本文介绍了一种利用延时共聚焦显微镜研究出生后小鼠视网膜外植体中神经突形态发生的方法。我们描述了一种稀疏标记和获取视网膜细胞类型及其细微突起的技术，该技术采用表达膜定位荧光蛋白的重组腺相关病毒载体，并以Cre依赖的方式实现特异性标记。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
揭示树突分支模式的机制需要能够在发育过程中对树突进行可视化、成像和分析的方法。小鼠视网膜是研究神经元形态发生和连接性中细胞类型特异性机制的有力模型系统。视网膜亚型的组织结构和组成已明确界定，并且已有遗传工具可用于在发育过程中靶向特定细胞类型。许多视网膜细胞类型的树突和/或轴突被限制在狭窄的层内，这有利于进行活体延时成像。小鼠视网膜外植体培养适用于使用共聚焦或双光子显微镜进行活细胞成像，但目前尚缺乏在时间和空间分辨率上均优化的树突动态成像方法。本文介绍了一种利用Cre-Lox系统稀疏标记并成像特定视网膜细胞群发育过程的方法。所使用的商业化腺相关病毒（AAV）以Cre依赖的方式表达膜定位的荧光蛋白。在新生小鼠眼内注射AAV后4-5天即可实现靶向细胞类型的荧光标记。通过共聚焦成像可检测到膜上的荧光信号，并能分辨出精细的分支结构及其动态变化。通过对灌流含氧人工脑脊液（aCSF）的视网膜平铺标本进行成像，可获得持续2-4小时的高质量视频。同时提供了一套图像后期处理流程，用于去卷积和三维（3D）漂移校正。该方案可用于在完整视网膜中捕捉多种细胞行为，并鉴定调控神经突形态发生的 novel 因子。在视网膜中获得的许多发育策略将有助于理解中枢神经系统其他部位神经回路的形成过程。
引言
视网膜神经元的树突形成复杂而特异的形态模式，影响其在神经环路中的功能。在脊椎动物视网膜中，多种类型的视网膜神经节细胞（RGCs）和无长突细胞中间神经元具有独特的树突形态，其树突丛的大小、位置、分支长度和密度各不相同1。在出生后发育过程中，RGCs和无长突细胞将丰富的树突突起延伸至一个称为内丛状层（IPL）的神经网状区域，在此处接收由双极细胞传递的光感受器信号2。通过延时成像技术对鸡或斑马鱼幼体中荧光标记的视网膜细胞群体进行观察，发现树突形态发生过程高度动态3,4,5。在数天内，树突丛迅速扩展、重塑并分支，最终局限于IPL的特定亚层，并与特定的突触伙伴形成连接。在发育过程中，树突丛表现出不同的结构动态特征，包括分支新增、回缩和稳定化的相对速率发生变化。无长突细胞和RGC的树突也表现出不同的生长和重塑行为，这可能反映了细胞类型特异性的树突分支模式。然而，这些研究主要追踪的是广泛的无长突细胞或RGC群体，并聚焦于层状靶向，而层状分布仅是形态学的一个方面。
目前对产生视网膜不同亚型之间广泛形态多样性的机制仍知之甚少。本研究团队的目标是建立一种方法，用于捕获小鼠特定视网膜亚型中树突动态及其树突分支重塑的过程。要鉴定细胞类型特异性的树突模式形成机制，需要具备可视化并量化目标细胞树突行为的方法。小鼠视网膜的器官型培养适用于使用共聚焦显微镜或双光子显微镜进行活细胞成像研究。发育中的视网膜可被解剖并制备成扁平状外植体，可在记录室中持续成像数小时，或在数天的培养过程中保持神经环路基本不受影响6,7。活体视网膜神经元可通过多种技术进行标记，包括电极染料填充、电穿孔、通过基因枪将包裹脂溶性染料或编码荧光蛋白的质粒的微粒进行弹道式递送，以及使用遗传编码的细胞标记物7,8,9,10。然而，这些方法在成像特定视网膜亚型的树突动态方面效率较低。例如，染料填充法通量低，且需要电生理设备以及额外的遗传标记，才能可靠地靶向目标细胞。此外，胞体中强烈的荧光信号可能遮蔽邻近的树突结构。
基因枪递送方法可同时标记数十个细胞，但涉及高压颗粒递送及离体视网膜过夜孵育的步骤可能损害细胞生理状态及树突的生长。本文提出，在满足以下实验条件的前提下，可利用近期发展的遗传学工具，在细胞类型和结构分辨率水平上捕捉早期树突动态。首先，为解析在发育过程中占主导地位的细小分支和丝状伪足，该方法应使用明亮且能完整填充整个树突结构的荧光蛋白对神经元进行标记。在成像期间，荧光标记不应因光漂白而减弱。目前已开发并比较了多种荧光蛋白变体，根据其亮度和光稳定性，评估其适用于活体/离体 成像的效果11。其次，荧光蛋白（XFPs）必须在树突形态发生的最早阶段即达到足够高的表达水平，以避免错过短暂的发育窗口。在对小鼠视网膜静态时间点的分析中发现，树突发育发生在出生后第一周，包括生长、重塑和稳定等阶段10,12,13,14,15。第三，该方法应实现对目标神经元亚群的选择性标记，或显著提高其标记概率。 第四，目标亚群的标记必须足够稀疏，以便识别并追踪完整的神经元树突结构。 尽管RGC和无长突细胞亚型可通过其成熟的形态特征及内丛状层（IPL）的分层模式加以区分16,17,18,19,20，但挑战在于如何基于未成熟的结构在发育过程中识别这些亚型。随着转基因工具的发展，可在发育过程中特异性地标记特定视网膜细胞类型，从而促进了这一任务的实现。
