本文介绍了一种利用延时共聚焦显微镜研究出生后小鼠视网膜外植体中神经突形态发生的方法。我们描述了一种稀疏标记和获取视网膜细胞类型及其细微突起的技术，该技术采用表达膜定位荧光蛋白的重组腺相关病毒载体，并以Cre依赖的方式实现特异性标记。
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本文内容
摘要
摘要
揭示树突分支模式的机制需要能够在发育过程中对树突进行可视化、成像和分析的方法。小鼠视网膜是研究神经元形态发生和连接性中细胞类型特异性机制的有力模型系统。视网膜亚型的组织结构和组成已明确界定，并且已有遗传工具可用于在发育过程中靶向特定细胞类型。许多视网膜细胞类型的树突和/或轴突被限制在狭窄的层内，这有利于进行活体延时成像。小鼠视网膜外植体培养适用于使用共聚焦或双光子显微镜进行活细胞成像，但目前尚缺乏在时间和空间分辨率上均优化的树突动态成像方法。本文介绍了一种利用Cre-Lox系统稀疏标记并成像特定视网膜细胞群发育过程的方法。所使用的商业化腺相关病毒（AAV）以Cre依赖的方式表达膜定位的荧光蛋白。在新生小鼠眼内注射AAV后4-5天即可实现靶向细胞类型的荧光标记。通过共聚焦成像可检测到膜上的荧光信号，并能分辨出精细的分支结构及其动态变化。通过对灌流含氧人工脑脊液（aCSF）的视网膜平铺标本进行成像，可获得持续2-4小时的高质量视频。同时提供了一套图像后期处理流程，用于去卷积和三维（3D）漂移校正。该方案可用于在完整视网膜中捕捉多种细胞行为，并鉴定调控神经突形态发生的 novel 因子。在视网膜中获得的许多发育策略将有助于理解中枢神经系统其他部位神经回路的形成过程。
引言
视网膜神经元的树突形成复杂而特异的形态模式，影响其在神经环路中的功能。在脊椎动物视网膜中，多种类型的视网膜神经节细胞（RGCs）和无长突细胞中间神经元具有独特的树突形态，其树突丛的大小、位置、分支长度和密度各不相同1。在出生后发育过程中，RGCs和无长突细胞将丰富的树突突起延伸至一个称为内丛状层（IPL）的神经网状区域，在此处接收由双极细胞传递的光感受器信号2。通过延时成像技术对鸡或斑马鱼幼体中荧光标记的视网膜细胞群体进行观察，发现树突形态发生过程高度动态3,4,5。在数天内，树突丛迅速扩展、重塑并分支，最终局限于IPL的特定亚层，并与特定的突触伙伴形成连接。在发育过程中，树突丛表现出不同的结构动态特征，包括分支新增、回缩和稳定化的相对速率发生变化。无长突细胞和RGC的树突也表现出不同的生长和重塑行为，这可能反映了细胞类型特异性的树突分支模式。然而，这些研究主要追踪的是广泛的无长突细胞或RGC群体，并聚焦于层状靶向，而层状分布仅是形态学的一个方面。
目前对产生视网膜不同亚型之间广泛形态多样性的机制仍知之甚少。本研究团队的目标是建立一种方法，用于捕获小鼠特定视网膜亚型中树突动态及其树突分支重塑的过程....
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方案
注意：本实验方案共历时两天，实验日之间需留出病毒转导所需的最少 4-5 天间隔（图 1A）。动物实验根据加拿大动物护理委员会关于研究和实验动物护理中动物使用的指导原则进行，并经加拿大安大略省多伦多市病童医院实验动物服务部动物使用与护理委员会批准的方案实施。
1. 新生小鼠 AAV 注射与成像实验的准备工作
- 选择一种Cre小鼠品系，以标记目标视网膜细胞群体。通过将小鼠与Cre转基因报告品系杂交，或使用Cre抗体进行免疫染色，确认在AAV注射时Cre重组酶的表达。
- 繁殖转基因Cre小鼠（8–16周龄），以获得Cre阳性的新生小鼠。
注意：本实验中使用ChAT-IRES-Cre基因敲入小鼠，以靶向胆碱能星形无长突细胞。 - 获取编码荧光蛋白的重组依赖型AAV病毒。为实现对细微结构的最优标记，应选择表达定位于细胞膜的修饰型XFPs的载体。
注意：本研究使用了Brainbow病毒（BBV），即AAV-EF1a-BbTagBY和AAV9-EF1a-BbChT（见材料表），可实现多色标记（图1B）。其中法呢基化增强型黄色荧光蛋白（eYFP）和单体Cherry（mCherry）在活体成像中产生最强的荧光信号。单种BBV可用于单个树突结构的成像，而联合注射不同BBV则可利用不同荧光团标记更多细胞或....
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结果
采用上述方案，获得了星形细胞树突发育过程的高分辨率三维视频，并进行了去卷积处理及三维漂移校正。通过生成Z平面最大投影，制作了用于分析的二维视频补充视频 1, 图 5A）。对每个时间点进行三维去卷积处理，提高了细小丝状伪足突起的分辨率（图5B, C）。细长的丝状伪足突起是发育中视网膜树突的特征36 在成像过程中应能清晰观察到标记细胞。AAV转染会导致细胞标记密度和荧光强度存在变异性。因此，需对标记组织进行筛选，选择荧光信号强的细胞用于成像并获取高质量视频。不建议通过提高激光功率来检测荧光较弱的细胞，因为这可能导致荧光迅速淬灭，并使噪声水平显著高于信号强度。足够明亮的细胞在注射后5天（5 dpi）即可被观察到。至12 dpi及之后，延长AAV感染时间并不一定会增强标记细胞的荧光强度。图 5D).
