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方法文章

评估人类骨骼肌微组织中骨骼肌健康的各项功能指标

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DOI：

10.3791/62307

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2021年2月18日

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 3Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

本文内容

摘要

本文描述了一种详细的方案，用于制备三维人源骨骼肌微组织阵列，并进行微创的下游原位功能检测，包括收缩力和钙处理分析。

摘要

骨骼肌的三维（3D）体外模型是生物医学研究中的重要进展，因其能够在可扩展的体系中研究骨骼肌的重建与功能，并便于进行实验操作。3D肌肉培养系统具有重要价值，可使科研人员在人源细胞背景下对骨骼肌进行离体研究。3D体外 模型能够高度模拟成体骨骼肌组织的天然结构特征。然而，由于目前尚缺乏易于制备、成本低廉、操作简便且能批量生成较大量人源骨骼肌组织的平台，限制了该模型的广泛应用。此外，鉴于骨骼肌在多种疾病状态下其功能会随时间推移而受损，若实验平台本身能够直接进行微创的钙瞬变和收缩力测量，则更适用于微组织研究。本实验方案描述了一种名为“MyoTACTIC”的96孔平台的制备方法，以及人源三维骨骼肌微组织（hMMTs）的规模化生产流程。同时，还介绍了可在该平台上对各微组织进行重复、微创电刺激，并实现骨骼肌收缩力与钙处理能力随时间动态监测的实验方法。

引言

骨骼肌是人体中最丰富的组织之一，支持运动、体温稳态和代谢等关键生理功能1。传统上，动物模型和二维（2D）细胞培养系统被用于研究生物学过程和疾病发病机制，以及测试治疗骨骼肌疾病的药理化合物2,3。尽管动物模型极大地增进了我们对健康和疾病状态下骨骼肌的理解，但其转化应用受到高成本、伦理问题以及物种间差异的限制2,4。在转向基于人类细胞的系统研究骨骼肌时，二维细胞培养因其操作简便而受到青睐。然而，这种模式存在局限性，往往无法重现体内自然发生的细胞-细胞和细胞-细胞外基质之间的相互作用5,6。近年来，三维（3D）骨骼肌模型作为一种强大的替代方案，逐渐取代整体动物模型和传统的二维培养系统，能够在体外模拟具有生理和病理相关性的过程7,8。 确实，已有大量研究报道了在生物人工三维培养体系中构建人类骨骼肌的策略1。这些研究中的一个普遍局限在于，肌肉组织的主动收缩力通常是在将其从培养平台取出并连接至力传感器后进行量化，该方法具有破坏性，因此仅能作为终点检测手段9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21。另一些研究设计了可实现非侵入性测量主动收缩力的培养系统，但并非所有系统都适用于高通量分子筛选应用7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28,29。

本方案详细描述了一种在骨骼肌（Myo）微组织阵列力检测平台（MyoTACTIC）中构建人源肌肉微组织（hMMTs）的方法；该平台是一种96孔板装置，可支持三维骨骼肌微组织的大规模生产30。MyoTACTIC板的制备方法能够在单次浇铸步骤中生成具有96个孔的聚二甲基硅氧烷（PDMS）培养板及其所有相应的孔结构特征，且每个孔仅需相对少量的细胞即可形成微组织。在MyoTACTIC中形成的微组织包含排列有序、具有横纹且多核的肌管，这些结构在装置的不同孔之间具有良好的可重复性；在成熟后，可原位响应化学和电刺激30。本文概述并讨论了从聚氨酯（PU）复制模制备PDMS MyoTACTIC培养板装置的技术、利用永生化人源成肌祖细胞构建hMMTs的优化方法，以及对工程化hMMTs的力学生成能力和钙处理特性的功能评估。

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方案

1. PDMS MyoTACTIC 培养板的制备

注意：PDMS MyoTACTIC 培养板的制备需要一个 PU 阴模，该阴模可按照先前所述方法制备30。MyoTACTIC 培养板设计的计算机辅助设计（CAD）SolidWorks 文件已在 GitHub 上公开（https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file）。

