本文描述了一种详细的方案，用于制备三维人源骨骼肌微组织阵列，并进行微创的下游原位功能检测，包括收缩力和钙处理分析。
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本文内容
摘要
摘要
骨骼肌的三维（3D）体外模型是生物医学研究中的重要进展，因其能够在可扩展的体系中研究骨骼肌的重建与功能，并便于进行实验操作。3D肌肉培养系统具有重要价值，可使科研人员在人源细胞背景下对骨骼肌进行离体研究。3D体外 模型能够高度模拟成体骨骼肌组织的天然结构特征。然而，由于目前尚缺乏易于制备、成本低廉、操作简便且能批量生成较大量人源骨骼肌组织的平台，限制了该模型的广泛应用。此外，鉴于骨骼肌在多种疾病状态下其功能会随时间推移而受损，若实验平台本身能够直接进行微创的钙瞬变和收缩力测量，则更适用于微组织研究。本实验方案描述了一种名为“MyoTACTIC”的96孔平台的制备方法，以及人源三维骨骼肌微组织（hMMTs）的规模化生产流程。同时，还介绍了可在该平台上对各微组织进行重复、微创电刺激，并实现骨骼肌收缩力与钙处理能力随时间动态监测的实验方法。
引言
骨骼肌是人体中最丰富的组织之一，支持运动、体温稳态和代谢等关键生理功能1。传统上，动物模型和二维（2D）细胞培养系统被用于研究生物学过程和疾病发病机制，以及测试治疗骨骼肌疾病的药理化合物2,3。尽管动物模型极大地增进了我们对健康和疾病状态下骨骼肌的理解，但其转化应用受到高成本、伦理问题以及物种间差异的限制2,4。在转向基于人类细胞的系统研究骨骼肌时，二维细胞培养因其操作简便而受到青睐。然而，这种模式存在局限性，往往无法重现体内自然发生的细胞-细胞和细胞-细胞外基质之间的相互作用5,6。近年来，三维（3D）骨骼肌模型作为一种强大的替代方案，逐渐取代整体动物模型和传统的二维培养系统，能够在体外模拟具有生理和病理相关性的过程7,8。 确实，已有大量研究报道了在生物人工三维培养体系中构建人类骨骼肌的策略1。这些研究中的一个普遍局限在于，肌肉组织的主动收缩力通常是在....
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方案
1. PDMS MyoTACTIC 培养板的制备
注意：PDMS MyoTACTIC 培养板的制备需要一个 PU 阴模，该阴模可按照先前所述方法制备30。MyoTACTIC 培养板设计的计算机辅助设计（CAD）SolidWorks 文件已在 GitHub 上公开（https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file）。
- 在一次性塑料杯中，使用硅弹性体试剂盒中的组分，按单体与固化剂1:15的比例配制约110 g的PDMS聚合物溶液。用5 mL一次性移液管搅拌聚合物溶液2-3分钟，直至完全混合均匀。
警告：避免PDMS聚合物溶液接触皮肤和眼睛，避免吸入。操作液态PDMS混合物时，务必穿戴实验服和一次性手套，并参考安全数据表（SDS）中的具体安全规程。
注意：为防止PDMS聚合物溶液溢出，应在设备表面（如天平、实验台面等）覆盖一次性防护材料。 - 将混合物置于连接标准干式真空泵的台式真空腔中，在室温下脱气约30分钟，或直至所有气泡完全去除。每5-10分钟释放一次真空以促进脱气过程。根据需要，使用一个空的50 mL注射器筒推动空气，吹除聚合物混合物表面残留的气泡。
注意：可使用一段内径为6.35 mm的管路连接P1250移液枪头与注射器筒，以提高气流速度和准确性。
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结果
本文所述方法包括：使用聚氨酯（PU）模具浇铸基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的96孔MyoTACTIC培养平台，制备人源肌肉微组织（hMMT）复制阵列，并在培养装置内分析hMMT功能的两个方面——力生成和钙处理。图1展示了hMMT接种前MyoTACTIC培养孔制备的示意图。PDMS是一种广泛使用的硅基聚合物，易于 molding 以制造复杂装置32。本研究设计了一种基于PDMS的方案，利用预制的负相PU模具30，可浇铸出任意数量的96孔培养装置。最终固化的PDMS正相板具有柔韧性，可借助单刃剃刀轻松切割为更小尺寸的功能单元（图1）。这使得用户可根据其实验设计中对hMMT复制体的具体需求，灵活调整装置规模。这些较小的功能单元还有助于克服在操作快速聚合的细胞外基质（ECM）支架（如纤维蛋白水凝胶）时的局限性，通过灵活调节孔数以匹配用户的细胞接种速度。此外，PDMS可耐受高压灭菌，且可长期保存。最后，从操作便利性角度，完整的MyoT.......
