CCCIPK14 基因功能分析阐明高效的根转基因系统

Summary

在这里，我们提出了一种高效稳定的转化系统，用于 CcCIPK14 基因的功能分析，为研究非模式植物的代谢提供了技术依据。

Abstract

高效稳定的转化系统是植物基因功能研究和分子育种的基础。在这里，我们描述了根瘤农杆菌介导的转化系统在木豆上的使用。茎感染携带二元载体的根瘤蚜，7 天后诱导愈伤组织，14 天后诱导不定根。通过形态学分析和 GFP 报告基因鉴定生成的转基因毛根。为了进一步说明该系统的应用范围，使用这种转化方法将 CcCIPK14 （钙调磷酸酶 B 样蛋白相互作用蛋白激酶） 转化到木豆中。分别用茉莉酸 （JA） 和脱落酸 （ABA） 处理转基因植株，以检测 CcCIPK14 是否对这些激素有反应。结果表明:（1） 外源激素可显著上调CcCIPK14 的表达水平，尤其是在 CcCIPK14 过表达 （OE） 植物中;（2） CcCIPK14-OE 品系中金雀异黄素的含量显著高于对照;（3） CcCIPK14-OE 系下游两个关键类黄酮合酶基因 CcHIDH1 和 CcHIDH2 的表达水平上调;（4） 毛状根转基因系统可用于研究非模式植物中的代谢功能基因。

Introduction

转化是评估外源基因表达的基本工具 ^1,2。资源植物的许多生物学方面是所有植物共有的;因此，可以在模式植物（如拟南芥）中进行某些基因的功能研究³。然而，植物中的许多基因在功能和表达模式上都是独一无二的，需要在它们自己或密切相关的物种中进行研究，尤其是资源植物 ^3,4。植物细胞可以感知各种信号，使植物能够表现出基因表达、新陈代谢和生理学的特定变化，以响应不同的环境胁迫条件 ^5,6,7。类黄酮是植物响应环境胁迫的信号传导过程中的关键参与者 ^5,8,9。此外，园艺和药用植物中的黄酮含量也是质量评价的重要指标¹⁰。鉴定响应外部信号而参与调节类黄酮合成的基因对于理解植物类黄酮合成的机制至关重要。多项研究表明，外源激素的应用可以促进类黄酮的积累 ^6,11。稳定的转化系统和基因功能验证方法对于证明基因的功能和了解植物的次生代谢至关重要。

农杆菌介导的转化广泛用于 DNA 插入 ^5,8,9。根癌农杆菌可以将环基因转移到植物细胞的染色体中，外源植物激素诱导单个或几个宿主细胞，这些宿主细胞可以再生植物以获得稳定的转化体 12,13,14。根癌农杆菌介导的转化方法更适用于适合体外作的植物物种，而大多数多年生木本植物由于其再生困难而限制了该方法的应用 ^4,15。根瘤菌还能够修饰宿主细胞的基因组¹⁶。在本研究中，我们开发了一种高效且稳定的 A. rhizogenes 介导的转化程序。A. rhizogenes 除了 Ri 质粒外，还包含第二个二元质粒，该质粒携带非天然基因 T-DNA。寄主植物被感染，可以获得从野生型芽^16,17 中长出转基因毛状根的复合植物。根瘤菌介导的转化系统由于其快速、低成本和不需要的植物再生而适用于木本植物研究。超过 160 种植物已成功诱导毛状根，其中大多数存在于茄科、菊科、十字花科、卷曲科、伞形科、豆科、石竹科和蓼科^18,19。与 A. tumefaciens 相比，A. rhizogenes 在介导的木豆转化中表现出更高的效率^17,20。

本研究以木豆为例，介绍了根茎豌介导的转化过程。从接种到生根，实验持续 5 周。我们通过形态学和 GFP 报告基因鉴定了不定根的转化，转化效率高达 75%。此外，我们用 JA 和 ABA 处理复合植物，并通过定量 real-PCR 和 HPLC （高效液相色谱法） 检测转录物和次生代谢物。证实 CcCIPK14 的表达水平不仅响应 JA 和 ABA，还影响黄酮类化合物的生物合成。该系统适用于研究与次生代谢相关的功能基因。它还提供了一种研究缺乏足够稳定转化系统的非模式植物的新方法 17,21,22。

Protocol

注意:木豆是一种二倍体豆科豆科 作物。本实验中使用的木豆种子来自中国东北林业大学，编码为 87119。该协议的主要步骤如图 1A 所示。幼苗在 25 °C 的高湿度环境中，在荧光灯下以 50 μmol 光子/^{m-2 s-1} 在 16 h 光周期内进行。根 瘤菌 菌株 K599 （NCPPB2659） 保存在实验室中。将它们储存在含 15% 甘油的酵母甘露醇培养基 （YEP） 中，温度为 -80 °C。 这项工作中描述的协议基于 Meng 等人 ²¹ 的协议。