  1. 在一次性塑料杯中，使用硅弹性体试剂盒中的组分，按单体与固化剂1:15的比例配制约110 g的PDMS聚合物溶液。用5 mL一次性移液管搅拌聚合物溶液2-3分钟，直至完全混合均匀。
    警告：避免PDMS聚合物溶液接触皮肤和眼睛，避免吸入。操作液态PDMS混合物时，务必穿戴实验服和一次性手套，并参考安全数据表（SDS）中的具体安全规程。
    注意：为防止PDMS聚合物溶液溢出，应在设备表面（如天平、实验台面等）覆盖一次性防护材料。
  2. 将混合物置于连接标准干式真空泵的台式真空腔中，在室温下脱气约30分钟，或直至所有气泡完全去除。每5-10分钟释放一次真空以促进脱气过程。根据需要，使用一个空的50 mL注射器筒推动空气，吹除聚合物混合物表面残留的气泡。
    注意：可使用一段内径为6.35 mm的管路连接P1250移液枪头与注射器筒，以提高气流速度和准确性。
  3. 在PDMS聚合物溶液脱气的同时，用干燥的纸巾轻轻擦拭PU阴模的边缘和表面，去除残留的PDMS碎片。使用实验室压缩空气（压力设定为70-100 kPag）清除残留的细小颗粒。
    注意：为防止PU阴模受损或积聚颗粒，应将其放入可密封的塑料袋中，并存放于避免实验室人员频繁接触的抽屉内。
  4. 将PU模具置于已用一次性防护材料覆盖的化学通风橱中。将模具水平倾斜约75°，在其活性表面均匀喷涂一层脱模剂。手持喷罐距离模具15-20 cm，以流畅的往复扫动方式自上而下、再从左至右进行喷涂。旋转模具180°后重复喷涂，随后将PU模具静置于化学通风橱中干燥10-15分钟。
    警告：务必在化学通风橱内使用脱模剂，避免接触皮肤和眼睛，并参考安全数据表（SDS）中的具体安全规程。
    注意：脱模剂应形成一层完整覆盖活性表面的薄膜，但过量涂层可能在下一步转移至PDMS，进而对hMMT接种产生不利影响。表面触感应光滑但不湿润。
  5. 将100 g PDMS均匀倒入PU模具中，并放入连接旋片式真空泵的真空腔内。对注满PDMS的模具脱气约45分钟，在前20分钟内每5-10分钟释放一次真空密封以加速脱气过程。持续置于真空腔中，直至PDMS混合物完全无气泡。
    注意：使用旋片式真空泵可实现更低的真空度，从而缩短此步骤所需时间。虽然也可使用台式真空腔和标准干式真空泵进行脱气，但完全去除气泡所需时间更长。关键在于彻底清除PDMS聚合物溶液中的所有气泡，尤其是在将形成hMMT锚定柱的区域。该区域存在气泡会导致锚定柱断裂、培养孔丢失，并可能使一小块PDMS卡在模具中。
  6. 将已脱气并填充PDMS的PU模具转移至65 °C烘箱中，过夜孵育以固化液态橡胶。
  7. 从烘箱中取出已固化的PDMS正模，于室温下冷却至少30分钟。
  8. 使用无刃解剖刀，通过将刀柄背面沿PDMS与模具壁之间缓慢滑动，轻轻将固化的PDMS从PU模具上分离。先从上边缘开始，逐一分离四个侧面，再向下压至模具底部并分离该部分。当刀柄背面可在PDMS与PU模具四壁之间顺畅滑动时，此步骤完成。
    注意：使用无刃解剖刀时应缓慢小心操作，防止PU模具开裂或PDMS撕裂。此步骤应耗时15-20分钟。
  9. 从一端开始，用无刃解剖刀挑起PDMS边缘，并将手指插入固化的PDMS培养板与PU模具之间。然后用双手将手指进一步伸入板下，缓慢地将PDMS板从PU模具中剥离出来。
    注意：操作应缓慢，并用双手均匀剥离，尽量减少弯曲以降低锚定柱断裂的风险。此步骤应耗时5-10分钟。
  10. 使用单边剃须刀片将PDMS板切割成每组6 ± 2个MyoTACTIC孔（图1），用于组织接种。将完整的MyoTACTIC板或板的片段放入器械灭菌袋中，在120 °C和100-140 kPag条件下进行25分钟的干循环高压灭菌（灭菌时间20分钟，干燥时间5分钟）。

