快速筛选工作流程，利用患者衍生胶质瘤干细胞确定GBM的潜在组合疗法

摘要

胶质瘤干细胞 （GSC） 是癌症细胞的一小部分，在肿瘤启动、血管生成和胶质母细胞瘤 （GBM） 中的耐药性方面起着至关重要的作用，胶质母细胞瘤 （GBM） 是最普遍和最具破坏性的原发性脑肿瘤。GSC 的存在使 GBM 对大多数单个目标制剂非常耐火，因此需要高通量筛查方法来识别潜在的有效组合治疗。该协议描述了一个简单的工作流程，使潜在的组合疗法与协同相互作用的快速筛选。此工作流程的一般步骤包括建立带有葡萄糖标记的 GSC、准备母体涂层板、组合药物筛选、分析和验证结果。

摘要

胶质瘤干细胞 （GSC） 是癌症细胞的一小部分，在肿瘤启动、血管生成和胶质母细胞瘤 （GBM） 中的耐药性方面起着至关重要的作用，胶质母细胞瘤 （GBM） 是最普遍和最具破坏性的原发性脑肿瘤。GSC 的存在使 GBM 对大多数单个目标制剂非常耐火，因此需要高通量筛查方法来识别潜在的有效组合治疗。该协议描述了一个简单的工作流程，使潜在的组合疗法与协同相互作用的快速筛选。此工作流程的一般步骤包括建立带有葡萄糖标记的 GSC、准备母体涂层板、组合药物筛选、分析和验证结果。

引言

胶质母细胞瘤 （GBM） 是原发性脑肿瘤中最常见和最具有攻击性的类型。目前，接受最大治疗（手术、化疗和放疗相结合）的GBM患者的总体存活期仍不足15个月:因此， 迫切需要新颖有效的 Gbm 疗法。

胶质瘤干细胞（GSC）在GBM中的存在对常规治疗构成相当大的挑战，因为这些干细胞在维持肿瘤微环境、耐药性和肿瘤复发¹方面起着枢轴作用。因此，针对GSC可能是GBM治疗²的一个有希望的战略。然而，GBM药物疗效的一个主要缺点是其异质性，包括但不限于基因突变、混合亚型、表观遗传调节和肿瘤微环境的差异，这使得它们对治疗非常耐火。经过多次失败的临床试验，科学家和临床研究人员意识到，单一药物靶向治疗可能无法完全控制高异质性癌症（如GBM）的进展。然而，经过精心挑选的药物组合通过协同提高彼此的效果，已批准其有效性，从而为GBM治疗提供了一个有希望的解决方案。

虽然有许多方法来评估药物组合的药物-药物相互作用，如CI（组合指数）、HSA（最高单一剂）和Bliss值等^3、4，但这些计算方法通常基于多个浓度组合。事实上，这些方法可以提供药物-药物相互作用的肯定评估，但如果应用于高通量筛查，可能会非常费力。为了简化这一过程，开发了一个筛选工作流程，用于快速识别抑制GCS生长的潜在药物组合，这些组合源自患者GBM的外科活检。该方法引入了反映预期组合效应和观察到的组合效应差异的灵敏度指数 （SI），以量化每种药物的协同效应，因此 SI 排名可以轻松识别潜在候选者。同时，本协议演示了一个示例屏幕，以识别在20种小分子抑制剂中，能够与特莫佐洛米德（GBM治疗的一线化疗）协同抗胶质瘤效应的潜在候选者。

方案

GBM标本是在获得南京医科大学第一附属医院人类研究伦理委员会的充分知情同意后，在一次常规手术中从患者身上采集的。

1. 患者衍生的GCS的隔离和文化

1. 将新鲜手术切除的胶质母细胞瘤组织放入充满无菌 PBS 的 15 mL 离心机管中，并将组织储存在冰上，直到进一步手术。
2. 使用解剖剪刀将GBM组织切成直径约0.5至1毫米的碎片，并用神经元基底介质清洗组织标本，以清除生物安全柜中的细胞碎片。
3. 在 37 °C 下以 30 分钟 1 毫克/mL 拼贴剂 A 消化组织片段，在 4°C 下以 400 x g 为离心机在 5 分钟内消化离心机。
4. 取出超高颗粒，用空白的神经元基底介质悬浮颗粒，并通过在冰上重复管道机械地分离颗粒。
5. 在 37 °C 的无菌细胞培养器中培养充满 GSC 培养介质的超低附件 6 井培养板中的混合物（见食谱 表 1）， 在 37 °C 下具有 5% CO₂ 和 90% 湿度，直到神经球形成。
6. 在足够的神经圈形成时，使用移液器在 1.5 mL 微管中收集它们，在室温下以 800 x g 离心机收集 5 分钟。
7. 重新使用颗粒，将其拆分成几个烧瓶，其中填充了上述培养基，用于维持主要的 GSC。
   注:本例中使用的患者衍生的GCS来自世卫组织IV级复发性GBM患者一名34岁男性患者的外科活检。GSC被命名为XG387作为未来的实验。对上述GC进行了基于PCR的支原体测试，以确认不存在支原体污染。本议定书中使用的所有涉及GSC的实验都是在15段<进行的。

