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小分子微晶电子衍射

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DOI：

10.3791/62313

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2021年3月15日

 , 
1Howard Hughes Medical Institute, University of California Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, University of California Los Angeles, 3Department of Physiology, University of California Los Angeles

本文内容

摘要

本文介绍了我们实验室为微晶电子衍射（MicroED）实验制备小分子晶体粉末所建立的操作流程。

摘要

本文描述了一种用于微晶电子衍射（MicroED）实验中小分子样品制备的详细方案。MicroED 技术利用标准的冷冻电子显微镜（cryo-EM）设备，用于解析蛋白质和小分子的结构。近年来，该方法已成功实现对小分子、多肽、可溶性蛋白以及膜蛋白的高分辨率结构测定。本文以药物卡马西平（carbamazepine）为例，介绍了小分子药物样品载网的制备方案，并提供了用于样品筛选和数据采集的实验流程。整个流程中的其他步骤，如数据整合、结构解析与精修，将在其他文献中另行介绍。小分子载网的制备时间预计少于 30 分钟。

引言

微晶电子衍射（MicroED）是一种电子冷冻显微镜（cryo-EM）方法，可用于从亚微米尺度的晶体中解析原子分辨率结构1,2。将晶体样品施加到标准的透射电子显微镜（TEM）载网上，并通过浸入液态乙烷或液氮中进行快速冷冻。随后将载网装载至在低温条件下运行的透射电子显微镜中。在载网上定位晶体，并初步筛选其衍射质量。对部分筛选出的晶体进行连续旋转的MicroED数据采集，数据通过快速相机以电影形式记录3。这些电影数据被转换为标准的晶体学格式，并以与X射线晶体学实验几乎相同的方式进行处理4。

MicroED 最初被开发用于研究蛋白质微晶1,2。蛋白质晶体学中的一个瓶颈是难以生长出适用于传统同步辐射X射线衍射实验的大尺寸、高度有序的晶体。由于电子与物质的相互作用强度比X射线高出数个数量级，因此产生可检测衍射信号所需的晶体尺寸限制显著减小5。此外，电子的弹性散射与非弹性散射事件之比更为有利，表明在总体辐射剂量更低的情况下即可收集到更多有用的数据5。持续的技术进步使得从最具挑战性的微晶中收集 MicroED 数据成为可能6,7,8,9。

最近，MicroED 已被证明是一种强大的工具，可用于测定看似无定形材料中小分子药物的结构10,11,12,13。这些粉末可直接来自购买的试剂瓶、纯化柱，甚至可由药片研磨成细粉获得10。这些粉末肉眼观察呈无定形，但其成分可能完全由纳米晶体构成，或仅在大量非晶态、无定形组分中含微量纳米晶沉积物。将样品施加至载网上操作简便，后续的晶体识别、筛选及数据采集步骤在不久的将来甚至可能实现自动化14。尽管他人可能采用不同的样品制备与数据采集方法，本文详述了Gonen实验室开发并用于小分子样品MicroED分析及数据采集的实验方案。

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方案

1. 小分子样品的制备

  1. 取少量（0.01 - 1 mg）粉末、液体或固体样品，转移至小瓶或离心管中。
  2. 对于已是粉末形态的样品，在需要使用前用盖子密封离心管。在进行方法1（步骤3）或方法2（步骤4）前，需先将液体样品干燥转化为粉末。
    ​注意：溶解于液体中的样品可采用下文的方法3（5.X）

2. 准备透射电镜载网

注意：某些带有自动进样系统的透射电子显微镜（TEM）要求在将载网装入TEM镜筒前，先将载网固定并放入样品盒中。固定过程是指将3 mm的TEM载网物理固定在金属环内，以便自动进样系统能够操作。此步骤及后续步骤可使用普通TEM载网或已固定的TEM载网进行。在这些实验中，若提前完成载网固定，通常更便于操作。