利用基因调控元件决定荧光蛋白或 Cre 在细胞内和时间上的表达模式，转基因和基因敲入小鼠品系被广泛用于研究视网膜细胞类型13,21,22,23。关于树突发育的亚型特异性模式的关键发现，主要来自在静态时间点对转基因小鼠视网膜的研究10,14,24,25。特别是 Cre-Lox 系统，能够利用多种依赖重组酶的报告基因、传感器和光遗传学激活工具，实现对亚型的精细基因操作和监测。这些工具促进了对视网膜环路组装过程中起关键作用的亚型特异性分子程序和功能特性的发现26,27,28,29,30。然而，这些方法尚未被用于研究小鼠视网膜中树突动态的亚型特异性特征。通过将 Cre 小鼠品系与电穿孔或重组腺相关病毒（AAV）导入的转基因相结合，可实现低密度标记。若有条件，也可使用他莫昔芬诱导型 Cre 品系或交叉遗传策略。最后，应以最小侵入性的方式对细胞进行标记，并采用不影响组织状态或干扰树突形态发生所需细胞功能的成像参数进行观察。
本文介绍了一种利用转基因工具和共聚焦显微镜研究活体小鼠视网膜外植体中树突动态的方法。将Cre转基因小鼠品系与在Cre重组后表达荧光蛋白的AAV载体相结合，可实现对特定视网膜细胞的稀疏标记。 commercially available AAVs通过玻璃体内注射递送至新生小鼠视网膜。本文证明，AAVs在感染后4天（4 dpi）即可产生显著高水平且细胞类型特异性的荧光表达，从而可研究出生后的时间点。为展示该方法，将Brainbow AAV递送至表达胆碱乙酰转移酶（ChAT）-内部核糖体进入位点（IRES）-Cre转基因的新生小鼠，以标记胆碱能“"星爆"”无长突细胞，该转基因在出生后早期视网膜中具有活性31,32。星爆无长突细胞发育出典型且呈放射状的树突分支形态，该形态由成簇原钙黏蛋白介导的树突自我回避机制塑造33,34。本文表明，通过在XFPs上添加经历法尼基化的CAAX基序（如Brainbow AAV所用），将荧光蛋白靶向细胞膜，可显著提高对星爆细胞树突及丝状伪足的分辨率31。最后，已确定时间序列成像及后期图像处理方案 ，可获得高质量图像，适用于树突重建与形态计量学量化分析。该方案可用于鉴定调控树突发育的因素，并在完整视网膜中捕捉多种细胞行为。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：本实验方案共持续2天，实验日之间需至少间隔4-5天以完成病毒转导（图1A）。动物实验均按照加拿大动物护理委员会关于研究和实验动物护理的动物使用指南进行，并经加拿大安大略省多伦多市病童医院实验动物服务部动物使用与护理委员会批准的实验方案许可后实施。
1. 新生儿 AAV 注射与成像实验的准备工作
- 选择一种Cre小鼠品系，以标记目标视网膜细胞群体。通过将小鼠与Cre转基因报告小鼠杂交，或使用Cre抗体进行免疫染色，确认在AAV注射时Cre重组酶的表达。
- 繁殖转基因Cre小鼠（8–16周龄），以获得Cre阳性的新生小鼠。
注：本实验中使用ChAT-IRES-Cre基因敲入小鼠，以靶向胆碱能星形无长突细胞。 - 获取编码荧光蛋白的重组依赖型AAV病毒。为实现对细微结构的最优标记，应选择表达定位于细胞膜的修饰型XFPs的载体。
注：本研究使用了Brainbow病毒（BBV），即AAV-EF1a-BbTagBY和AAV9-EF1a-BbChT（见材料表），可实现多色标记（图1B）。其中法呢基化增强型黄色荧光蛋白（eYFP）和单体Cherry（mCherry）在活体成像中表现出最强的荧光信号。单种BBV可用于单个树突结构的成像，而联合注射不同BBV则可利用不同荧光团标记更多细胞或相邻的树突结构。若使用多种荧光蛋白，需确保其发射光谱重叠最小（图1C）。显微镜采集参数必须调整以分别捕获不同的XFP信号。 - 将AAV病毒分装为每份约3–5 µL，置于低吸附性离心管中，制备成单次使用量，避免反复冻融。储存于-80 °C。
- 使用拉针仪制备尖端极细的硼硅酸盐玻璃微量移液管。