2. 准备带有卢西费拉斯标记的 GSC

1. 从中等培养物中收集 GSC，并在室温下以 70 x g 离心 3 分钟。
2. 取出超高分子，在37°C下用加苏酶消化细胞4分钟。 反复使用 200 μL 尖端和移液器分离和重新悬念细胞颗粒。
3. 将细胞稀释到12井培养板中每口井2×10⁵ 个细胞，并在一夜之间培养细胞。
4. 在板中的每口井中加入 30 μL 荧光酶-EGFP 病毒超高分子（滴答> 10⁸ TU/mL），然后在 25 °C 下以 1，000 x g 为 2 h 离心离心。 一夜之间培养细胞。
5. 第二天刷新介质，再培养细胞48小时。
6. 在荧光显微镜下观察细胞，以确认GFP阳性细胞的外观。
7. 使用流细胞分拣器对具有高 GFP 荧光的 GSC 进行排序和选择，以进一步培养细胞。

3. 基于生物发光的细胞生存能力测量

1. 涂有细胞外基质 （ECM） 混合物（例如，马特里格尔）:在每个油井中加入 40 微升 0.15 毫克/mL ECM 混合物，并在 37 °C 下孵育板 1 小时。 取出多余的ECM混合物，用PBS轻轻冲洗一次。
2. 添加 100 μL 文化介质，包含 15，000， 10，000、8，000、6，000、4，000、2，000、1，000 和 500 XG387-Luc 细胞以及 100 μL 空白介质，在 96 井光学底板中对每口井进行 6 次复制，并在 37 °C 下隔夜培养细胞。
3. 取出超高酸剂，在每个井中加入含有150 ng/μL D-luciferin的50微升培养介质，并在37°C下孵育细胞5分钟。
4. 使用 IVIS 频谱成像系统拍摄板中的细胞生物发光图像。使用内置软件创建感兴趣的区域 （ROI） 的多个圆形区域，并量化细胞生物发光。

4. 特莫佐洛米德治疗和组合筛查

1. 治疗前，预涂上上述四个96井板。
2. 种子XG387-Luc细胞在密度为1000个细胞的100微升培养介质进入每口井的96井光学底板和培养细胞过夜。
3. 提前从库存解决方案中准备特莫佐洛米德和目标代理。在培养中准备由 800 μM、600 μM、400 μM、300 μM、200 μM、100 μM 和 50 μM 特莫佐洛米德组成的浓缩系列，用于单代理治疗。稀释特莫佐洛米德和定向剂在库存溶液中分别在培养基中，获得200微米和2微米的最后浓度用于组合药物筛选（表2）。
4. 当大多数 GSC 粘附在板的底部时，移除培养介质;将上述含有特莫佐洛米德的介质添加到每口井中，每次处理可进行三次技术复制。
5. 要治疗特莫佐洛米德和筛选药物组合，请删除空白介质，并添加上述准备的介质，其中含有 200 μM 特莫佐洛米德或 2 μM 靶向剂，或将两者组合到每个井中，每次治疗可进行三次技术复制。
6. 在 37 °C、5% 二氧化碳下孵育所有板材 3 天。
7. 取出含药物介质，在每个油井中加入含有 150 ng/μL D-luciferin 的 50 μL 空白介质，并在 37 °C 下孵育细胞 5 分钟。
8. 使用 IVIS 频谱成像系统拍摄板中的细胞生物发光图像。使用内置软件创建多个圆形 ROI 并量化细胞生物发光。

5. XG387-Luc 和 XG328-Luc 细胞系中特莫佐洛米德和 UMI-77 的组合处理

1. 在治疗前，预涂上上述三个 96 井板。
2. 种子XG387-Luc和XG328-Luc细胞的密度分别为1000个细胞，在100微升的培养介质中进入每个96井光学底板的井中，并在一夜之间培养细胞。
3. 准备由 600 μM、400 μM、300 μM、200 μM 组成的浓度系列， 100 μM、50 μM 和 0 μM 特莫佐洛米德和由 6 μM、4 μM、3 μM、2 μM、1 μM、0.5 μM 和 0 μM UMI-77 组成的浓缩系列，用于六乘六剂量的配给矩阵治疗。
4. 当大多数 GSC 粘附在板的底部时，移除空白介质;将上述准备的介质添加到每口井中，每次处理可进行三次技术复制。
5. 在 37 °C、5% CO₂下孵育这些板 3 天。
6. 取出含药物介质;在每个油井中加入50微克的空白介质，其中含有150 ng/μL D-luciferin，并在37°C下孵育细胞5分钟，用于生物发光测量。