2. 永生化人成肌细胞前体细胞的培养

注意：本方案中使用的永生化成肌细胞来自法国巴黎的肌肉研究所（Institut de Myologie）31。

  1. 从液氮罐中取出一支冻存细胞，放入37 °C水浴中快速解冻（不超过1分钟）。细胞以每1 mL冻存液含7.5 × 105个细胞的密度冻存，冻存液由90%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚砜（DMSO）组成。
  2. 将冻存管中的内容物轻柔转移至含有9 mL预热洗涤液的15 mL锥形管中，洗涤液成分为89% DMEM 1×、10% FBS和1%青霉素-链霉素（Pen/Strep），以稀释DMSO。在400 ×g条件下离心10分钟，随后吸除上清液，注意避免扰动细胞沉淀。
  3. 将细胞沉淀用1 mL生长培养基重悬，生长培养基成分为84%骨骼肌细胞基础培养基（含骨骼肌细胞生长添加剂混合物）、15% FBS和1% Pen/Strep，然后转移至含29 mL生长培养基的50 mL锥形管中。
  4. 将约含2.5 × 105个细胞的10 mL细胞悬液转移至一个100 mm × 20 mm细胞培养皿中。用剩余的20 mL细胞悬液重复此步骤。随后将细胞培养皿置于设定为37 °C、5% CO2的加湿细胞培养箱中培养。
  5. 每隔一天更换一次培养基。持续培养细胞至其融合度达到约70%–80%（通常为4–5天），此时细胞可用于接种。每个hMMT的制备需要1.5 × 105个细胞。因此，根据需要传代扩增细胞以获得足够的细胞数量。
    ​注意：永生化成肌祖细胞系在接种至MyoTACTIC孔板、传代或制备冻存细胞前，融合度绝不可超过80%。由融合度超过80%的细胞制备的hMMT通常无法达到收缩成熟状态。传代操作方法与下文第3步所述方法相同。