注：拉针仪参数设置因灯丝类型和仪器型号而异；最终尖端尺寸和形状参见图2A。典型液滴直径为600 µm。 - 准备显微注射系统及相关管路。将微注射器连接至加压空气接口。
图 1：实验概览。 （A）本实验方案包含两个实验日，两次实验之间至少需有 4–5 天的感染期。对出生后不超过 3 天的新生小鼠进行眼内注射。随后解剖视网膜，将其平铺并进行活体成像，以捕捉所需发育阶段的图像。标记的细胞可在病毒表达所需的 4–5 天后任意时间进行成像，因为延长的 AAV 表达对树突形态无明显影响。（B）将 Cre 依赖型 Brainbow AAV 载体（BBV）注射至表达 Cre31 的动物体内。本研究中使用 ChAT-Cre 基因敲入小鼠，以在星形无长突细胞中驱动 Cre 重组。两种 BBV 分别编码修饰后的 eYFP 或 tagBFP，以及 mCherry 和 mTFP，其末端均带有 CAAX 基序，可依次发生法尼基化，从而实现膜定位。Lox 位点以三角形表示。这些载体可在 Cre 介导的重组作用下，以随机且组合的方式表达法尼基化的 XFP。EF1α 启动子包含延伸因子 1α 基因的调控元件。W 代表土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件的序列，pA 表示多聚腺苷酸化序列。（C）本研究中所成像的 BBV 荧光蛋白 mCherry 和 eYFP 的激发与发射光谱。在对多种荧光蛋白进行活体成像时，必须合理设置检测参数，以充分将发射光谱分至不同的通道中。缩写：AAV = adeno-associated virus；BBV = Brainbow AAV；ChAT = choline acetyltransferase；iRES = internal ribosome entry site；eYFP = enhanced yellow fluorescent protein；iTR = inverted terminal repeat；tagBP = Tag-blue fluorescent protein；mCherry = monomeric Cherry；mTFP = teal fluorescent protein；XFP = any fluorescent protein；EF1α = elongation factor 1 alpha。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 新生小鼠的玻璃体内注射 AAV
- 在冰上解冻一份数 AAV 样品。使用无菌生理盐水或磷酸盐缓冲盐水配制约 1:4 的 AAV 稀释液。准备约0.5 µL 每只动物的 AAV 稀释液量（约0.25 µL 每只眼）以备移液管断裂时更换并重新填充。将剩余未稀释的 AAV 储存于 4 °C，并在2周内使用.
注意：在本实验中，供应商提供的 AAV 浓度约为 ~1-2 × 1013 基因组含量（GC）/mL，并稀释至终浓度为 4 × 1012 GC/mL。优化病毒浓度以获得理想的标记密度。 - 为了观察注射情况，加入约 1 µL 0.02% 快绿FCF染料溶液 15 µL 加入AAV稀释液使溶液呈蓝色。
- 将带有母鼠及其新生幼崽（出生后0.5–3天）的鼠笼转移至配备显微注射设备的操作室。保持动物处于同一鼠笼中，并保留巢材和垫料，以最大限度减少母鼠应激及对幼崽的排斥行为。
- 用70%乙醇对注射区域进行消毒，并在实验台表面放置无菌尿垫。准备一个温暖的平台（例如加热垫），用于小鼠从低温诱导的麻醉中恢复。
- 使用微量注射器将 AAV 稀释液回填至微量移液管中。在体视显微镜下，用 30 G 针头轻折微量移液管尖端以打开封口。
注意： 图2A 显示回填后的尖端——已密封（上）和未密封（中）。 - 通过将1-2只新生小鼠置于冰上，利用低温使其麻醉。将动物放置在乳胶手套上，以防止皮肤直接接触冰面。当动物对足垫夹捏刺激不再产生反应（约2分钟）时，将其置于体视显微镜下。如需要，可用纹身墨和30 G针头对足垫进行标记，并采集尾尖组织用于DNA提取，以便通过基因分型鉴定动物个体。
注意：整个操作过程中必须适当监测麻醉深度。 - 用70%乙醇擦拭眼周皮肤。使用30 G针头切开融合的 eyelid（眼睑）。图2B）。用手指轻轻按压以打开眼睛，并在角膜-巩膜交界处穿过角膜刺一个小孔（图 2C).
- 将玻璃微量移液管插入孔中，踩下显微注射仪脚踏开关2-4次，将AAV注入玻璃体腔。缓慢取出移液管，并通过瞳孔观察蓝色染料以确认AAV注射成功图 2D).