6. 数据分析

1. 根据 图2A中的公式计算特莫佐洛米德和靶向剂的灵敏度指数（SI）分数。
   注:SI 分数是量化添加另一种药物的影响。它的范围从 -1 到 +1， 正值表示特莫佐洛米德协同效应.
2. 使用 CompuSyn 软件计算特莫佐洛米德和 UMI-77 之间的组合索引 （CI） 值，以分析它们的组合交互。CI 值 <1 表示协同作用:CI 值>1 表示对抗。
3. 使用康贝内菲特软件计算特莫佐洛米德和 UMI-77 之间的高单一代理 （HSA） 值。HSA 值表示组合抑制作用。HSA 值 >0 表示协同作用，HSA 值<0 表示对抗。

结果

XG387细胞在表1中描述的培养基中形成神经球，在超低附件6井培养板或非涂层板^5（图1A）中形成。首先，进行了一项测试，以检查XG387-Luc细胞的生物发光强度是否与细胞数成正比。如图1B所示，生物发光强度与细胞密度成正比增加，导致它们之间的线性校正（Pearson r = 0.9872;p <0.0001;图1C）。由于荧光素标记细胞的生物发光是简单和快速测量，这提供了一个简单的方法来测量可行的GCC的密度。接下来，评估了特莫佐洛米德的反增殖活性。如图1D所示，400微米特莫佐洛米德导致XG387-Luc细胞约20%的增殖抑制，这表明它是有用的，但它的抗GBM效果可以进一步提高。选择 200 μM 的浓度进行组合筛选。

举个例子，20种靶向选择性小分子抑制...

讨论

在本研究中，描述了一种可用于使用患者衍生的 GSC 确定 GBM 潜在组合疗法的协议。与标准协同/增殖性指标模型（如 Loewe、BLISS 或 HSA 方法）不同，使用了简单而快速的工作流程，不需要将药物对以全因子方式以全因子方式与传统方法以多个浓度组合。在此工作流中，引入SI（敏感性指数），该指数源于一项研究，以评估SIRNA与小分子抑制剂相结合的敏感效应，以量化两种小分子抑制剂的协同药物效应^。SI 值的范围从 -1 到 1，正 SI 值表示每种药物之间的敏感效果。SI 值实现得越高，协同作用就越强。虽然仅凭SI值无法对药物相互作用的类型（协同、添加剂或对抗性）提供肯定的答案，但这些排名靠前的候选者极有可能与感兴趣的药物协同，因此值得进一步验证。相比之下，目前大多数高通量药物组合筛选方法仍然费力，涉及困难的算法^8，9。

为了证明这种方法的可行性，进行了小规模的测试屏幕。因此，有可能确定UMI-77，一种选择性的MC...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
神经基底	Gibco	21103049	1X
青霉素-链霉素	HyClone	SV30010	P： 10,000 单位/ml    S： 10,000 ug/ml
丙酮酸钠	Gibco	2088876	100 mM
表 1.这 配方 GSC 完全培养基。
ABT-737	MCE		选择性和 BH3 模拟物 Bcl-2， Bcl-xL 和 Bcl-w 抑制剂
Adavosertib （MK-1775）	MCE		Wee1 抑制剂
阿昔替尼	MCE		多靶点酪氨酸激酶抑制剂
AZD5991	MCE		Mcl-1 抑制剂
A 83-01	MCE		TGF-β; I 型受体的强效抑制剂 ALK5 激酶
CGP57380	Selleck		Protent MNK1 抑制剂
Dactolisib （BEZ235）	Selleck		Dual ATP 竞争性 PI3K 和 mTOR 抑制剂
达沙替尼	MCE		双重 Bcr-Abl 和 Src 家族酪氨酸激酶 抑制剂
厄洛替尼	MCE		EGFR 酪氨酸激酶抑制剂
Gefitinib	MCE		EGFR 酪氨酸激酶 抑制剂
Linifanib	MCE		多靶点抑制剂VEGFR 和 PDGFR
Masitinib	MCE		抑制剂家族 c-Kit
ML141	Selleck		非竞争性抑制剂 Cdc42 GTP 酶
OSI-930	MCE		Kit、KDR 和 CSF-1R 的多靶点抑制剂
Palbociclib	MCE		选择性 CDK4 和 CDK6 抑制剂
SB 202190	MCE		选择性 p38 MAP 激酶 抑制剂
Sepantronium bromide （YM-155）	MCE		Survivin 抑制剂
TCS 359	Selleck		强效 FLT3 抑制剂
UMI-77	MCE		选择性 MCL-1 抑制剂
4-羟基他莫昔芬（Afimoxifene）	Selleck		选择性 雌激素受体 （ER） 调制器
表 2.测试屏幕中使用的 20 个目标代理的信息。所有这些都是靶向选择性小分子抑制剂。表中给出了提供者、名称和目标。