由人多能干细胞定向诱导视网膜类器官

摘要

采用自组织方法，我们开发了一种通过添加COCO显著提高感光细胞生成的方案。

摘要

视网膜细胞移植是一种前景广阔的治疗策略，有望重建退化视网膜的结构，并稳定甚至改善其视觉功能。然而，目前细胞替代疗法的发展仍面临挑战，其中之一是需要一种即用型、高质量且标准化的人类视网膜来源。因此，实验亟需一种简便且稳定的方案。本文中，我们开发了一种优化的方案，该方案基于自组织方法，结合外源性分子和试剂A的使用，并辅以人工切除，以生成三维人视网膜类器官（RO）。由人多能干细胞（PSCs）衍生的视网膜类器官表达光感受器特异性标志物。通过添加多功能拮抗剂COCO，光感受器前体细胞及视锥细胞的分化效率显著提高。该系统兼具细胞系与原代细胞的优势，同时避免了原代细胞来源受限的问题，可高效产生融合的视网膜细胞，尤其是光感受器细胞。因此，PSCs向视网膜类器官的分化提供了一个理想且具有生物学相关性的平台，可用于疾病建模、药物筛选以及细胞移植研究。

引言

多能干细胞（PSCs）具有自我更新能力，并能分化为各种体细胞。因此，源自多能干细胞的类器官已成为再生医学研究的重要资源。视网膜变性疾病的特征是感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）以及视网膜色素上皮细胞的丧失，而视网膜细胞替代治疗可能为该疾病带来希望。然而，获取人源视网膜组织用于疾病研究和治疗并不可行。因此，源自多能干细胞的视网膜类器官（ROs）能够有效且成功地模拟多层天然视网膜细胞，对基础研究和转化研究均具有重要意义^1,2,3。本研究聚焦于视网膜类器官的分化，旨在为视网膜变性研究提供充足且高质量的细胞资源⁴。

用于类器官（ROs）分化的技术方法不断涌现，其中三维（3D）悬浮分化技术由Sasai实验室于2012年首次建立⁵。我们在人胚胎干细胞（hESCs）中引入了CRX-tdTomato标记，以特异性追踪光感受器前体细胞，并在原有方法基础上添加了COCO——一种针对Wnt、TGF-β和BMP信号通路的多功能拮抗因子⁶。研究表明，COCO可显著提高光感受器前体细胞及视锥细胞的分化效率^6,

方案

本研究经首都医科大学附属北京同仁医院机构伦理委员会批准。H9 人胚胎干细胞（hESC）购自 WiCell 研究所，并通过基因工程改造为 tdTomato 标记的细胞系。

1. 人类视网膜类器官的生成

1. 在无饲养层条件下培养 hESC。
   1. 按照生产商说明书，用 1 mL 浓度为 0.1 mg/mL 的试剂 A（材料表）在 37 °C 下对 6 孔板的一个孔进行包被，至少孵育半小时。解冻一份含有 1×10⁶ 个 hESC 的细胞冻存液。
      注意：准备 3 mL 预热的试剂 B（材料表），将冻存细胞（1 mL）转移至 3 mL 新鲜培养基中。不要将 hESC 吹打成单细胞悬液。
   2. 以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   3. 将细胞以 2 mL 试剂 B 接种至经试剂 A 包被的孔板中，每天更换 2 mL 试剂 B。当细胞融合度达到约 80% 时（通常约 4 天）进行传代。
2. 第 0 天
   1. 使用培养基 I（表 1）将 hESC 解离为单细胞悬液。通过混合以下成分配制培养基 I：20%（v/v）KnockOut 血清替代物（KSR）、0.1 mM MEM 非必需氨基酸溶液（N....

结果

示意图展示了利用COCO提高前体细胞分化的实验方案（图1）。从PSC到视网膜类器官（ROs）的整个过程中，许多细节因素都可能导致实验结果的差异。建议记录每一步操作，甚至每种培养基的货号和批号，以便全程追踪实验流程。

本文提供了第6、12、18和45天的明场图像（图2）。在第6天，类器官在96孔板中直径通常约为600 µm，内部结构致密，边缘明亮（图2A）。第12天时，开始出现类似视泡的结构（图2B）。从第12天到第18天，视泡样结构清晰可见，并在第18天后继续生长。缺乏此类泡状结构的类器官将被弃用（图2C）。至第30天，泡状结构更加明显，更容易区分背侧和腹侧的视杯类器官（图2D-E）。失去透明结.......

讨论

视网膜类器官分化是一种理想的、可大量生成功能性视网膜细胞的方法。视网膜类器官（RO）是由多能干细胞向神经视网膜分化而形成的复合结构，包含多种视网膜细胞，如神经节细胞、双极细胞和光感受器细胞^4,5,8,9。尽管可以收获融合生长的视网膜类器官，但该过程耗时较长，可能需要长达180天的培养周期。然而，在进行光感受器细胞移植或研究锥-杆细胞或杆-锥细胞营养不良时，能够在三维培养系统中获得相对较高比例的光感受器细胞将具有显著优势¹⁰。

在不干扰类器官正常发育过程的前提下，监测其发育进程也具有挑战性。因此，我们选用CRX（锥杆同源盒蛋白）作为目标基因，用于追踪光感受器前体细胞在三维分化过程中的发育轨迹。CRX主要在光感受器前体细胞中表达。利用tdTomato系统，可通过红色荧光对表达CRX的细.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Life Technologies	21985-023
COCO	R&D Systems	3047-CC-050	BMP拮抗剂DAN结构域家族
DMEM/F-12	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
胎牛血清（FBS），适用于人胚胎干细胞	Biological Industry	04-002-1A
GMEM	Gibco	11710-035
KnockOut血清替代物-多物种	Gibco	A3181502
MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）	sigma	M7145
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
Primesurface 96 V-板	Sbio	MS9096SZ	1.2.7步骤中的细胞聚集
丙酮酸钠	Sigma	S8636
试剂A	BD	356231	1.1.1步骤中的Matrigel
试剂B	StemCell	5990	1.1.2步骤中的mTeSR-E8，PSC基础培养基
试剂C	Gibco	12563-011	1.2步骤中的TrypLE Express
试剂D	Roche	11284932001	1.2步骤中的DNase I
视黄酸	Sigma	R2625-100MG
SAG	Enzo Life Science	ALX-270-426-M001
补充剂1	Life Technologies	17502-048	N-2补充剂（100倍浓缩），液体，用于III号培养基
牛磺酸	Sigma	T-8691-25G
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Gibco	25200056	2.1.3步骤中的类器官解离
Wnt拮抗剂I，IWR-1-endo - Calbiochem	Sigma	681669	Wnt抑制剂
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049