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讨论
本文描述了一种可用于基础肌肉生物学研究、疾病建模或候选分子测试的三维人源肌肉微组织（hMMT）培养模型的构建与分析方法。MyoTACTIC 平台成本低廉、易于制造，且仅需相对少量的细胞即可生成骨骼肌微组织。在 MyoTACTIC 培养平台中形成的 hMMT 包含排列有序、多核且具有横纹的肌管，并能对电刺激产生响应，引发钙瞬变，进而触发收缩（图 2，图 3，图 4）。既往研究表明，hMMT 对生化刺激具有类似的响应能力，并可达到与较大规模的三维骨骼肌模型所报道相当的成熟水平12,30。
在整个 MyoTACTIC 培养板制备和 hMMT 生成过程中，一个关键要点是防止气泡产生，一旦形成则必须彻底清除。为了实现可操作的 PDMS 模具的单步浇铸，已在 Afshar 等人先前描述的 3D 打印塑.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢Mohammad Afshar、Haben Abraha、Mohsen Afshar-Bakooshli和Sadegh Davoudi在MyoTACTIC培养平台的发明以及本文所述制造和分析方法的建立过程中所做出的贡献。HL获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）器官芯片工程与创业培训项目奖学金以及多伦多大学Wildcat研究生奖学金的资助。PMG是内源性修复领域的加拿大研究讲席教授，并获得了安大略再生医学研究所、干细胞网络以及“设计医学”项目（加拿大卓越研究计划之一）对本研究的支持。示意图使用BioRender.com制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 氯化钠溶液，无菌 | House Brand | 1010 | 将溶液配制成 10 mL 的等分试样，于 4°C 保存 |
| 25G 针头 | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-氨基己酸，≥99%（滴定法），粉末 | Sigma - Aldrich | A2504-100G | 通过将 5 mg 6-氨基己酸粉末溶解于 100 mL 经高压灭菌的蒸馏水中，制备成 50 mg/mL 的储备液。溶液经真空过滤后，分装为 10 mL 等分试样，于 4°C 保存 |
| 6.35 mm 内径管路 | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 成肌细胞系 | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| 任意波形发生器 | Rigol | DG1022Z | |
| 基底膜提取物（Geltrex） | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | 以 50 µL 或 100 µL 等分试样形式保存于 -80°C |
| 台式真空室 | Sigma - Aldrich | D2672 | |
| BNC 转鳄鱼夹电缆 | 从 Amazon 购买 | ||
| 细胞培养塑料制品 | Sarstedt | 包括培养板、血清移液管等 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma - Aldrich | D8418-250ML | |
| 不含钙、镁的 DPBS 粉末 | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（1X） | Gibco | 11995-065 | 此为含高糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的 DMEM |
| 胎牛血清 | Fisher Scientific | 10437028 | |
| 牛血浆来源纤维蛋白原 | Sigma - Aldrich | F8630-5G | 将 7–10 mg 纤维蛋白原粉末分装为等分试样，于 -20°C 保存 |
| Filtropur 注射器滤器，孔径 0.22 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| 马血清 | Gibco | 16050-122 | |
| 人重组胰岛素 | Sigma - Aldrich | 91077C | 储备液为 100X，通过将 1 mg 人重组胰岛素溶解于 1 mL DMEM 和 1 µL 10N NaOH 中制备。溶液经滤过并分装为 1 mL 等分试样，于 4°C 保存 |
| 图像采集软件 | Olympus | cellSens Dimension | |
| 图像处理软件 | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp 恒温箱 | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| 显微镜 | Olympus | IX83 | |
| 显微镜-相机连接架 | Labcam | Labcam for iPhone | 从 Amazon 购买 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Gibco | 15140-122 | |
| 一次性塑料注射器，1 cc | BD | 2606-309659 | |
| 一次性塑料注射器，50 cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127，粉末，BioReagent | Sigma - Aldrich | P2443-250G | 通过将 5 g Pluronic F-127 粉末溶解于 100 mL 冷却的高压灭菌蒸馏水中，制备 5% 储备液。溶液经真空过滤后，分装为 10 mL 等分试样，于 4°C 保存 |
| 聚二甲基硅氧烷（Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒） | Dow | 4019862 | 该试剂盒亦可在 Thermo Fisher Scientific、Sigma - Aldrich 等供应商处购买 |
| 聚氨酯阴模 | 本实验室自制 | ||
| 脱模剂 | Mann Release Technologies | 200 | |
| 旋片式真空泵 | Edwards | A65401906 | |
| 手术刀 | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| 单刃剃须刀片 | VWR | 55411-050 | |
| 骨骼肌细胞基础培养基 | Promocell | C-23260 | 制备 30 mL 等分试样，于 4°C 保存 |
| 骨骼肌细胞生长培养基（即用型） | Promocell | C-23060 | 制备 42 mL 等分试样，于 4°C 保存 |
| 智能手机（iPhone） | Apple | SE | |
| 标准型干式真空泵 | Welch | 2546B-01 | |
| 灭菌袋 | Alliance | 211-SCM2 | |
| 顶针 | Igege | 从 Amazon 购买 | |
| 人血浆来源凝血酶 | Sigma - Aldrich | T6884-250UN | 将 100 单位凝血酶溶解于 1 mL 0.1% BSA 溶液中。制备 10 µL 等分试样，于 -20°C 保存 |
| 镀锡铜线 | Arco | B8871K48 | 从 Amazon 购买 |
| 台盼蓝溶液，0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| 胰蛋白酶-EDTA，0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| 真空室 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
参考文献
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular....
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重印与许可
