Method Article

使用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向视网膜细胞群的神经元树化延时成像

DOI:

10.3791/62308

⸱

March 19th, 2021

 , 
1Program for Neuroscience and Mental Health, Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

In This Article

Summary

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在这里，我们提出了一种通过延时共聚焦显微镜研究产后小鼠视网膜外植体中神经突形态发生的方法。我们描述了一种使用重组腺相关病毒载体（以 Cre依赖性方式表达膜靶向荧光蛋白）对视网膜细胞类型及其精细过程进行稀疏标记和获取的方法。

Abstract

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发现树突状乔木的模式需要方法在发育过程中可视化，成像和分析树突。小鼠视网膜是一个强大的模型系统，用于研究神经元形态发生和连接的细胞类型特异性机制。视网膜亚型的组织和组成是明确的，遗传工具可用于在发育过程中访问特定类型。许多视网膜细胞类型也将其树突和/或轴突限制在狭窄的层，这有助于延时成像。小鼠视网膜外植体培养物非常适合使用共聚焦或多光子显微镜进行活细胞成像，但缺乏针对具有时间和结构分辨率的树突动力学成像优化的方法。这里介绍的是一种稀疏地标记和成像由Cre-Lox系统标记的特定视网膜群体发展的方法。这里使用的市售腺相关病毒（AAV）以Cre依赖性方式表达膜靶向荧光蛋白。新生儿小鼠中AAV的眼内递送在注射后4-5天（dpi）产生靶向细胞类型的荧光标记。膜荧光信号可通过共聚焦成像进行检测，并解析精细的分支结构和动力学。从充满含氧人工脑脊液（aCSF）的视网膜平片成像仪获取跨越2-4小时的高质量视频。还提供了用于反卷积和三维（3D）漂移校正的图像后处理管道。该协议可用于捕获完整视网膜中的几种细胞行为，并确定控制神经突起形态的新因素。在视网膜中学到的许多发育策略将与理解中枢神经系统其他地方的神经回路的形成有关。

Introduction

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视网膜神经元的树突形成复杂但特定的模式，影响它们在神经回路中的功能。在脊椎动物视网膜中，不同类型的视网膜神经节细胞（RGC）和柏宁细胞中间神经元具有独特的树突形态，其树突形态在心轴大小、位置、分支长度和密度上有所不同1。在产后发育过程中，RGC和amcrine细胞将旺盛的树突突延伸到称为内丛状层（IPL）的神经瞳孔中，在那里它们接收双极细胞输入，发送光感受器信号2。通过对雏鸡或斑马鱼幼虫中荧光标记的视网膜种群进行延时成像捕获，树突形态发生具有高度动态性3，4，5。在几天内，树突状乔木膨胀，重塑并撞击到IPL的狭窄子层，在那里它们与选定的伙伴突触。乔木在发育过程中表现出不同的结构动力学，分支增加，收缩和稳定的相对速率发生变化。Amacrine和RGC枝晶也表现出不同的生长和重塑行为，这可能反映了特定类型的树木化。然而，这些研究追踪了广泛的amcrine或RGC群体，并专注于层流靶向，这只是形态学的一个方面。

产生在视网膜亚型中观察到的巨大形态多样性的机制知之甚少。该小组的目标是开发一种方法来捕获小鼠中定义的视网膜亚型的树突动力学和乔木重塑。识别树突图案化的细胞类型特异性机制需要可视化和测量目标细胞的....

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Protocol

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注意:该方案跨越2天，实验日之间的病毒转导最短时间为4-5天（图1A）。动物实验是根据加拿大动物护理委员会根据病童医院动物服务实验室动物使用和护理委员会批准的协议进行的，用于研究和实验动物护理。

1. 新生儿AAV注射和成像实验的准备

  1. 选择Cre小鼠线以标记感兴趣的视网膜细胞群。在AAV注射时，通过与Cre转基因报告基因交叉或通过Cre抗体免疫染色来确认Cre重组酶的表达。
  2. 繁殖转基因Cre小鼠（8-16周龄）以产生Cre阳性的新生动物。
    注意:对于此演示，ChAT-IRES-Cre敲入小鼠用于靶向胆碱能星爆amacrine细胞。
  3. 获得编码荧光蛋白的重组酶依赖性AAV病毒。为了对精细过程进行最佳标记，请选择表达靶向质膜的修饰XFP的载体。
    注意:本研究使用了Brainbow病毒（BBV），AAV-EF1a-BbTagBY和AAV9-EF1a-BbChT（见材料表），它们提供了多色标记的选择（图1B）。法呢基化的增强型黄色荧光蛋白（eYFP）和单体樱桃（mCherry）表达为实时成像产生了最强的荧光信号。单个BBV可用于对单个心轴进行成像，而BBV的共同注射可用于标记具有不同荧光团的更多细胞或相邻心轴。如果使用多种荧光蛋白，请确保最小的发射光谱重叠（

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Results

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使用上述协议，采集了星爆细胞枝晶发育的高分辨率3D视频，对其进行了解卷积，并针对3D漂移进行了校正。生成Z平面最大投影以制作用于分析的2D视频（补充视频1， 图5A）。每个时间点的3D反卷积提高了细丝状突起的分辨率（图5B，C）。细丝状突起是视网膜树突发育的特征36 ，在影像学检查过程中应可见。AAV转染将产生细胞标记密度和荧光强度的变异性。因此，筛选标记的组织以选择具有高荧光信号的细胞进行成像并产生高质量的视频。不建议增加激光功率以检测模糊标记的细胞，因为它会导致快速光漂白，并与信号相比引入高噪声。在5 dpi内可以看到足够明亮的细胞。到12 dpi及以上，延长的AAV感染期不一定导致标记细胞的荧光增加（图5D）。

密集细胞标记产生的过多荧光和神经突起会影响图像质量，并可能阻碍单细胞重建。.......