  1. 将塑料薄膜包裹在玻璃盖玻片的一端。
  2. 将透射电镜（TEM）载网放置在盖玻片顶部的薄膜上，碳膜面朝上。在光线下辨认载网的两面：铜面具有金属光泽，而碳面呈暗褐色（图1C，D）。对于带夹环的载网，碳膜面应朝向夹环的平面一侧。
  3. 将带有载网的盖玻片放入电晕放电室中，使用负极设置在15 pA条件下进行约30秒的电晕放电处理。在向载网加样前，将载网连同盖玻片一起存放于内衬滤纸的玻璃培养皿中。

3. 通过制备均匀的细粉来将样品施加到载网上（方法1）

  1. 使用镊子从带盖的培养皿中取出一个经辉光放电处理的透射电镜载网，将其碳膜面朝上放置在圆形滤纸上。
  2. 用小刮勺取极少量粉末（约 0.1 mg），置于滤纸上紧邻透射电镜载网旁的一块小方形玻璃盖玻片上。再取另一块小方形玻璃片或盖玻片覆盖在粉末上方。
  3. 用手指轻轻来回摩擦两块玻璃片，将粉末研磨成细粉。
  4. 将盖玻片倾斜并置于滤纸上的辉光放电处理过的透射电镜载网上方，继续在距载网几厘米高的位置相互摩擦盖玻片（图 1）。
  5. 观察粉末是否飘落至载网上。移开两片盖玻片中的一片，暴露已研细的粉末，然后用一片滤纸轻轻将细粉从盖玻片上刷下，使其落在透射电镜载网上（图 1）。

4. 通过将样品施加到载网上来施加样品 "振荡" 方法（方法2）

  1. 用一对镊子夹取一个载网，将其放入装有粉末样品的小瓶或试管中。用塑料盖盖紧小瓶，确保在振荡时无样品逸出。
  2. 用手握住小瓶，振荡约10–30秒，使粉末与载网充分运动接触。
  3. 将小瓶中的内容物倾倒至一张圆形滤纸上。用镊子夹住载网边缘，轻轻在滤纸上敲击载网边缘，以去除载网上多余的材料。
    ​注意：根据小瓶类型和尺寸的不同，也可使用镊子直接取出透射电镜载网，而无需倾倒内容物。

5. 使用蒸发法将样品施加到载网上（方法3）

  1. 将载网（有夹子或无夹子）放置在圆形滤纸的中心，碳膜面朝上，铜面朝下。
  2. 使用10 µL气密性注射器，将少量溶解的样品（约1–3 µL）滴加到载网的碳膜面上。
  3. 轻轻将带有载网的滤纸移入真空干燥器中。盖上盖子并开启真空，使载网在真空条件下干燥，最长可放置一天。
  4. 关闭真空，让干燥器通气5分钟。通气可避免打开盖子时载网移动或飞出。

6. 冷冻载网并将其装入透射电子显微镜

  1. 使用镊子夹住透射电镜（TEM）载网的边缘，确保镊尖不会刺穿任何网格方格。将载网抬高至滤纸上方1 - 2 cm处，并使载网与下方滤纸呈90°角。在保持牢固夹持的同时轻轻敲击镊子，以去除任何松散的粉末。
  2. 通过手动将夹有载网的镊子尖端直接插入液氮容器中，对载网进行速冻。该容器通常为透射电镜的载网装载站，但也可使用其他安全容器，例如耐液氮的保温瓶，用于转移或储存。液氮温度为-196 °C。
  3. 在进行后续操作前，需等待载网和镊子停止沸腾。
  4. 在液氮或氮气蒸气环境中，将载网放入样品 holder 中，碳膜面朝向应确保样品先于碳支持膜被电子束照射。
  5. 将样品 holder 装入透射电镜中，并确保载网始终维持在液氮温度条件下。
    1. 对于自动进样系统，将夹好的载网放入置于液氮冷却容器中的盒式卡匣内。该卡匣随后转移至转运容器中，以便自动进样机器人接收卡匣，同时确保样品在自动进样器与镜筒之间转运过程中的安全。
    2. 对于侧插式透射电镜装置，将载网固定于商用侧插式TEM样品 holder 上。此类 holder 配备有样品制备腔室，可通过填充液氮实现载网向 holder 的转移，而不会使样品升温。侧插式 holder 可直接插入透射电镜中，样品固定于其末端。

