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方法文章

一种利用患者来源的胶质瘤干细胞快速筛选胶质母细胞瘤潜在联合疗法的工作流程

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DOI：

10.3791/62312

⸱

2021年3月28日

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, School of Basic Medical Sciences, Nanjing Medical University, 2Institute for Brain Tumors & Key Laboratory of Rare Metabolic Diseases, Nanjing Medical University; Nanjing Medical University Affiliated Cancer Hospital; Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

胶质瘤干细胞（GSCs）是一类在胶质母细胞瘤（GBM）中起肿瘤起始、血管生成及药物抵抗等关键作用的少量癌细胞，而GBM是最常见且最具破坏性的原发性脑肿瘤。由于GSCs的存在，GBM对大多数单一靶向治疗药物表现出高度耐药性，因此需要高通量筛选方法来鉴定潜在的有效联合治疗方案。本实验方案描述了一种简便的工作流程，可用于快速筛选具有协同作用的潜在联合疗法。该工作流程主要包括建立荧光素酶标记的GSCs、制备基质胶包被的培养板、联合药物筛选、数据分析及结果验证等步骤。

摘要

胶质瘤干细胞（GSCs）是一类在胶质母细胞瘤（GBM）中起关键作用的少量癌细胞，参与肿瘤的发生、血管生成以及药物耐药性。GBM是最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤。GSCs的存在使得GBM对大多数单一靶向治疗药物高度耐药，因此需要高通量筛选方法来鉴定潜在的有效联合治疗方案。本实验方案描述了一种简便的工作流程，可用于快速筛选具有协同作用的潜在联合疗法。该工作流程主要包括建立荧光素酶标记的GSCs、制备基质胶包被的培养板、联合药物筛选、数据分析以及结果验证等步骤。

引言

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤类型。目前，接受最大限度治疗（包括手术、化疗和放疗联合治疗）的GBM患者总体生存期仍不足15个月，因此迫切需要开发新型且有效的GBM治疗方法。

胶质母细胞瘤（GBM）中胶质瘤干细胞（GSCs）的存在对传统治疗构成了重大挑战，因为这些具有干细胞特性的细胞在维持肿瘤微环境、介导药物耐药性以及肿瘤复发中发挥关键作用1。因此，靶向GSCs可能是治疗GBM的一种有前景的策略2。然而，GBM治疗中药物疗效面临的主要障碍之一是其高度异质性，包括但不限于基因突变差异、混合亚型、表观遗传调控以及肿瘤微环境的复杂性，这些因素均使其对治疗产生高度抵抗性。在经历多次临床试验失败后，科学家和临床研究人员意识到，单药靶向治疗可能无法有效控制GBM等高度异质性肿瘤的进展。相比之下，经过精心筛选的药物组合已因其能够协同增强彼此疗效而被证实有效，从而为GBM治疗提供了有希望的解决方案。

尽管存在多种方法可用于评估药物组合的药物相互作用，例如联合指数（CI, Combination Index）、最高单药效应（HSA, Highest Single Agent）以及Bliss值等3，4，这些计算方法通常基于多种浓度组合。事实上，这些方法虽能对药物相互作用提供明确的评估，但在高通量筛选中应用时往往非常耗时。为简化流程，本研究建立了一种筛选工作流程，用于快速鉴定来源于患者胶质母细胞瘤（GBM）手术活检样本的胶质瘤干细胞（GSCs）生长抑制性药物组合。该方法引入了一个敏感性指数（SI），用于反映预期联合效应与实际观测联合效应之间的差异，从而量化每种药物的协同作用，使潜在候选药物可通过SI排序被快速识别。同时，本方案展示了一个示例筛选过程，旨在从20种小分子抑制剂中鉴定出能够与替莫唑胺（temozolomide）协同增强抗胶质瘤效应的潜在候选药物；替莫唑胺是目前GBM治疗的一线化疗药物。