注意：使用6-8 psi的喷射压力和600-800 ms的脉冲时间，可实现 600 µm 直径液滴被喷出（图2A，底部）。约 0.23-0.45 µL 每眼注射一定量的AAV溶液。若眼睛外部出现蓝色溶液，表明AAV未注入眼内。若注射部位有蓝色溶液渗出，提示AAV可能已泄漏，从而降低转染效率。 - 轻轻按压眼睑使其闭合复位，并将幼崽置于加热垫上。待动物体色恢复为粉红色且出现反应后，轻柔地将其转移回饲养笼中。
注意：应采取适当预防措施，避免幼崽复温过快。 - 对同窝剩余动物重复注射操作。病毒转导至少需要4-5天后，再进行视网膜成像。
图 2：新生小鼠眼内注射。（A）回吸后的微移液管显示封口后（顶部）和尖端解封后（底部左侧）的移液管尖端形状。6–8 psi 的皮升注射压力和 600–800 ms 的脉冲时间可产生直径为 600 µm 的液滴（底部右侧）。比例尺 = 1 mm。（B）在 16 倍放大镜下观察麻醉后的 P0 仔鼠。使用锋利的 30 G 针头切开融合的眼睑连接处（白色）。比例尺 = 2 mm。（C）对眼球施加轻压以暴露角膜；比例尺 = 2 mm。放大区域（红色）显示使用 30 G 针头在角膜-巩膜交界处（黄色）制造的小孔；比例尺 = 0.5 mm。（D）注射后撤出移液管尖端（左侧）。AAV 溶液中的快绿染料通过瞳孔呈现蓝灰色（中间），与注射前较亮的瞳孔颜色（右侧）相比明显不同。比例尺 = 1 mm。（E）4 天后，眼睑已愈合并闭合（左侧）；比例尺 = 2 mm。摘除眼球后可见愈合的注射部位（黄色）；比例尺 = 1 mm。注意注射部位位于角膜与巩膜交界处。 请点击此处查看该图的放大版本。
3. 成像实验用视网膜解剖
- 配制视网膜 aCSF（119 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.3 mM MgCl₂, 1.2 mM NaH₂PO₄, 2.5 mM CaCl₂, 11 mM D-葡萄糖, 26 mM NaHCO₃），持续通入 95% O₂ / 5% CO₂ 气体混合物至少 30 分钟以充分氧合并调节 pH 至 7.42·6H2O, 2.5 mM CaCl2·2H2O₂，1 mM NaHCO₃2PO4，11 mM 葡萄糖，以及 20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES 游离酸）35如需要，可配制10倍浓度溶液并冷冻保存；使用时解冻并按需稀释至1倍浓度。
- 用碳合气（95% O₂ / 5% CO₂）通气氧合视网膜 aCSF2，5% CO2）至少15分钟。将pH值调节至7.4。保存于密封容器中直至使用，以确保人工脑脊液（aCSF）保持充分氧合。
注意：视网膜需要高浓度的 O₂2在整个实验过程中，保持人工脑脊液（aCSF）的氧合状态至关重要。 - 将一个直径为 60 mm 的培养皿嵌入冰盒中（可用实验室塑料制品自制冰盒，例如移液器盒盖），并置于体视显微镜下。向培养皿中加入充氧的视网膜 aCSF。
- 通过断头法处死P9及更小日龄的小鼠。对于P10及以上日龄的小鼠，先采用异氟烷麻醉诱导（或根据动物实验方案批准的其他替代方法），随后进行断头处死。
- 若眼睑闭合，剪开眼睑瓣以暴露眼球。用镊子摘除眼球，并将其转移至第3.3步准备的冷视网膜aCSF中。
- 在体视显微镜下（放大倍数25倍），使用Dumont #5镊子夹住视神经以固定眼球，从而解剖视杯。图3A).
- 用30 G针头在角膜中心刺一个孔，然后将显微剪刀的一侧刀尖插入孔中，从孔处向角膜边缘剪开一条切口。沿四个 cardinal 方向重复操作，共制作4条切口，形成4个“瓣”图 3A).
- 用两把Dumont #5镊子夹住并拉开两片相邻的瓣膜，轻轻将巩膜从视网膜上剥离。对剩余的角膜瓣重复此操作，并将巩膜完全从视网膜上移除。图3B).
- 用镊子从视杯中取出晶状体。用显微剪从视网膜边缘向视神经方向做4条放射状切口，形成4个均等的瓣状结构（图3B）。对另一只眼睛重复步骤 3.4–3.7。
4. 视网膜平铺制备
- 准备用于固定的灰色混合纤维素酯（MCE）膜滤膜圆片。若使用大直径的 MCE 膜滤膜，将其切割成四等份（每份约 1 cm 宽）。将 MCE 圆片置于较大白色滤纸中央（图 3D）。
注意：MCE 滤膜也可直接购得直径为 1 cm 的圆片。MCE 滤膜圆片必须足够大以容纳 1–2 个视网膜，但又需足够小以适配成像室。由于 MCE 膜带有静电，应尽量减少对 MCE 膜的接触和操作。 - 使用两把 3/0 号画笔操作视网膜，将一个视网膜杯用画笔翻转，使视网膜神经节细胞侧朝下。轻轻将视网膜从 aCSF 中提起，确保液体表面张力不会撕裂视网膜（图 3C）。
- 在仍用画笔持握视网膜的同时，使用移液管在 MCE 滤纸中央滴加一滴 aCSF（图 3C，右图）。利用表面张力使视网膜漂浮进入 aCSF 液滴中。使用画笔将视网膜调整为神经节细胞侧朝上，并展开四个瓣状结构。
- 定位完成后，在画笔与白色滤纸之间建立水桥，以打破液滴的表面张力。