3. 使用 MyoTACTIC 接种工程化的人源骨骼肌微组织

  1. 准备用于接种人源骨骼肌微组织（hMMT）的 MyoTACTIC 培养孔及试剂。
    注意：本方案提供的是制备 6 个 hMMT 的具体操作细节。
    1. 在细胞接种前 2–3 小时，将一块 6 孔 MyoTACTIC 板放入一个 10 cm 细胞培养皿中。通过向每个孔中加入 100 µL 的 5% Pluronic F-127 溶液，分别对每个 MyoTACTIC 培养孔进行预处理。盖上 10 cm 培养皿的盖子，并用石蜡密封培养皿与盖子之间的缝隙，然后将装有 MyoTACTIC 板部分的 10 cm 培养皿放入配备有板式旋转适配器的离心机中。
      ​注意：若无离心机板式旋转适配器，可用 p20 移液枪头小心地去除柱体后方的气泡，以确保整个培养表面被均匀涂覆。
    2. 以 1,550 × g 离心 1 分钟，以去除培养孔内的所有气泡，尤其是柱体后方的气泡。将含有 Pluronic F-127 溶液的 MyoTACTIC 板部分连同 10 cm 细胞培养皿一起置于 4 °C 冰箱中保存，直至细胞准备就绪用于接种。
      ​注意：Pluronic F-127 涂层处理时间可短至 2 小时，最长可达 24 小时。例如，可在当天结束时将孔中加入 Pluronic F-127 溶液，供次日使用。处理时间不得超过 24 小时，否则将对 hMMT 的重塑产生负面影响，并导致无法形成能够达到收缩成熟状态的健康组织。
    3. 在生物安全柜内的冰上缓慢解冻一份 50 µL 基底膜提取物（basement membrane extract）分装样品和一份 10 µL 凝血酶（thrombin）分装样品（100 U/mL 储存液）。
      ​注意：基底膜提取物分装样品不得再次冷冻，为一次性使用。凝血酶分装样品可重复使用，使用后可重新冷冻，最多可冻融 5 次。
    4. 在 1.5 mL 微量离心管中称取约 7 mg 纤维蛋白原粉末，然后转移至细胞培养罩内。加入 700 µL 的 0.9%（质量/体积）NaCl 水溶液（或生理盐水），配制成终浓度为 10 mg/mL 的溶液。溶解纤维蛋白原时切勿涡旋，而是将离心管置于 37 °C 细胞培养箱中 3–5 分钟。
    5. 取出后轻轻弹击管壁，然后在台式小型离心机（microfuge）中短暂离心，再放回培养罩内。使用配备 0.22 µm 滤器的 1 mL 注射器过滤纤维蛋白原溶液。将溶解后的纤维蛋白原溶液转移至冰上，与基底膜提取物和凝血酶分装样品一同保存。
    6. 最后，准备在组织接种后加入培养孔中的 hMMT 接种培养基。该培养基包含骨骼肌细胞基础培养基，并补充 20% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素（P/S）和 3% 6-氨基己酸（ACA；通过将 50 mg/mL 储存液稀释，获得终浓度为 1.5 mg/mL；% 表示体积比）。使用前将培养基在 37 °C 预热。
  2. 准备用于 hMMT 接种的细胞。
    1. 从细胞培养箱中取出细胞培养板，吸除每块板中的培养基，然后用 D-PBS 洗涤一次，向每块培养板中加入 5 mL D-PBS。随后吸除 D-PBS，并通过向每块培养皿中加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 使细胞脱离。将培养皿放入细胞培养箱中孵育 3 分钟。
    2. 通过向培养皿中加入 3 mL 洗涤培养基（89% 的 1× DMEM + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素）终止胰蛋白酶消化作用。将细胞悬液转移至适当大小的锥形管中，然后以 400 × g 离心 10 分钟使细胞沉淀。吸除上清液时注意避免扰动细胞沉淀。随后用 1 mL 洗涤培养基重悬细胞沉淀。
    3. 在明场显微镜下使用血细胞计数板和台盼蓝染料对细胞进行计数。
      ​若使用多个培养板的细胞，此细胞悬液浓度会非常高。计数前可根据需要稀释细胞悬液。
    4. 由于每个组织需要将 150,000 个细胞重悬于 15 µL 细胞外基质（ECM）混合液中，因此 6 个组织共需 900,000 个细胞和 90 µL ECM 混合液。为补偿在制备过程中因气泡形成或移液损失导致的细胞-ECM 溶液损耗，应额外准备细胞-ECM 混合液（即按 8 个组织计算，共需 1,200,000 个细胞和 120 µL ECM 混合液）。将含有 1,200,000 个细胞的细胞悬液体积转移至新的锥形管中，用洗涤培养基补足至 10 mL，然后以 400 × g 离心 10 分钟。
    5. 在细胞离心过程中，使用以下配方在 1.5 mL 微量离心管中准备 150 µL ECM 混合液：首先加入 60 µL DMEM（占 40% 体积），然后加入 60 µL 10 mg/mL 纤维蛋白原溶液（占 40% 体积），最后加入 30 µL 基底膜提取物（占 20% 体积）。将 ECM 混合液置于冰上保存，直至使用。