注意: 将所有转基因细菌和植物放入适当的废物容器中。在通风橱中使用所有危险化学品，并将其丢弃在危险废物容器中。

1. 木豆幼苗的制备

1. 选择储存时间少于 1 年的丰满且未受损的木豆种子（图 1A）。
2. 将种子在蒸馏水中浸泡 24 小时（图 1B）。将肿胀的种子转移到种子盘中，然后放入温室中。
3. 种子在 1-2 天后开始发芽。当上胚轴达到 1.5 厘米时，将幼苗以 3:1 的体积比例移植到 10 厘米（直径）x 9 厘米（高）装有土壤和沙子的花盆中。
   注:土壤由营养土壤、蛭石和珍珠岩的混合物组成，比例为 2:1:1。
4. 在温室中种植幼苗。

2. 根瘤蚜的激活

注:用于根瘤菌转化的菌株是在 -80 °C 下保存的 K599。 二进制载体 pROK2 （pBIN438;http://www.biovector.net/product/428388.html） 包含绿色荧光蛋白 （GFP） 作为指示基因和卡那霉素抗性基因作为转化根瘤菌的选择标记。

1. 在冰上解冻 A. rhizogenes 。
2. 将细菌浸入并将它们均匀地排列在补充有 8 g/L 琼脂粉、25 mg/L 利福平和 25 mg/L 卡那霉素（YRK，pH 7.0）的酵母甘露醇培养基 （YEP） 上。
3. 在 28 °C 孵育 16 小时。
4. 选择单克隆菌落。在含有 10 mL YEB 培养基的 50 mL 试管中培养，其中补充有 25 mg/L 利福平和 25 mg/L 卡那霉素 （YRK，pH 7.0）。将离心管放在旋转半径为 10 cm 的振荡培养箱上，在 28 °C 和 200 rpm 下放置 16 小时。

3. 使用 A. rhizogenes 进行植物转化

注意:使用以下注射程序选择健康的植物来感染根瘤菌。这个过程会导致毛状根发生变化。为了分析 CcCIPK14 的基因功能，需要一个对照。将带有空载体或 CcCIPK14-pROK2 质粒的根瘤菌溶液注射到幼苗中以诱导毛状根。

1. 接种根 瘤蚜
   1. 选择生长状态相同的木豆幼苗。
   2. 清空 1 mL 注射器中的空气并吸出 0.3 mL 细菌液体。慢慢推动推杆，使注射器针头中充满细菌液体²¹。
   3. 首先用镊子固定木豆幼苗的茎，然后将注射器针头刺入茎中 1 厘米处。
   4. 取出注射器时，将针尖完全浸入针杆中。慢慢推动推杆，将细菌液体从穿透伤口中抽出。
      注意:残留的细菌液以细菌飞沫的形式附着在伤口上可以提高感染和转化效率。
2. 幼苗管理
   注意:高温高湿可以提高根 瘤菌的感染效率。
   1. 将接种了 根瘤蚜的 幼苗放入装有 1 升水的托盘（30 厘米 x 60 厘米 x 6 厘米）中。使用透明塑料盖 （30 cm x 60 cm x 30 cm） 作为盖子，以保持内部环境的温度和湿度。
   2. 定期清除落叶和附着在叶尖和落叶上的絮状菌丝。
   3. 一周后，伤口开始出现老茧。随后，保持塑料盖半开。
   4. 4-5 周后，大部分愈伤组织分化为不定根。取下塑料盖。
   5. 每 1 天向托盘中加入 3 升水，以保持土壤湿润。
      注意:木豆是一种耐旱植物;过多的水会抑制植物生长。

4. 鉴定转化的毛状根

注意:可以根据形态和基因水平来识别转化的毛状根。该程序主要侧重于报告基因 （GFP） 鉴定测定。

1. 收集毛状根的根尖并标记剩余的部分。
2. 评估在共聚焦激光扫描显微镜下是否有绿色荧光。
3. 在液氮中将 0.1 g 具有强荧光信号的毛状根研磨成细粉。
4. 根据植物基因组 DNA 试剂盒制造商的说明，通过改良的十六烷基三甲基溴化铵 （CTAB） 方法²³ 制备木豆非依赖性转基因系的基因组 DNA。
5. 使用 500 ng 基因组 DNA 模板和引物进行 PCR。引物如 表 1 所示。
6. 执行以下扩增循环:在 94 °C 下预变性 5 分钟，在 94 °C 下变性 30 秒，引物在 55 °C 下退火 30 秒，引物在 72 °C 下延伸 30 秒。在 72 °C 下循环 36 次并最终延长 10 分钟后，在 1% 琼脂糖凝胶上分析扩增产物。
7. 用核酸染色对凝胶进行染色，并在紫外光下观察它们。