注意：当 aCSF 被迅速吸走时，视网膜将黏附于 MCE 滤膜上（图 3D、E）。平铺固定的视网膜可通过镊子夹持 MCE 圆片进行操作。若在形成水桥前 aCSF 液滴即快速被吸走，可能表明 MCE 膜未带电。此时应更换新的 MCE 膜，并通过在摘除眼球后立即进行解剖和平铺固定操作，尽量缩短摘除至成像之间的时间。
图3：视网膜解剖及在混合纤维素酯滤膜上的平铺制备。（A）左图：通过Dumont #5 镊子夹持视神经固定去眼球（左）。使用30 G针头在角膜中央穿刺一个小孔（中）。用显微解剖剪将角膜剪成四个等分的瓣状结构（右）。比例尺 = 1 mm。（B）解剖后的视网膜，已用两把Dumont #5 镊子剥离巩膜（左），并已移除晶状体（中）。视网膜上做四个等距切口，切至视网膜半径处（右）。比例尺 = 1 mm。（C）使用两把精细画笔（3/0号，左）操作视网膜。将视网膜神经节细胞面向下翻转至画笔上（中），并从人工脑脊液（aCSF）中轻轻提起，注意避免液体表面张力撕裂视网膜（右）。比例尺 = 2 mm。（D）将灰色混合纤维素酯（MCE）膜圆片置于白色滤纸上（左）。在MCE膜上滴加一滴aCSF（右）。比例尺 = 1 cm。（E）将视网膜漂浮进入液滴并定位后，利用白色滤纸建立水桥，以虹吸方式吸除aCSF，使视网膜贴附于带电荷的MCE膜上（左）；比例尺 = 1 cm。MCE膜的放大图像（红色）显示两个视网膜已成功平铺，且神经节细胞面朝上（右）；比例尺 = 2 mm。其中一个视网膜以白色轮廓标出。缩略语：MCE = 混合纤维素酯；aCSF = 人工脑脊液。请点击此处查看该图的放大版本。
5. 活体全层视网膜标本的延时共聚焦成像
- 如图4所示，组装用于直立式共聚焦显微镜的活体成像培养室。
注意：对于倒置共聚焦系统，应将视网膜平铺样本以RGC侧朝下直接放置于培养室的玻璃底盖玻片上。一旦视网膜与盖玻片接触，便不可再移动。 - 用充氧的人工脑脊液（aCSF）填充培养室，并启动泵和温度控制器（温度设定为32–34 °C，流速为1 mL/min）。温度不得超过34 °C。
- 将视网膜平铺样本转移至灌流室时，先停止泵运行，并移除培养室中的aCSF。将带有视网膜平铺样本的MCE圆盘放入（空的）培养室中。
- 在平铺样本上放置样品压重物；使用前先润湿压重物以破坏表面张力。重新用预热的aCSF充满培养室，并以约1 mL/min的速度循环灌流aCSF。
- 将配备25倍水浸物镜（数值孔径0.95）的物镜转盘置入成像室中。利用落射荧光照明筛选目标标记细胞（图4C）。
- 调节成像体积以捕获感兴趣区域的树突结构。
注意：本研究以每帧1024 × 1024像素、z轴步进1 µm、每组z栈间间隔2分钟的参数完整采集树突分支结构。最终图像尺寸约为100 µm × 100 µm × 20 µm。 - 通过查找表调节激光功率至最佳设置，以识别过饱和与欠饱和像素。扫描过程中调节激光功率，确保无像素过饱和（即强度不超过255）。根据需要持续成像，或直至荧光信号显著且可察觉地下降并伴随噪声增加（通常为2–4小时）。
注意：建议使用较低的激光功率，因为当像素分布覆盖整个动态范围时，去卷积算法效果最佳。像素强度不应超过254；对神经突的实证分析表明，像素值低于170时最适合进行去卷积。相较于单次较慢扫描，优先选择较快的扫描速度（400–600 Hz）并结合线平均（2–3次）。长时间成像区域常出现光漂白，但其他外植体部分仍保持活性。可在同一平铺样本的不同区域依次成像，每次2–4小时，总孵育时间可达6小时。超过6小时的成像尚未系统测试。神经突退化和出泡现象表明外植体活性正在下降。 - 成像完成后，用冰冷的4%多聚甲醛在4 °C下固定视网膜平铺样本及膜滤器1–2小时。通过免疫组织化学方法对固定后的视网膜中荧光标记进行信号放大，以供后续分析。
注意：使用倒置共聚焦显微镜时无法进行成像后固定，因移除视网膜会破坏组织。
图 4：活细胞成像培养箱装置示意图。 （A）活体成像培养装置，显示加热、灌流溶液和成像组件。双加热系统包括一个带加热功能的培养室平台（后部带蓝色连接电极的圆圈）和一个串联溶液加热器。（B）4A 的示意图。将视网膜平铺样本（红色）置于MCE膜（灰色）上，并放入培养室中。串联溶液加热器连接至溶液泵（图 4A 中未显示）。成像室的尺寸设计为浸入式物镜前端提供了充足的操作空间。（C）25倍镜下观察视网膜外植体，注射了 0.23–0.45 µL 浓度为 4 × 1012 GC/mL 的 AAV 稀释液；比例尺 = 100 µm。细胞密集标记区域常围绕视盘（右下虚线）分布；比例尺 = 50 µm。缩写：MCE = 混合纤维素酯；GC = 基因组拷贝数；mCherry = 单体Cherry荧光蛋白；eYFP = 增强型黄色荧光蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。
6. 在 ImageJ 中进行图像去卷积与后期处理
- 导入图像序列，按时间拆分序列，如果是多色图像，还需按颜色拆分。确保同一颜色的所有时间点图像均包含在同一个文件夹中。
注意：若使用 ImageJ，请导入 Bio-formats（Bio-formats 已自动包含在 FIJI 中）。 - 使用 ImageJ 插件创建理论点扩散函数（PSF） 三维衍射点扩散函数.