7. 收集 MicroED 数据

  1. 定位与筛选纳米晶体
    1. 打开透射电镜柱阀门。使用手控面板将放大倍数调节至尽可能最低。调节手控面板上的强度旋钮，使荧光屏上出现一个圆形且明亮的区域，以此找到电子束。
    2. 使用适当的软件以低倍率（50 - 300x）拍摄全网格图谱14,15,16 (图2）。在采集高分辨率MicroED数据之前，确保显微镜在低倍和高倍成像下均已良好对齐。
    3. 识别无破损碳膜且在膜上具有可见黑色或深色材料/颗粒的网格方格图2）。通过手控面板上的操纵杆进行物理操作，或在采集的图谱上进行虚拟操作，浏览网格，寻找未破损且含有微晶的网格区域。
    4. 将每个方格的中心点添加到待考察的网格位置列表中。这些位置可被记录在实验笔记本中，或输入显微镜用户界面，或导入显微镜自动化软件中。
    5. 将放大倍数增加至500–1,300倍，并在每个已存储的网格位置调整齐焦高度，将保存的Z值更新为7.1.4中记录的位置。
    6. 在更高倍数下，通过荧光屏或快速相机在网格上寻找微小的黑色斑点或颗粒。良好的样品在高倍镜下通常具有清晰的边缘，表明存在晶体有序结构。
    7. 将已定位的潜在晶体移至屏幕中心，并增加放大倍数，使透射电子显微镜进入高倍放大模式。
      注：不同仪器上对此模式的称呼可能为高倍率、Zoom2 或 SA 模式，通常对应 3,000 倍或更高的放大倍数。
    8. 插入选区光阑。调整光阑尺寸，确保选区范围略大于晶体。图3).
    9. 通过按下透射电子显微镜手控面板上的衍射模式按钮切换至衍射模式，并确保荧光屏已插入。调节放大倍数旋钮以调整相机长度，使边缘分辨率至少达到1 Å。
      注意：在进行MicroED实验之前，应由服务工程师使用金制华夫格栅或已知样品对衍射长度进行校准。
    10. 调节衍射聚焦，使中心斑点尽可能锐利且微小。使用衍射偏移旋钮，将中心光束移至荧光屏的中心位置。
    11. 插入光束挡板，并确保光束位于其后方。抬起荧光屏。在相机上进行一次短时间（约1秒）曝光（图4).
    12. 检查相应的衍射图样。用于收集完整数据集的理想候选晶体应显示出清晰且呈规则行列排列的衍射点，衍射分辨率应达到2 Å以上，最好至少达到1 Å。图4). 在透射电子显微镜用户界面中保存晶体坐标，或将其记录下来。
    13. 对当前网格方格中所有感兴趣的潜在晶体重复进行衍射筛选。
  2. 数据采集
    1. 将筛选出的晶体在高倍镜下居中放置于视野中央 放大倍数（> 1,000倍）。使用自动程序或手动调节晶体的等心高度。
    2. 插入7.1.8节中确定的最适合晶体尺寸和形状的选区光阑图3）。将载物台向负方向和正方向倾斜，直至图像被网格条纹遮挡（图3记录这些角度以供数据采集使用。
    3. 确定覆盖数据集总旋转角度范围所需的帧数。通常每个帧的角度范围为 0.5–1.0°，每 1 至 5 秒读取一帧，具体取决于相机的灵敏度。例如，从 -30° 旋转至 +30°，以 1°/s 的恒定速率旋转-1 每1秒读取一帧，共需要60帧。
    4. 考虑到样品台总倾斜角度范围最大为 -72° 至 +72°，开始以 1°/s 的恒定速率旋转样品台-1 然后在采用卷帘快门读出模式的现代相机上每隔1秒开始读取数据视频 1）。该过程可手动完成，也可使用透射电子显微镜专用软件进行。
      1. 通过显微镜用户界面或专用软件设置旋转速率，指定最大倾斜速度的百分比及停止条件。在本研究中，该速率为 0.3° s-1 针对每台显微镜，需独立验证最大速度的每个百分比设置。
        注意：此处倾斜和相机数据采集是独立设置的，但软件程序14 可以协调此操作以简化流程。
      2. 大多数情况下，由于载物台处于加速或减速至目标旋转速度的过渡阶段，在指定楔形区域的每侧大约舍弃1°的范围作为无效时间。
    5. 以单帧图像或图像堆栈的形式，将数据保存为多种格式（视频 1).
    6. 使用 MicroED 工具（可在此处获取：https://cryoem.ucla.edu）将这些衍射图转换为典型的晶体学格式。以 SMV 格式保存的衍射图像可直接通过已记录的流程进行处理 晶体学软件17,18.