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方案

胶质母细胞瘤（GBM）标本来自一名患者，在获得南京医科大学第一附属医院人类研究伦理委员会的完全知情同意后，于常规手术期间采集。

1. 患者来源的胶质瘤干细胞的分离与培养

  1. 将新鲜的手术切除胶质母细胞瘤组织置于装有无菌 PBS 的 15 mL 离心管中，并将组织置于冰上保存，直至后续操作。
  2. 在生物安全柜中使用解剖剪将 GBM 组织剪切成直径约 0.5 至 1 mm 的小块，并用神经元基础培养基洗涤组织样本，以去除细胞碎片。
  3. 用 1 mg/mL 胶原酶 A 在 37 °C 下消化组织片段 30 分钟，并在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。
  4. 弃去上清液，用空白神经元基础培养基重悬沉淀，并在冰上通过反复吹打进行机械解离。
  5. 将混合物接种于超低吸附 6 孔培养板中，加入 GSC 培养基（配方见 表 1），在无菌细胞培养箱中、37 °C、5% CO2 和 90% 湿度条件下培养，直至神经球形成。
  6. 当神经球充分形成后，用移液器将其收集至 1.5 mL 微量离心管中，并在室温下以 800 × g 离心 5 分钟。
  7. 重悬沉淀，并将其分装至多个含有上述培养基的培养瓶中，用于维持原代 GSC 的生长。
    注：示例中使用的患者来源 GSC 来自一名 34 岁男性患者、WHO IV 级复发性 GBM 的手术活检组织。该 GSC 被命名为 XG387，用于后续实验。对上述 GSC 进行了基于 PCR 的支原体检测，以确认无支原体污染。本方案中所涉及的所有 GSC 实验均在 <15 代内完成。

2. 准备荧光素酶标记的GSCs

  1. 从培养基中收集GSCs，于室温下以70 × g 离心3分钟。
  2. 弃去上清液，在37 °C下用accutase消化细胞4分钟。使用200 µL枪头反复吹打，以解离并重悬细胞沉淀。
  3. 将细胞稀释至每孔2 × 105 个细胞，接种于12孔培养板中，过夜培养。
  4. 向每孔加入30 µL luciferase-EGFP病毒上清液（滴度>108 TU/mL），然后于25 °C下以1,000 × g 离心2小时。继续培养细胞过夜。
  5. 次日更换新鲜培养基，再继续培养48小时。
  6. 在荧光显微镜下观察细胞，确认出现GFP阳性细胞。
  7. 使用流式细胞分选仪分选并筛选出GFP荧光强度高的GSCs，进行后续培养。

3. 基于生物发光的细胞活力检测

  1. 用细胞外基质（ECM）混合物（例如 Matrigel）包被培养板：每孔加入 40 µL 浓度为 0.15 mg/mL 的 ECM 混合物，在 37 °C 下孵育 1 小时。去除多余的 ECM 混合物，并用 PBS 轻轻冲洗一次。
  2. 在 96 孔光学底板中，每孔分别加入含 15,000、10,000、8,000、6,000、4,000、2,000、1,000 和 500 个 XG387-Luc 细胞的 100 µL 培养基，同时设置仅含 100 µL 空白培养基的对照孔，每组设 6 个复孔，于 37 °C 培养过夜。
  3. 移除上清液，每孔加入含 150 ng/µL D-荧光素酶的 50 µL 培养基，在 37 °C 下孵育 5 分钟。
  4. 使用 IVIS Spectrum 成像系统对培养板中的细胞生物发光进行成像。利用内置软件在感兴趣区域（ROI）创建多个圆形区域，并对细胞生物发光信号进行定量分析。

