试剂 A 的培养基 II：10% 胎牛血清（FBS）、0.1 mM NEAA、1 mM 丙酮酸、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、0.1 mM β-巯基乙醇、100 nM SAG 二盐酸盐以及 GMEM。储存于低温避光环境中。
   2. 从 96 孔板中收集细胞团块至一个 15 mL 圆锥形离心管中，在室温下静置 5 分钟使其自然沉降。
      注意：轻柔地从液面下移除上清液和团块，避免产生气泡。
   3. 小心处理类器官的同时移除上清液。将细胞聚集体转移至含 18 mL 已配制培养基 II 和试剂 A 的 10 cm 悬浮培养皿中。
      注意：不要提前将已配制的培养基 II 加入 10 cm 培养皿中，因为试剂 A 应保持在 4 °C。
   4. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下继续孵育至第 18 天。
6. 第 18 天及以后
   1. 将培养基更换为培养基 III（表 1）。在避光条件下配制培养基 III，混合以下成分：10% FBS、1×补充剂 1、0.5 µM 视黄酸（RA）、100 µM 牛磺酸、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素，以及 1:1 混合的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）/营养混合物 F-12。
   2. 第 18 天，当半透明的视泡结构形成后，使用显微外科刀切割类器官。
      注意：通常在含培养基 II 的培养皿中将类器官切割为四块。每一块将在接下来的数周内发育为一个完整的视杯结构。
   3. 将所有团块聚集至培养皿中央。将细胞收集至一个 15 mL 圆锥形离心管中，静置自然沉降，然后轻柔移除上清液。
      ​注意：由于类器官尺寸较大，可通过在水平面上单向旋转培养皿约 90° 数次，使其聚集至中央。
   4. 将团块悬浮并分散至两个 10 cm 培养皿中，每皿加入 18 mL 培养基 III，轻柔转移至培养箱中以避免细胞聚集。继续在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下使用培养基 III 培养，并每周更换一次培养基。在第 45 天至第 120 天之间可检测到 CRX 的表达，以及光感受器外节段的形成。

2. 分析人类类器官

1. 流式细胞分析
   1. 使用剪切过的1 mL枪头从培养皿中收集三个CRX-tdTomato和三个H9 ES来源的类器官。用1 mL预温（室温）的DPBS洗涤类器官。
   2. 通过将0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液与0.05 mg/mL试剂D混合，制备消化缓冲液。
   3. 使用制备好的消化缓冲液在37 °C下消化8分钟，将类器官解离为单细胞。然后加入等体积含10% FBS和0.05 mg/mL试剂D的DPBS以终止反应。
   4. 轻轻重悬并分散细胞，随后使用100 µm细胞筛过滤，并使用荧光激活细胞分选（FACS）系统在561 nm激发激光线和780/60滤光片条件下分析CRX-tdTomato阳性信号。
      注意：CRX在第45天开始表达，并随着类器官的成熟而增加。每次时间点每个样本检测一万个细胞，至少完成三次重复实验。
2. 视网膜类器官荧光强度定量
   1. 随机选取存活良好的类器官进行成像。
      注意：设定参数时，所有荧光强度检测均需使用相同的滤光片和参数设置。
   2. 采集图像，并使用合适的软件（例如ImageJ）分析平均荧光强度。
   3. 导入图像后，通过图像 | 类型将其转换为8位图像。
   4. 通过图像 | 调整 | 阈值使用默认参数调整阈值。
   5. 确定测量区域后，使用分析 | 测量评估灰度值。
      注意：结果面板中的平均值即为所测区域的平均荧光强度。

结果

示意图展示了利用COCO提高前体细胞分化的实验方案（图1）。从PSC到视网膜类器官（ROs）的整个过程中，许多细节因素都可能导致实验结果的差异。建议记录每一步操作，甚至每种培养基的货号和批号，以便全程追踪实验流程。

本文提供了第6、12、18和45天的明场图像（图2）。在第6天，类器官在96孔板中直径通常约为600 µm，内部结构致密，边缘明亮（图2A）。第12天时，开始出现类似视泡的结构（图2B）。从第12天到第18天，视泡样结构清晰可见，并在第18天后继续生长。缺乏此类泡状结构的类器官将被弃用（图2C）。至第30天，泡状结构更加明显，更容易区分背侧和腹侧的视杯类器官（图2D-E）。失去透明结...

讨论

视网膜类器官分化是一种理想的、可大量生成功能性视网膜细胞的方法。视网膜类器官（RO）是由多能干细胞向神经视网膜分化而形成的复合结构，包含多种视网膜细胞，如神经节细胞、双极细胞和光感受器细胞^4,5,8,9。尽管可以收获融合生长的视网膜类器官，但该过程耗时较长，可能需要长达180天的培养周期。然而，在进行光感受器细胞移植或研究锥-杆细胞或杆-锥细胞营养不良时，能够在三维培养系统中获得相对较高比例的光感受器细胞将具有显著优势¹⁰。

在不干扰类器官正常发育过程的前提下，监测其发育进程也具有挑战性。因此，我们选用CRX（锥杆同源盒蛋白）作为目标基因，用于追踪光感受器前体细胞在三维分化过程中的发育轨迹。CRX主要在光感受器前体细胞中表达。利用tdTomato系统，可通过红色荧光对表达CRX的细...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Life Technologies	21985-023
COCO	R&D Systems	3047-CC-050	BMP拮抗剂DAN结构域家族
DMEM/F-12	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
胎牛血清（FBS），适用于人胚胎干细胞	Biological Industry	04-002-1A
GMEM	Gibco	11710-035
KnockOut血清替代物-多物种	Gibco	A3181502
MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）	sigma	M7145
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
Primesurface 96 V-板	Sbio	MS9096SZ	1.2.7步骤中的细胞聚集
丙酮酸钠	Sigma	S8636
试剂A	BD	356231	1.1.1步骤中的Matrigel
试剂B	StemCell	5990	1.1.2步骤中的mTeSR-E8，PSC基础培养基
试剂C	Gibco	12563-011	1.2步骤中的TrypLE Express
试剂D	Roche	11284932001	1.2步骤中的DNase I
视黄酸	Sigma	R2625-100MG
SAG	Enzo Life Science	ALX-270-426-M001
补充剂1	Life Technologies	17502-048	N-2补充剂（100倍浓缩），液体，用于III号培养基
牛磺酸	Sigma	T-8691-25G
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Gibco	25200056	2.1.3步骤中的类器官解离
Wnt拮抗剂I，IWR-1-endo - Calbiochem	Sigma	681669	Wnt抑制剂
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049