      ​注意：处理含有基底膜提取物的溶液时，务必使用预先在 -20 °C 冷却的移液枪头。ECM 混合液中纤维蛋白原终浓度为 4 mg/mL。
  3. 接种 hMMT
    1. 收集含有已离心沉淀细胞的锥形管，吸除上清液，注意避免扰动细胞沉淀。用戴手套的手指用力轻弹管底，使沉淀松动，并持续轻弹直至沉淀呈现为细胞悬浊液。
      ​注意：应尽可能彻底吸除洗涤培养基，以确保细胞-ECM 悬液达到所需稀释度。如有需要，可用移液器吸除残留的洗涤培养基。
    2. 向含有细胞沉淀的管中加入 120 µL ECM 溶液。反复吹打，使细胞在 ECM 中充分重悬，形成单细胞悬液。吹打时应缓慢且小心，避免引入气泡，以免减少有效工作体积。随后将细胞-ECM 溶液置于冰上保存，直至使用。
    3. 从 4 °C 冰箱中取出含有 Pluronic F-127 涂层的 MyoTACTIC 培养孔板部分，将装有 MyoTACTIC 培养孔的 10 cm 培养皿置于细胞培养罩内的冰袋上。
    4. 吸除每个孔中的 Pluronic F-127 溶液。PDMS 材料具有多孔性，会吸收 Pluronic F-127 溶液，尤其是在使用离心机处理后。让孔静置 5 分钟，使残留的 Pluronic F-127 溶液释放并沉降至孔底，然后再次吸除。
      ​注意：吸除 Pluronic F-127 溶液时，应在巴斯德吸管末端连接一个 p1250 枪头，并在 p1250 枪头外再套上一个 p200 枪头。这有助于提高操作精度，防止意外吸除柱体结构。避免用移液枪头刮擦孔底部的椭圆形池状细胞接种区域，以免破坏 Pluronic F-127 涂层，干扰 hMMT 的自组织过程。正确的操作方法是将移液枪头悬停在椭圆形池上方，进行吸液操作。
    5. 小心吹打细胞-ECM 悬液，使可能沉降至管底的细胞重新悬浮。然后将 105 µL 细胞-ECM 悬液转移至一个新的预冷 1.5 mL 离心管中。操作时应尽量握住管体上部，防止溶液温度升高。
    6. 向 105 µL 细胞-ECM 悬液中加入 0.84 µL 的 100 U/mL 凝血酶储存液，使纤维蛋白原的终浓度达到 0.2 U/mg。快速、小心且充分地吹打混合，同时避免引入气泡。
      ​注意：凝血酶会迅速催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白凝块。因此，在加入凝血酶后，必须尽快完成组织接种。为避免在细胞-ECM 混合液转移至培养孔前发生过早凝固，建议在加入凝血酶前将 p20 移液器预设为 15 µL。使用预冷的枪头，或在吸取和转移 15 µL 细胞-ECM 混合液至各孔前，将移液枪头浸入冰冻 DMEM 中数秒。最佳操作实践是每次制备的细胞-ECM 混合液不超过 6 个 hMMT 的用量。
    7. 接种组织时，向每个单独的孔中加入 15 µL 细胞-ECM 混合液（即 150,000 个细胞）。小心地将细胞-ECM 混合液加至椭圆形池的中心，避免将移液枪头压入孔底。然后通过两次轻柔的动作，将细胞悬液均匀涂抹至孔内每个柱体的后方。待细胞-ECM 悬液均匀覆盖整个表面后，再进行下一个孔的操作。
      ​注意：操作应高效，以避免在所有组织接种完成前，细胞-ECM 混合液在管中过早凝胶化。接种过程中必须避免引入气泡，因为气泡会干扰 hMMT 的重塑，导致组织无法使用。
    8. 为装有接种孔的 10 cm 培养板盖上盖子，并转移至 37 °C 组织培养箱中孵育约 5 分钟。
      ​注意：将装有剩余细胞-ECM 混合液的微量离心管一同放入培养箱，以确认凝胶聚合过程是否正常进行。
    9. 待细胞-ECM 混合液完成聚合后，向每个 MyoTACTIC 培养孔中加入 200 µL 预热的 hMMT 接种培养基。盖上 10 cm 培养皿的盖子，并将 10 cm 培养皿中的 MyoTACTIC 板部分放回培养箱。此时间点记为第 -2 天。在进行下一步操作前，不要扰动组织。
  4. 诱导 hMMT 分化
    1. 孵育 2 天后，小心使用移液器吸除 hMMT 接种培养基，并替换为 200 µL 预热的分化培养基。分化培养基包含 2% 马血清、1% 青霉素/链霉素、4% ACA（即由 50 mg/mL 储存液稀释获得终浓度为 2 mg/mL；% 表示体积比）以及 10 µg/mL 人重组胰岛素的 DMEM。此时间点记为分化的第 0 天。
    2. 此后每隔一天更换一半培养基为新鲜分化培养基，直至分化的第 12 天，即培养的最后一天（图 2a）。
      注意：使用原代人成肌细胞制备 hMMT 的详细方案已在其他文献中发表30。若对接种后细胞活力存在疑虑，可使用钙黄绿素和碘化丙啶孵育 hMMT，以定量评估细胞活力。