4. 替莫唑胺处理及联合用药筛选

  1. 按照上述方法在处理前预先包被四块96孔板。
  2. 将XG387-Luc细胞以每孔100 µL培养基中接种1,000个细胞的密度接种至96孔光学底板的各孔中，并过夜培养细胞。
  3. 提前从储备液中配制替莫唑胺和靶向药物。为单药处理配制一系列浓度的替莫唑胺培养基溶液，浓度分别为800 µM、600 µM、400 µM、300 µM、200 µM、100 µM和50 µM。分别将替莫唑胺和靶向药物的储备液用培养基稀释，得到组合药物筛选所需的终浓度为200 µM和2 µM（表2）。
  4. 当大多数胶质瘤干细胞（GSCs）贴附于培养板底部时，吸除培养基；每种处理设置三个技术重复，向各孔加入上述配制好的含替莫唑胺的培养基。
  5. 为进行替莫唑胺处理及药物组合筛选，吸除空白培养基，每种处理设置三个技术重复，向各孔分别加入含200 µM替莫唑胺、或2 µM靶向药物、或两者联合的上述配制培养基。
  6. 将所有培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育3天。
  7. 吸除含药物的培养基，向每孔加入50 µL含150 ng/µL D-荧光素酶底物（D-luciferin）的空白培养基，并在37 °C孵育5分钟。
  8. 使用IVIS Spectrum成像系统对培养板中的细胞生物发光进行成像。利用内置软件创建多个圆形感兴趣区域（ROIs），并对细胞生物发光信号进行定量分析。

5. 替莫唑胺与UMI-77在XG387-Luc和XG328-Luc细胞系中的联合处理

  1. 按照上述方法，在处理前预先包被三块96孔板。
  2. 将XG387-Luc和XG328-Luc细胞以每孔100 µL培养基中接种1,000个细胞的密度分别接种至96孔光学底板的各孔中，并过夜培养细胞。
  3. 在培养基中配制包含600 µM、400 µM、300 µM、200 µM、100 µM、50 µM和0 µM替莫唑胺的浓度梯度，以及包含6 µM、4 µM、3 µM、2 µM、1 µM、0.5 µM和0 µM UMI-77的浓度梯度，用于六乘六剂量滴定矩阵处理。
  4. 当大多数GSCs已贴附于孔板底部时，移除空白培养基；将上述配制好的培养基加入各孔，每种处理设三个技术重复。
  5. 将这些孔板在37 °C、5% CO2条件下孵育3天。
  6. 移除含药物的培养基；向每孔加入50 µL含有150 ng/µL D-荧光素的空白培养基，并在37 °C孵育5分钟，以进行生物发光检测。

6. 数据分析

  1. 根据图2A中的公式计算替莫唑胺和靶向药物的敏感性指数（SI）评分。
    注：SI评分用于量化添加另一种药物的影响。其范围为-1至+1，正值表示替莫唑胺具有协同效应。
  2. 使用CompuSyn软件计算替莫唑胺与UMI-77之间的联合指数（CI）值，以分析它们的联合相互作用。CI值<1表示协同作用；CI值>1表示拮抗作用。
  3. 使用Combenefit软件计算替莫唑胺与UMI-77之间的高单药效应（HSA）值。HSA值反映联合抑制效果。HSA值>0表示协同作用，HSA值<0表示拮抗作用。

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结果

XG387 细胞在 表 1 所述培养基中，于超低吸附 6 孔培养板或未包被的培养板中形成了神经球5（图 1A）。首先，进行了一项测试以验证 XG387-Luc 细胞的生物发光强度是否与细胞数量成正比。如 图 1B 所示，生物发光强度随细胞密度的增加而呈比例上升，二者之间具有良好的线性相关性（Pearson r = 0.9872；p < 0.0001；图 1C）。由于荧光素酶标记细胞的生物发光信号易于且快速检测，因此该方法可作为测定活存胶质瘤干细胞（GSCs）密度的简便手段。接下来评估了替莫唑胺的抗增殖活性。如 图 1D 所示，400 µM 替莫唑胺对 XG387-Luc 细胞的增殖抑制率约为 20%，表明其具有一定作用效果，但其抗胶质母细胞瘤（GBM）效应仍有提升空间。因此，选择 200 µM 作为后续联合药物筛选...