注意：每个成像通道都需要使用独立的点扩散函数（PSF），因为荧光蛋白的发射波长会影响PSF。 - 使用 插件 | 宏 | 运行 进行批量操作 并行迭代去卷积 对于所有时间点使用所提供的 大宏 (补充文件 1).
注：该宏将运行25次维纳滤波预条件兰德韦伯（WPL）迭代算法。每个颜色通道必须单独进行去卷积。 - 合并颜色通道，并将所有时间点编译为超堆栈（Hyperstack）图像 | 超级堆栈 | 堆栈转超级堆栈）。使用以下方法校正3D漂移 插件 | 注册 | 校正3D漂移.
- 将图像恢复为常规堆栈（图像 | 超级图像堆栈 | 超级图像堆栈转单层堆栈），并拆分时间点（图像 | 图像序列 | 工具 | 图像序列分割器）。使用批处理为所有时间点创建最大投影（流程 | 批次 | 宏 运行("Z 投影...", "投影=[最大强度]"); ).
- 导入延时图像序列（文件 | 导入 | 图像序列）。对去卷积并后处理后的二维（2D）视频使用常规的 ImageJ 工具进行所需的分析。
注意：四维（三维 + 时间）去卷积并校正漂移的视频可作为超堆栈查看。若要保留三维时间点，请省略上一步。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
采用上述方案，获得了星形细胞树突发育过程的高分辨率三维视频，并进行了去卷积及三维漂移校正。通过生成Z平面最大投影，制作了用于分析的二维视频补充视频 1, 图 5A）。对每个时间点进行三维去卷积处理，提高了细小丝状伪足突起的分辨率（图5B，C）。细小的丝状伪足突起是发育中视网膜树突的一个特征36 在成像过程中应能清晰观察到标记细胞。AAV转染会导致细胞标记密度和荧光强度存在变异性。因此，需对标记组织进行筛选，选择荧光信号强的细胞用于成像并获取高质量视频。不建议通过提高激光功率来检测荧光较弱的细胞，因为这可能导致快速光漂白，并使噪声水平显著高于信号强度。足够明亮的细胞在注射后5天（dpi）即可清晰可见。至12 dpi及之后，延长AAV感染时间并不一定会增强标记细胞的荧光强度。图5D).
过强的荧...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本视频展示了一种实验流程，该流程利用现有的遗传工具，通过共聚焦活体成像技术对发育中视网膜神经元的树突动态进行成像。同时演示了向新生小鼠眼内注射编码膜靶向荧光蛋白的Cre依赖型腺相关病毒（AAV）。在基因靶向的细胞群体中，单个细胞可在注射后4-5天（dpi）即被显著标记。制备视网膜平铺标本以适用于标准成像腔室，进行活细胞共聚焦成像。该方法可生成单个细胞及其细微突起的高分辨率延时视频。利用开源软件（包括ImageJ、Vaa3D和ShuTu）以及Imaris和MBF Bioscience提供的授权软件中的去卷积和后期处理算法，可对细小突起进行分辨与定量分析。由于该流程具有模块化特性，每个实验步骤均可根据研究目标进行调整。以下将讨论这些模块化要素，包括：1）Cre品系的选择，2）荧光蛋白与病毒载体的选择，3）基因递送方法，以及4）成像方法。
该技术利用Cre转基因小鼠品系实现对视网膜细胞亚群的遗传学操控。为提高病毒感染和细胞标记的概率，Cre需在出生后具有活性，并在注射时于目标细胞群体中广泛表达。在本研究中，采用ChAT-Cre靶向星形无长突细胞，Vglut2-Cre品系用于靶向发育中的视...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何披露事项。
致谢
我们感谢Madison Gray在我束手无策时伸出援手。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会发现基金（RGPIN-2016-06128）、斯隆神经科学研究员项目以及加拿大研究主席二级讲席（授予J.L.L.）的支持。S. Ing-Esteves获得了视觉科学研究项目及加拿大自然科学与工程研究委员会研究生奖学金-博士阶段的支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Addgene 病毒制备品 #45185-AAV9 | |||
| Addgene 病毒制备品 #45186-AAV9 | |||
| 解剖工具 | |||
| 纤维素滤纸 | Whatman | 1001-070 | |
| Dumont #5 精细镊子 | FST | 11252-20 | 视网膜显微解剖需要两把 Dumont #5 镊子 |
| Dumont 镊子 | VWR | 82027-426 | |
| 精细剪刀 | FST | 14058-09 | |
| 混合纤维素酯膜（MCE）滤纸，亲水性，0.45 µm 孔径 | Millipore | HABG01 300 | |
| 培养皿，50 × 15 mm | VWR | 470313-352 | |
| 聚乙烯一次性移液管 | VWR | 470225-034 | |
| 圆头画笔，3/0 号 | 普通美术用品商店 | 视网膜平铺需要两支 3/0 号（或更小）画笔 | |
| 手术剪刀 | FST | 14007-14 | |
| Vannas 弹簧剪刀 - 2.5 mm 刃口 | FST | 15000-08 | |
| 活细胞成像培养系统 | |||
| 腔室聚乙烯管，PE-160 10' | Warner Instruments | 64-0755 | |
| 双通道加热控制器，型号 TC-344C | Warner Instruments | 64-2401 | |
| HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR 浸入式物镜 | Leica | 15506374 | |
| 加热控制器电缆 | Warner Instruments | CC-28 | |
| 带切片支撑的大浴槽培养室 | Warner Instruments | RC-27L | |
| MPII Mini-Peristaltic 泵 | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| PM-6D 磁性加热平台（培养室加热器） | Warner Instruments | PM-6D | |
| MPII Mini-Peristaltic 泵泵头管件 | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
| 样品固定锚（Harps） | Warner Instruments | 64-0260 | 样品固定锚必须与培养室兼容 |
| Sloflo 在线溶液加热器 | Warner Instruments | SF-28 | |
| 新生期注射 | |||
| 10 µL 微量注射器系列 700，可拆卸针头 | Hamilton Company | 80314 | |
| 30 G 皮下注射针头（0.5 英寸） | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| 4 英寸无芯薄壁玻璃毛细管（外径 1.0 mm / 内径 0.75 mm） | WPI World Precision Instruments | TW100-4 | |
| 乙醇 99.8%（用双蒸水 [ddH2O] 稀释至 70%） | Sigma-Aldrich | V001229 | |
| AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF | Penn Vector Core | AV-9-PV2453 | Addgene 质粒 #45185 |
| AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF | Penn Vector Core | AV-9-PV2454 | Addgene 质粒 #45186 |
| ChAT-IRES-Cre 基因敲入转基因小鼠品系 | The Jackson Laboratory | 6410 | |
| 快绿 FCF 染料含量 ≥85 % | Sigma-Aldrich | F7252-25G | |
| Flaming/Brown 微电极拉制仪，型号 P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 绿色纹身膏 | Ketchum MFG Co | 329A | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养 | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| 气动 PicoPump | WPI World Precision Instruments | PV-820 | |
| 含氧人工脑脊液（aCSF）试剂 | |||
| 二水合氯化钙（CaCl2·2H2O） | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| 碳酰气（5% CO2, 95% O2） | AirGas | X02OX95C2003102 | 供应商可能因地区而异 |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES，游离酸 | Bio Basic | HB0264 | |
| 盐酸溶液，1 N | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| 六水合氯化镁（MgCl2·6H2O） | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pH 测试试纸（6.0–7.7） | VWR | BDH35317.604 | |
| 氯化钾（KCl） | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 氯化钠（NaCl） | Bio Basic | DB0483 | |
| 磷酸二氢钠（NaH2PO4） | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| 软件 | |||
| ImageJ | 美国国立卫生研究院（NIH） | 开源 |
参考文献
- Lefebvre, J. L., Sanes, J. R., Kay, J. N. Development of dendritic form and function. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 741-777 (2015).
- Graham, H. K., Duan, X. Molecular mechanisms regulating synaptic specificity and retinal circuit formation. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental biology. 10 (1), 379(2021).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
- Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52 (4), 609-621 (2006).
- Wong, W. T., Faulkner-Jones, B. E., Sanes, J. R., Wong, R. O. Rapid dendritic remodeling in the developing retina: dependence on neurotransmission and reciprocal regulation by Rac and Rho. The Journal of Neuroscience. 20 (13), 5024-5036 (2000).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nature Protocols. 5 (7), 1347-1352 (2010).
- Morgan, J. L., Wong, R. O. L. Ballistic labeling with fluorescent dyes and indicators. Current Protocols in Neuroscience. 43 (1), 1-10 (2008).
- Nickerson, P. E. B., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Developmental Biology. 13, 24(2013).
- Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. L. Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells. Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).
- Coombs, J. L., Van Der List, D., Chalupa, L. M. Morphological properties of mouse retinal ganglion cells during postnatal development. The Journal of Comparative Neurology. 503 (6), 803-814 (2007).
- Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
- Stacy, R. C., Wong, R. O. L. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 456 (2), 154-166 (2003).
- Kay, J. N., et al. Retinal ganglion cells with distinct directional preferences differ in molecular identity, structure, and central projections. The Journal of Neuroscience. 31 (21), 7753-7762 (2011).
- Liu, J., Sanes, J. R. Cellular and molecular analysis of dendritic morphogenesis in a retinal cell type that senses color contrast and ventral motion. The Journal of Neuroscience. 37 (50), 12247-12262 (2017).
- Diao, L., Sun, W., Deng, Q., He, S. Development of the mouse retina: emerging morphological diversity of the ganglion cells. Journal of Neurobiology. 61 (2), 236-249 (2004).