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Discussion

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该视频演示了一个实验管道，该管道利用现有的遗传工具，通过共聚焦实时成像对发育中的视网膜神经元的树突动力学进行成像。还证明了将编码膜靶向荧光蛋白的Cre依赖性AAVs的眼内注射到新生小鼠中。遗传靶向群体的单细胞早在4-5 dpi时就被明确标记。为标准成像室准备视网膜平片支架以执行活细胞共聚焦成像。这种方法可以生成单个细胞及其精细投影的高分辨率延时视频。使用开源软件（包括ImageJ，Vaa3D和ShuTu）提供的反卷积和后处理算法以及Imaris和MBF Bioscience提供的许可软件对小投影进行解析和量化。由于该管道是模块化的，因此可以更改每个方案部分以适应研究目标。下面讨论这些模块化元素，包括:1）Cre-line选择，2）荧光蛋白和病毒构建体的选择，3）基因递送方法，以及4）成像方法。

该技术使用Cre转基因系进行视网膜细胞亚群的遗传访问。Cre必须在产后活跃，并在注射时在整个细胞群中表达，以增加病毒感染和细胞标记的可能性。在本报告中，ChAT-Cre用于靶向星爆amacrine细胞，Vglut2-Cre系用于靶向发育中的RGCs42

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Disclosures

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作者没有任何内容可披露。

Acknowledgements

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我们感谢麦迪逊·格雷（Madison Gray）在我没有帮助的时候帮了我一把。这项研究得到了NSERC发现补助金（RGPIN-2016-06128），斯隆神经科学奖学金和加拿大研究主席Tier 2（J.L.L）的支持。S. Ing-Esteves得到了视觉科学研究计划和NSERC研究生奖学金博士的支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Addgene 病毒制备 #45185-AAV9
Addgene 病毒制备 #45186-AAV9
解剖工具
纤维素滤纸Whatman1001-070
Dumont #5 细镊子FST11252-20视网膜显微解剖需要两把 Dumont #5 镊子
Dumont 镊子VWR82027-426
细剪刀FST14058-09
混合纤维素酯膜 （MCE） 滤纸，亲水性，0.45 µm 孔径MilliporeHABG01 300
培养皿，50 & 15 mmVWR470313-352
聚乙烯一次性移液管VWR470225-034
圆头画笔，尺寸 3/0常规艺术用品商店需要两个尺寸 3/0 的油漆刷（或更小）
14007-14
Vannas 弹簧剪刀 - 2.5 毫米尖端FST15000-08
实时成像孵化系统
室聚乙烯管，PE-160 10'WarnerInstruments64-0755
双通道加热器控制器，型号 TC-344CWarner Instruments64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR 浸渍物镜徕卡15506374
加热器控制器电缆华纳仪器CC-28
带切片支架的大型浴槽培养箱华纳仪器RC-27L
MPII 微型蠕动泵哈佛仪器70-2027
PM-6D 磁加热平台（培养箱加热器）华纳仪器PM-6D
泵头管件，适用于MPII微型蠕动泵佛仪器55-4148
锚（竖琴）华纳仪器64-0260锚必须与孵化室兼容
Sloflo在线溶液加热器纳仪器SF-28
新生儿注射
10 和微型;L 微升注射器系列 700，可拆卸针Hamilton Company80314
30 G 皮下注射针头（0.5 英寸）BD PrecisionGlide305106
4 英寸薄壁玻璃毛细管，无细丝（1.0 毫米外径/0.75 毫米） WPI World Precision InstrumentsTW100-4
乙醇 99.8%（用双蒸水 [ddH2O 稀释至 70%）Sigma-AldrichV001229 
lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF宾夕法尼亚载体核心AV-9-PV2453Addgene 质粒 #45185 
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP
1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF		Penn 载体核心AV-9-PV2454Addgene 质粒 #45186
ChAT-IRES-Cre 敲入转基因小鼠系Jackson 实验室6410
Fast Green FCF 染料含量和基因;85 %Sigma-AldrichF7252-25G
火焰/棕色微量移液器拉拔器，型号 P-97Sutter Instrument Co.P-97
绿色纹身膏Ketchum MFG Co329A
磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4，液体，无菌过滤，适用于细胞培养Sigma-Aldrich806552
气动 PicoPumpWPI World Precision InstrumentsPV-820
含氧人工脑脊液 （aCSF） 试剂
氯化钙二水合物 （CaCl2·2H2O）Sigma-AldrichC7902
碳水化合物（5% CO2，95% O2）AirGasX02OX95C2003102供应商可能因地区而异
D-（+）-葡萄糖Sigma-AldrichG7021
HEPES，游离酸生物碱性HB0264
盐酸溶液，1 NSigma-AldrichH9892
氯化镁六水合物 （MgCl2·6H2O）Sigma-AldrichM2670
pH-试纸（6.0-7.7）VWRBDH35317.604
钾（KCl）Sigma-AldrichP9541
钠（NaCl）生物碱性DB0483
二氢钠（NaH2PO4）Sigma-AldrichRDD007
Software
ImageJ美国国立卫生研究院 （NIH）开源
视网膜平面安装手术剪刀 FST 哈样品样品华头 氯化氯化磷酸

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lefebvre, J. L., Sanes, J. R., Kay, J. N. Development of dendritic form and function. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 741-777 (2015).
  2. Graham, H. K., Duan, X. Molecular mechanisms regulating synapt....

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