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讨论
本视频展示了一种实验流程，该流程利用现有的遗传工具，通过共聚焦活体成像技术对发育中视网膜神经元的树突动态进行成像。同时演示了向新生小鼠眼内注射编码膜靶向荧光蛋白的Cre依赖型腺相关病毒（AAV）。在基因靶向的细胞群体中，单个细胞可在注射后4-5天（dpi）即被显著标记。制备视网膜平铺标本以适用于标准成像腔室，进行活细胞共聚焦成像。该方法可生成单个细胞及其细微突起的高分辨率延时视频。利用开源软件（包括ImageJ、Vaa3D和ShuTu）以及Imaris和MBF Bioscience提供的授权软件中的去卷积和后期处理算法，可对细小突起进行分辨与定量分析。由于该流程具有模块化特性，每个实验步骤均可根据研究目标进行调整。以下将讨论这些模块化要素，包括：1）Cre品系的选择，2）荧光蛋白与病毒载体的选择，3）基因递送方法，以及4）成像方法。
该技术利用Cre转基因小鼠品系实现对视网膜细胞亚群的遗传学操控。为提高病毒感染和细胞标记的概率，Cre需在出生后具有活性，并在注射时于目标细胞群体中广泛表达。在本研究中，采用ChAT-Cre靶向星形无长突细胞，Vglut2-Cre品系用于靶向发育中的视.......
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披露
作者无任何披露事项。
致谢
我们感谢Madison Gray在我束手无策时伸出援手。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会发现基金（RGPIN-2016-06128）、斯隆神经科学研究员项目以及加拿大研究主席二级讲席（授予J.L.L.）的支持。S. Ing-Esteves获得了视觉科学研究项目及加拿大自然科学与工程研究委员会研究生奖学金-博士阶段的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Addgene 病毒制备品 #45185-AAV9 | |||
| Addgene 病毒制备品 #45186-AAV9 | |||
| 解剖工具 | |||
| 纤维素滤纸 | Whatman | 1001-070 | |
| Dumont #5 精细镊子 | FST | 11252-20 | 视网膜显微解剖需要两把 Dumont #5 镊子 |
| Dumont 镊子 | VWR | 82027-426 | |
| 精细剪刀 | FST | 14058-09 | |
| 混合纤维素酯膜（MCE）滤纸，亲水性，0.45 µm 孔径 | Millipore | HABG01 300 | |
| 培养皿，50 × 15 mm | VWR | 470313-352 | |
| 聚乙烯一次性移液管 | VWR | 470225-034 | |
| 圆头画笔，3/0 号 | 普通美术用品商店 | 视网膜平铺需要两支 3/0 号（或更小）画笔 | |
| 手术剪刀 | FST | 14007-14 | |
| Vannas 弹簧剪刀 - 2.5 mm 刃口 | FST | 15000-08 | |
| 活细胞成像培养系统 | |||
| 腔室聚乙烯管，PE-160 10' | Warner Instruments | 64-0755 | |
| 双通道加热控制器，型号 TC-344C | Warner Instruments | 64-2401 | |
| HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR 浸入式物镜 | Leica | 15506374 | |
| 加热控制器电缆 | Warner Instruments | CC-28 | |
| 带切片支撑的大浴槽培养室 | Warner Instruments | RC-27L | |
| MPII Mini-Peristaltic 泵 | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| PM-6D 磁性加热平台（培养室加热器） | Warner Instruments | PM-6D | |
| MPII Mini-Peristaltic 泵泵头管件 | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
| 样品固定锚（Harps） | Warner Instruments | 64-0260 | 样品固定锚必须与培养室兼容 |
| Sloflo 在线溶液加热器 | Warner Instruments | SF-28 | |
| 新生期注射 | |||
| 10 µL 微量注射器系列 700，可拆卸针头 | Hamilton Company | 80314 | |
| 30 G 皮下注射针头（0.5 英寸） | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| 4 英寸无芯薄壁玻璃毛细管（外径 1.0 mm / 内径 0.75 mm） | WPI World Precision Instruments | TW100-4 | |
| 乙醇 99.8%（用双蒸水 [ddH2O] 稀释至 70%） | Sigma-Aldrich | V001229 | |
| AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF | Penn Vector Core | AV-9-PV2453 | Addgene 质粒 #45185 |
| AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF | Penn Vector Core | AV-9-PV2454 | Addgene 质粒 #45186 |
| ChAT-IRES-Cre 基因敲入转基因小鼠品系 | The Jackson Laboratory | 6410 | |
| 快绿 FCF 染料含量 ≥85 % | Sigma-Aldrich | F7252-25G | |
| Flaming/Brown 微电极拉制仪，型号 P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 绿色纹身膏 | Ketchum MFG Co | 329A | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养 | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| 气动 PicoPump | WPI World Precision Instruments | PV-820 | |
| 含氧人工脑脊液（aCSF）试剂 | |||
| 二水合氯化钙（CaCl2·2H2O） | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| 碳酰气（5% CO2, 95% O2） | AirGas | X02OX95C2003102 | 供应商可能因地区而异 |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES，游离酸 | Bio Basic | HB0264 | |
| 盐酸溶液，1 N | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| 六水合氯化镁（MgCl2·6H2O） | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pH 测试试纸（6.0–7.7） | VWR | BDH35317.604 | |
| 氯化钾（KCl） | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 氯化钠（NaCl） | Bio Basic | DB0483 | |
| 磷酸二氢钠（NaH2PO4） | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| 软件 | |||
| ImageJ | 美国国立卫生研究院（NIH） | 开源 |
参考文献
- Lefebvre, J. L., Sanes, J. R., Kay, J. N. Development of dendritic form and function. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 741-777 (2015).
- Graham, H. K., Duan, X. Molecular mechanisms regulating synapt....
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重印与许可