4. hMMT诱导的偏转后电刺激与分析

  1. 在倒置显微镜上安装透明底的玻璃或塑料载物台，并使用显微镜-相机连接装置将智能手机摄像头固定在显微镜目镜上。采用10倍放大倍数的相差显微镜进行观察（图 3a).
    注意：任何配备10倍物镜的倒置相差显微镜均适用。聚二甲基硅氧烷（PDMS）孔结构将从10 cm培养皿中取出，并直接放置于透明底部的载物台支架上，因此暴露于空气中。实验过程中，所有表面和设备均需用70%乙醇灭菌，并尽量减少操作区域内的人员走动。
  2. 准备电刺激电极时，剪取约30 cm的镀锡铜线。然后从25 G标准斜面针的针座端开始，将约10 cm长的铜线紧密缠绕在针体上 上半部分，留出约20 cm的多余导线。对第二根针重复此操作，然后将每根针的针座切下。
    注意：导线必须紧绕在针头周围，以确保其不会移动，且电极的绕线部分不得接触PDMS，否则可能阻碍电场的产生。
  3. 将BNC转鳄鱼夹连接线连接至波形发生器的输出通道，并将该通道设置为方波脉冲，占空比20%，电压幅度5 V（电场强度10 V/cm）。频率分别设置为0.5 Hz和20 Hz，以诱导单次收缩和强直收缩。
    注意：波形发生器的设置可能需要根据具体实验进行优化
  4. 将含有hMMTs的MyoTACTIC板部分置于显微镜载物台上，轻轻将每个电极的斜面端插入椭圆形池中每根支柱后方的PDMS内。用胶带小心固定显微镜载物台上多余的20 cm导线，使针头保持垂直，并确保每根导线留出约10 cm自由长度用于连接。图 3a).
    警告：切勿将裸露的手指置于电极任一端。确保食指佩戴顶针，以便在将电极插入PDMS时施加轻微压力。
  5. 将显微镜视野对准两个支柱中的其中一个，使电极附近支柱边缘的成像最为清晰。随后，将智能手机相机的对焦锁定在支柱最清晰的区域。此步骤对后续分析至关重要，因为在录制过程中若对焦发生变化，将干扰分析结果。
  6. 将固定好胶带的导线的自由端通过鳄鱼夹连接到波形发生器图 3a).
  7. 在智能手机摄像头上开始视频录制，然后打开通道输出以启动刺激。诱导hMMT进行3次单收缩和3次强直收缩，单收缩与强直收缩序列之间休息2分钟。
  8. 关闭通道输出，将鳄鱼夹从镀锡铜线上取下，移除导线上的胶带，并在将电极插入后续的 hMMT 孔之前，用 70% 乙醇擦拭每个电极。对所有 hMMT 重复步骤 4.5 的操作。
    注意：每次刺激不超过3个组织，以减少hMMTs在培养箱外的暴露时间。若MyoTACTIC板部分中仍有其他hMMTs待分析，需将培养板放回培养箱中孵育10分钟，使hMMTs恢复至37℃ °C.
  9. 为分析偏转后的数据以计算hMMT的力生成，使用已在GitHub上公开的自定义脚本（https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC）。按照README.md中的说明设置并启动脚本，然后打开每个偏转跟踪视频以进行力分析。
  10. 沿需追踪位移的支柱边缘选择一个感兴趣区域（ROI）。按下 进入 以确认感兴趣区域并按下 进入 再次运行脚本（补充视频 1).
    注意：较大的偏转会致使追踪器失效。若在收缩过程中追踪器失效，可通过增大感兴趣区域（ROI）的尺寸来降低追踪的敏感度，从而允许对较大偏转进行追踪。代码中提供了三种尺寸，可通过调整脚本中的注释进行调节。
  11. 该脚本以两个输入要求结束。首先，输入 y 以确认视频中包含多次收缩。其次，输入 y （是）或 n （无）用于将结果导出至 .CSV 文件补充视频 1).
  12. 确保将柱偏转结果报告为每次收缩的像素位移。将像素转换为 µ显微镜10倍放大倍数设置下的微米（μm）值。然后，将位移后数值转换为绝对收缩力（µN) 通过将数值相乘µm）乘以2.36的力-位移转换系数 µN / µm，对应于MyoTACTIC制备中所用PDMS的固化剂与单体1:15的比例30.

5. 使用电刺激进行钙瞬变分析

注意：对于钙处理实验，已使用 MHCK7-GCAMP6 报告基因稳定转导永生化成肌细胞，方法如前所述11,12。转导后的细胞通过 FACS 对 GFP 进行分选以获得阳性细胞群，随后用于构建 hMMT。其他钙成像方法，例如使用比率型染料（如 Fura-2 AM 和 Indo-1）或钙指示剂的荧光寿命成像（例如 Fluo-4 或 Oregon Green BAPTA1），也可能适用于本系统。