- Coombs, J., vander List, D., Wang, G. Y., Chalupa, L. M. Morphological properties of mouse retinal ganglion cells. Neuroscience. 140 (1), 123-136 (2006).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Sümbül, U., et al. A genetic and computational approach to structurally classify neuronal types. Nature Communications. 5, 3512(2014).
- Lin, B., Masland, R. H. Populations of wide-field amacrine cells in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 499 (5), 797-809 (2006).
- Macneil, M. A., Heussy, J. K., Dacheux, R. F., Raviola, E., Masland, R. H. The shapes and numbers of amacrine cells: Matching of photofilled with Golgi-stained cells in the rabbit retina and comparison with other mammalian species. Journal of Comparative Neurology. 413 (2), 305-326 (1999).
- Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
- Jo, A., Xu, J., Deniz, S., Cherian, S., DeVries, S. H., Zhu, Y. Intersectional strategies for targeting amacrine and ganglion cell types in the mouse retina. Frontiers in Neural Circuits. 12, 66(2018).
- Siegert, S., et al. Genetic address book for retinal cell types. Nature Neuroscience. 12 (9), 1197-1204 (2009).
- Kim, I. -J., Zhang, Y., Meister, M., Sanes, J. R. Laminar restriction of retinal ganglion cell dendrites and axons: subtype-specific developmental patterns revealed with transgenic markers. The Journal of Neuroscience. 30 (4), 1452-1462 (2010).
- Peng, Y. -R., Tran, N. M., Krishnaswamy, A., Kostadinov, D., Martersteck, E. M., Sanes, J. R. Satb1 regulates contactin 5 to pattern dendrites of a mammalian retinal ganglion cell. Neuron. 95 (4), 869-883 (2017).
- Duan, X., Krishnaswamy, A., Dela Huerta, I., Sanes, J. R. Type II cadherins guide assembly of a direction-selective retinal circuit. Cell. 158 (4), 793-807 (2014).
- Ray, T. A., et al. Formation of retinal direction-selective circuitry initiated by starburst amacrine cell homotypic contact. eLife. 7, 34241(2018).
- Krishnaswamy, A., Yamagata, M., Duan, X., Hong, Y. K., Sanes, J. R. Sidekick 2 directs formation of a retinal circuit that detects differential motion. Nature. 524 (7566), 466-470 (2015).
- Caval-Holme, F., Zhang, Y., Feller, M. B. Gap junction coupling shapes the encoding of light in the developing retina. Current Biology. 29 (23), 4024-4035 (2019).
- Lucas, J. A., Schmidt, T. M. Cellular properties of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells during postnatal development. Neural Development. 14 (1), 8(2019).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. 10 (6), 540-547 (2013).
- Rossi, J., et al. Melanocortin-4 receptors expressed by cholinergic neurons regulate energy balance and glucose homeostasis. Cell Metabolism. 13 (2), 195-204 (2011).
- Lefebvre, J. L., Kostadinov, D., Chen, W. V., Maniatis, T., Sanes, J. R. Protocadherins mediate dendritic self-avoidance in the mammalian nervous system. Nature. 488 (7412), 517-521 (2012).
- Ing-Esteves, S., et al. Combinatorial effects of alpha- and gamma-protocadherins on neuronal survival and dendritic self-avoidance. The Journal of Neuroscience. 38 (11), 2713-2729 (2018).
- Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. L. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (1), (2013).
- Ramoa, A. S., Campbell, G., Shatz, C. J. Transient morphological features of identified ganglion cells in living fetal and neonatal retina. Science. 237 (4814), 522-525 (1987).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
- Cuntz, H., Forstner, F., Borst, A., Häusser, M. One rule to grow them all: a general theory of neuronal branching and its practical application. PLoS Computational Biology. 6 (8), 1000877(2010).
- Xiao, H., Peng, H. APP2: automatic tracing of 3D neuron morphology based on hierarchical pruning of a gray-weighted image distance-tree. Bioinformatics. 29 (11), 1448-1454 (2013).
- Nanda, S., et al. Design and implementation of multi-signal and time-varying neural reconstructions. Scientific data. 5, 170207(2018).
- Sherry, D. M., Wang, M. M., Bates, J., Frishman, L. J. Expression of vesicular glutamate transporter 1 in the mouse retina reveals temporal ordering in development of rod vs. cone and ON vs. OFF circuits. The Journal of Comparative Neurology. 465 (4), 480-498 (2003).
- Johnson, J., et al. Vesicular neurotransmitter transporter expression in developing postnatal rodent retina: GABA and glycine precede glutamate. The Journal of Neuroscience. 23 (2), 518-529 (2003).
- Jüttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (31), e1333(2009).
- Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e190(2007).
- Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. The Journal of Comparative Neurology. 476 (3), 254-266 (2004).
- Huckfeldt, R. M., et al. Transient neurites of retinal horizontal cells exhibit columnar tiling via homotypic interactions. Nature Neuroscience. 12 (1), 35-43 (2009).
- Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in space and time using light sheet fluorescence microscopy. eLife. 9, 49779(2020).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