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讨论

本研究描述了一种利用患者来源的胶质瘤干细胞（GSCs）来鉴定胶质母细胞瘤（GBM）潜在联合治疗方案的实验流程。与传统的协同/相加效应评估模型（如Loewe、BLISS或HSA方法）不同，该流程采用一种简单且快速的工作方法，无需像传统方法那样以全因子设计方式将药物组合在多个浓度下进行测试。在此工作流程中，引入了敏感性指数（SI），该指数源于一项评估siRNA与小分子抑制剂联用时致敏效应的研究，用于量化两种小分子抑制剂之间的协同药物效应7。SI值的范围为-1至1，正值表示药物之间存在致敏效应。SI值越高，表明协同作用越强。尽管仅凭SI值尚不足以明确判断药物相互作用的类型（协同、相加或拮抗），但排名靠前的候选药物与目标药物产生协同作用的可能性较高，因此值得进一步验证。相比之下，目前大多数高通量药物组合筛选方法仍然耗时费力，且涉及复杂的算法8,9。

为验证该方法的可行性，我们进行了一次小规模的测试筛选。结果表明，在20种靶向药...

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披露

作者声明无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢国家自然科学基金（81672962）、江苏省创新团队计划基金以及东南大学与南京医科大学联合重点项目基金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
B-27Gibco17504-04450X
EGFGibcoPHG031320 ng/ml
FGFGibcoPHG026320 ng/ml
Gluta MaxGibco35050061100X
NeurobasalGibco211030491X
青霉素-链霉素HyCloneSV30010P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
丙酮酸钠Gibco2088876100 mM
表 1. GSC 完全培养基的 配 方 。  
ABT-737MCE选择性 BH3 模拟物 Bcl-2 、Bcl-xL 和 Bcl-w 抑制剂
Adavosertib (MK-1775)MCEWee1 抑制剂
AxitinibMCE多靶点酪氨酸激酶抑制剂
AZD5991MCEMcl-1 抑制剂
A 83-01MCETGF-β I 型受体 ALK5 激酶的高效抑制剂
CGP57380Selleck高效 MNK1 抑制剂
Dactolisib (BEZ235)Selleck双重 ATP 竞争性 PI3K 和 mTOR 抑制剂
DasatinibMCE双重 Bcr-Abl 和 Src 家族酪氨酸激酶 抑制剂
ErlotinibMCEEGFR 酪氨酸激酶抑制剂
GefitinibMCEEGFR 酪氨酸激酶 抑制剂
LinifanibMCE多靶点 VEGFR 和 PDGFR 家族抑制剂
MasitinibMCE c-Kit 抑制剂
ML141SelleckCdc42 GTP酶 的非竞争性抑制剂 
OSI-930MCEKit、KDR 和 CSF-1R 的多靶点抑制剂 
PalbociclibMCE选择性 CDK4 和 CDK6 抑制剂
SB 202190MCE选择性 p38 MAP 激酶 抑制剂
Sepantronium bromide (YM-155)MCESurvivin 抑制剂
TCS 359Selleck高效 FLT3 抑制剂
UMI-77MCE选择性 Mcl-1 抑制剂
4-羟基他莫昔芬（Afimoxifene）Selleck选择性 雌激素受体（ER） 调节剂
表 2. 测试筛选中使用的 20 种靶向药物的信息。所有药物均为靶点选择性小分子抑制剂。表中列出了各药物的供应商、名称及靶点。

参考文献

  1. Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes & Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).
  2. Binello, E., Germano, I. M. Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors. Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).
  3. Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
  4. Di Veroli, G. Y., et al. Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations. Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).
  5. Shi, Y., et al. Ibrutinib inactivates BMX-STAT3 in glioma stem cells to impair malignant growth and radioresistance. Science Translational Medicine. 10 (443), 1-13 (2018).
  6. Tan, X., et al. Systematic identification of synergistic drug pairs targeting HIV. Nature Biotechnology. 30 (11), 1125-1130 (2012).
  7. Jansen, V. M., et al. Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer. Cancer Research. 77 (9), 2488-2499 (2017).
  8. Malyutina, A., et al. Drug combination sensitivity scoring facilitates the discovery of synergistic and efficacious drug combinations in cancer. PLoS Computational Biology. 15 (5), 1006752(2019).
  9. He, L., et al. Methods for High-throughput drug combination screening and synergy scoring. Cancer Systems Biology. 1711, 351-398 (2018).
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