  1. 按照步骤4中所述设置显微镜载物台和刺激设备（电极、波形发生器等）。本实验使用4倍物镜。
    注意：需要在暗室中操作，并使用配备CCD相机的落射荧光显微镜。
  2. 启动显微镜成像软件，选择FITC滤光通道（蓝光），并选择录像功能。设置曝光时间为500 ms，分辨率为680 × 510（2×2 binning）。
    注意：成像软件可能有所不同，曝光时间需由用户手动设置。刺激前需注意避免hMMT过度曝光。静息状态下，组织轮廓/阴影较暗并伴有自发荧光属正常现象，而组织图像清晰则提示曝光过度（补充视频2）。确保同一实验中所有hMMT的曝光条件一致。
  3. 关闭显微镜快门，在准备记录钙信号前保持FITC通道关闭。
  4. 当所有设备和软件设置完成后，取出含有待分析hMMT的MyoTACTIC板部分，直接放置于显微镜载物台上。随后按照步骤4中所述插入并连接电极。
  5. 使用明场模式将视野聚焦于目标hMMT的中心位置，然后关闭光源。
  6. 打开显微镜FITC通道快门，确认蓝光已开启，然后在软件中选择录像记录。
  7. 开启波形发生器的输出以启动电刺激，诱导hMMT完成8次单收缩和8次强直收缩。单收缩与强直收缩序列之间间隔2分钟休息时间，期间保持FITC快门关闭。
    注意：电刺激前后各保留10秒的自发活动期，用于记录最低荧光强度，以便后续计算和数据分析。
  8. 关闭通道输出，从镀锡铜线上取下鳄鱼夹，撕去导线上的胶带，并用70%乙醇擦拭每个电极，然后插入下一个hMMT孔中。对所有hMMT重复上述刺激与记录流程。
  9. 将录像保存为TIFF格式文件，用于ImageJ或其他成像软件分析。
    注意：为减少hMMT在培养箱外停留时间，每次刺激不超过3个组织。若MyoTACTIC板中仍有待分析的hMMT，应将装置放回培养箱中孵育10分钟，使hMMT恢复至37 °C。
  10. 分析钙瞬变数据时，首先打开ImageJ软件。依次选择分析、设置测量项，勾选平均灰度值，取消其他所有选项。完成后，打开一段钙信号（.tiff）视频（补充视频2）。
  11. 使用多边形选区工具勾画微组织边界，并将该区域保存为感兴趣区（ROI）（补充视频2）。在ROI管理器窗口中点击更多，选择多测量，对文件中每一帧切片进行荧光强度测量，每帧对应一行数据（补充视频2）。
  12. 将所有测量数据（包括切片编号/帧）复制到电子表格中，使用ΔF/F0 = (Fimmediate - Fminimum)/Fminimum公式，将每帧的荧光强度与文件中的最小自发荧光强度进行比较（补充视频2）。
  13. 通过将录像帧率乘以切片编号（帧）来计算每一帧对应的时间，并绘制hMMT在刺激下的ΔF/F0随时间变化曲线，以表征钙瞬变反应（补充视频2）。
  14. 选取连续6次收缩中的钙瞬变峰值信号，取平均值以计算每个hMMT的相对平均峰值荧光强度变化（补充视频2）。
    注意：总体分析中始终排除第一次单收缩产生的数据。GitHub（https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-）已提供名为“Calcium Handling Template.xlsx”的电子表格模板，以辅助完成hMMT钙瞬变分析。需输入数值的可填写单元格以灰色高亮显示。请注意根据实际情况调整峰值选择的帧编号，该模板仅作为峰值选择的参考指南（补充视频2）。

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结果

本文所述方法包括：使用聚氨酯（PU）模具浇铸基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的96孔MyoTACTIC培养平台，制备人源肌肉微组织（hMMT）复制阵列，并在培养装置内分析hMMT功能的两个方面——力生成和钙处理。图1展示了hMMT接种前MyoTACTIC培养孔制备的示意图。PDMS是一种广泛使用的硅基聚合物，易于 molding 以制造复杂装置32。本研究设计了一种基于PDMS的方案，利用预制的负相PU模具30，可浇铸出任意数量的96孔培养装置。最终固化的PDMS正相板具有柔韧性，可借助单刃剃刀轻松切割为更小尺寸的功能单元（图1）。这使得用户可根据其实验设计中对hMMT复制体的具体需求，灵活调整装置规模。这些较小的功能单元还有助于克服在操作快速聚合的细胞外基质（ECM）支架（如纤维蛋白水凝胶）时的局限性，通过灵活调节孔数以匹配用户的细胞接种速度。此外，PDMS可耐受高压灭菌，且可长期保存。最后，从操作便利性角度，完整的MyoT...

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讨论

本文描述了一种可用于基础肌肉生物学研究、疾病建模或候选分子测试的三维人源肌肉微组织（hMMT）培养模型的构建与分析方法。MyoTACTIC 平台成本低廉、易于制造，且仅需相对少量的细胞即可生成骨骼肌微组织。在 MyoTACTIC 培养平台中形成的 hMMT 包含排列有序、多核且具有横纹的肌管，并能对电刺激产生响应，引发钙瞬变，进而触发收缩（图 2，图 3，图 4）。既往研究表明，hMMT 对生化刺激具有类似的响应能力，并可达到与较大规模的三维骨骼肌模型所报道相当的成熟水平12,30。