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结果

MicroED 是一种利用电子与物质之间强相互作用的冷冻电镜方法，能够用于研究极其微小的晶体12,13。完成这些步骤后，预期将获得一份以晶体学格式记录的、来自微晶的衍射电影数据（Movie 1）。此处以卡马西平为例进行该技术的演示12。结果显示，从透射电镜载网上识别出的一个卡马西平微晶获得了连续旋转的 MicroED 数据集（Movie 1）。理想的数据集在每一帧中应呈现强度高、清晰且未弥散或分裂的衍射点，并且每帧仅显示一个晶格，可通过逐帧播放电影轻松追踪19。这些数据可使用标准X射线晶体学软件轻松完成指标化、积分和缩放处理4。当晶体发生破裂时，可观察到分裂的衍射点，此时同一晶体的两个取向接近对齐但并未完全重合19。多晶格现象也可能出现，尤其在这些小分子晶体中，多个...

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讨论

样品制备通常是一个迭代过程，在筛选和数据收集阶段之后进行优化。对于小分子样品，通常可以首先尝试不进行辉光放电处理载网的制样方法，因为许多药物具有疏水性10,11。如果载网上纳米晶体沉积过少，建议在首次辉光放电处理载网后再次尝试。有时，由冻干粉末形成的晶体可能过大或过厚，难以获得高质量的数据。在此情况下，可尝试从较大晶体的边缘或较薄区域收集数据。若此方法仍存在困难，则可能需要使用更粗糙的表面（如研钵和研杵）将粉末研磨至更细的粒度。

MicroED 数据通常在透射电子显微镜（TEM）处于微探针模式下进行采集4,20。在此模式下，对应于 0.01 e- Å-2 s-1 曝光速率的 TEM 电子束直径通常约为 10 µm，远大于典型的微晶尺寸1<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Gonen 实验室由霍华德·休斯医学研究所的资金支持。本研究由美国国立卫生研究院 P41GM136508 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1-1.5 mL 离心管Fisher Scientific14-282-300任何小瓶或试管均可使用。
Autogrid 夹子Thermo-Fisher1036173MicroED 实验无需使用带夹子的载网。但若使用配备自动进样系统的 Thermo-Fisher 透射电镜，则必须使用。
Autogrid C 型环Thermo-Fisher1036171
卡马西平（Carbamazapine）SigmaC4024-1G任何用量均足以完成本实验
基于 CMOS 的探测器Thermo-FisherCetaD 16M我们使用了 CetaD 16M 探测器，但任何具备滚动快门模式或足够快速读出速度的探测器均可接受。 
Delphi 软件Thermo-FisherN/AThermo-Fisher 透射电镜系统上的软件，可用于手动旋转样品台
EPU-D 软件Thermo-FisherN/A用于采集 MicroED 数据的商业软件
玻璃盖玻片HamptonHR3-231
电晕放电仪PelcoeasiGlow
高精度镊子EMS78325-AC任何高精度镊子均可使用
液氮容器Spear LabFD-800用于在液氮条件下处理样品的标准泡沫容器，容量为 800 mL
SerialEM 软件UC BoulderN/A由 D. Mastronarde 分发的免费软件，分子、细胞与发育生物学系
透射电镜载网（TEM grids）Quantifoil/EMSQ310CMA本实验使用了 Multi-A 300 目载网，但任何薄碳膜载网均可使用。对于这些小分子样品，我们建议从连续碳膜开始尝试。 
透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）Thermo-FisherTalos Arctica
Whatman 圆形滤纸Millipore-SigmaWHA1001090直径 90 mm 或更大

参考文献

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MicroED

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