5. 外源性激素治疗

注:阳性复合植物用外源激素处理，研究 CcCIPK14 对代谢的影响。将 根瘤蚜 诱导的复合植株分为 3 组:JA 处理组、ABA 处理组和对照组（图 3A）。

1. 外源性激素治疗前 3 天减少浇水。
2. 制备浓度为 5 mg/L 的 JA 和 ABA 溶液。
   注:JA 和 ABA 粉末首先溶于乙醇中，然后用蒸馏水填充至目标体积。
3. 使用喷雾瓶，将 JA 和 ABA 溶液均匀喷洒在植物的叶子上。用水处理对照组。
   注意:平均每棵幼苗喷洒 10 mL 溶液。
4. 喷涂处理后立即盖上塑料盖。把它放回人工气候温室中。

6. 样本采集和保存

注意:外源激素处理 3 小时后，收集不同处理组的植物材料。

1. 去除黄褐色和受污染的毛根，并选择那些外观为白色的根。收集这些毛茸茸的根部，并用吸水纸将它们擦干。
2. 将从每棵幼苗中收集的毛状根分成两部分。将一份放入带编号的试管中，并用标记的锡纸包裹。
3. 在液氮中冻干锡箔，然后将所有收获的锡箔储存在 -80 °C 以供进一步研究。

Results

A. rhizogenes 介导的木豆毛状根转化
本研究描述了根瘤菌介导的毛状根遗传转化的分步方案，这在植物分子领域具有重要意义。从感染了根瘤豌的木豆根部获得毛状根大约需要 5 周的时间。图 1A 显示了整个转化过程的概述，从注射 A. rhizogenes 获得具有毛状根的复合植物。感染后约 1 周观察到增殖组织，约 2 周观察到其分化为不定根，并在 35 天产生大量毛状根（图 1B）。该 GFP 使得通过荧光区分转基因毛状根和非转基因毛状根成为可能。在图 2 中，在共聚焦绿色荧光蛋白通道下可视化了用 GFP-pROK2 转化的毛状根。A. rhizogenes 用空载体诱导毛状根未显示绿色荧光（图 2A...

Discussion

基因功能的快速表征是大多数物种研究的共同目标，对于资源植物的开发尤为重要。A. 根瘤菌介导的转化已广泛用于毛状根培养。毛状根培养物 （HRC） 作为代谢物产生的独特来源，在代谢工程中起着关键作用^18,28。该技术的应用主要限于基因在体内的功能 ²¹。在这里，我们提供了一种基于先前的 A. rhizogenes 介导的转化系统研究基因功能的基本方法。该方法可用于验证多种基因功能，例如对环境压力和外源性激素的反应。CcCIPK14-OE 系显示，CcCIPK14 可促进类黄酮代谢物的积累，并响应外源激素 JA 和 ABA。CcHIDH1 和 CcHIDH2 是两个必需的类黄酮合酶基因，在 CcCIPK14-OE 系中显著上调。这些结果表明，该方法可用作评估基因功能和次生...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mL qPCR 8 联管（带光学盖）	KIRGEN，中国上海	KJ2541
ABA	Solarbio Life Science，中国北京	A8060
琼脂粉	Solarbio Life Science，中国北京	A8190
离心机	Osterode am Harz，德国	d37520
CFX Connect TW 光学模块	Bio-rad，美国	1855200
恒温培养箱	上海博讯实业Commerce Co.， Ltd， 上海，中国	BPX-82
可溶培养皿	康宁，美国
干浴	银杏生物科学公司/郊狼生物科学，中国	H2H3-100C
Eastep 总 RNA 提取试剂盒50	Promega，中国北京	LS1030
电子天平	天津	TD50020
过滤器 纸	杭州沃华滤纸有限公司，中国
FiveEasy Plus	Mettler Toledo，中国上海	30254105
花盆 9*9	中国
晶澳	阳光生命科学，中国北京	J8070
Kan	Solarbio生命科学，中国北京	K8020
MagicSYBR 混合物	CWBIO，中国北京
微型微量离心机	Scilogex，中国北京	S1010E
NaCl	Solarbio Life Science，中国北京	S8210
NanPhotometer N50 Touch	IMPLEN GMBH，德国	T51082
Purelab untra
Rifampicin	Solarbio Life Science，中国北京	R8010
育苗箱 30*200	中国
热能 循环仪 PCR	Bio-rad，美国	T100
恒温振荡器	北京东联哈尔仪器制造有限公司，中国	DLHE-Q200
Tomy 高压灭菌	Tomy，日本	SX-500
胰蛋白胨	Solarbio Life Science，中国北京	LP0042
用于第一链 cDNA 合成（与 dsDN 酶）的 UEIris II RT-PCR 系统（用 dsDNase 合成）美国	光大公司，江苏，中国	R2028
酵母提取物粉末	Solarbio Life Science， Beijing， China	LP0021