在整个 MyoTACTIC 培养板制备和 hMMT 生成过程中，一个关键要点是防止气泡产生，一旦形成则必须彻底清除。为了实现可操作的 PDMS 模具的单步浇铸，已在 Afshar 等人先前描述的 3D 打印塑...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢Mohammad Afshar、Haben Abraha、Mohsen Afshar-Bakooshli和Sadegh Davoudi在MyoTACTIC培养平台的发明以及本文所述制造和分析方法的建立过程中所做出的贡献。HL获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）器官芯片工程与创业培训项目奖学金以及多伦多大学Wildcat研究生奖学金的资助。PMG是内源性修复领域的加拿大研究讲席教授，并获得了安大略再生医学研究所、干细胞网络以及“设计医学”项目（加拿大卓越研究计划之一）对本研究的支持。示意图使用BioRender.com制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠溶液，无菌House Brand1010将溶液配制成 10 mL 的等分试样，于 4°C 保存
25G 针头BD, Medstore, University of Toronto2548-CABD305127
6-氨基己酸，≥99%（滴定法），粉末Sigma - AldrichA2504-100G通过将 5 mg 6-氨基己酸粉末溶解于 100 mL 经高压灭菌的蒸馏水中，制备成 50 mg/mL 的储备液。溶液经真空过滤后，分装为 10 mL 等分试样，于 4°C 保存
6.35 mm 内径管路VWR60985-528
AB1167 成肌细胞系Institut de Myologie (Paris, France)
任意波形发生器RigolDG1022Z
基底膜提取物（Geltrex）Thermo Fisher ScientificA14132-02以 50 µL 或 100 µL 等分试样形式保存于 -80°C
台式真空室Sigma - AldrichD2672
BNC 转鳄鱼夹电缆从 Amazon 购买
细胞培养塑料制品Sarstedt包括培养板、血清移液管等
二甲基亚砜Sigma - AldrichD8418-250ML
不含钙、镁的 DPBS 粉末Thermo Fisher Scientific21600069
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（1X）Gibco11995-065此为含高糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的 DMEM
胎牛血清Fisher Scientific10437028
牛血浆来源纤维蛋白原Sigma - AldrichF8630-5G将 7–10 mg 纤维蛋白原粉末分装为等分试样，于 -20°C 保存
Filtropur 注射器滤器，孔径 0.22 µmSarstedt83.1826.001
马血清Gibco16050-122
人重组胰岛素Sigma - Aldrich91077C储备液为 100X，通过将 1 mg 人重组胰岛素溶解于 1 mL DMEM 和 1 µL 10N NaOH 中制备。溶液经滤过并分装为 1 mL 等分试样，于 4°C 保存
图像采集软件OlympuscellSens Dimension
图像处理软件National Institutes of HealthImageJ
Isotemp 恒温箱Thermo Fisher Scientific201
显微镜OlympusIX83
显微镜-相机连接架LabcamLabcam for iPhone从 Amazon 购买
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Gibco15140-122
一次性塑料注射器，1 ccBD2606-309659
一次性塑料注射器，50 ccBD2612-309653
Pluronic F-127，粉末，BioReagentSigma - AldrichP2443-250G通过将 5 g Pluronic F-127 粉末溶解于 100 mL 冷却的高压灭菌蒸馏水中，制备 5% 储备液。溶液经真空过滤后，分装为 10 mL 等分试样，于 4°C 保存
聚二甲基硅氧烷（Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒）Dow4019862该试剂盒亦可在 Thermo Fisher Scientific、Sigma - Aldrich 等供应商处购买
聚氨酯阴模本实验室自制
脱模剂Mann Release Technologies200
旋片式真空泵EdwardsA65401906
手术刀Almedic, Medstore, University of Toronto2586-M36-0100
单刃剃须刀片VWR55411-050
骨骼肌细胞基础培养基PromocellC-23260制备 30 mL 等分试样，于 4°C 保存
骨骼肌细胞生长培养基（即用型）PromocellC-23060制备 42 mL 等分试样，于 4°C 保存
智能手机（iPhone）AppleSE
标准型干式真空泵Welch2546B-01
灭菌袋Alliance211-SCM2
顶针Igege从 Amazon 购买
人血浆来源凝血酶Sigma - AldrichT6884-250UN将 100 单位凝血酶溶解于 1 mL 0.1% BSA 溶液中。制备 10 µL 等分试样，于 -20°C 保存
镀锡铜线ArcoB8871K48从 Amazon 购买
台盼蓝溶液，0.4%Thermo Scientific15250061
胰蛋白酶-EDTA，0.25%Thermo FIsher Scientific25200072
真空室 2SP Bel-ArtF42027-0000

参考文献

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