小分子的微晶电子衍射

Summary

在这里，我们描述了我们实验室开发的用于制备用于微晶电子衍射（MicroED）实验的小分子晶体粉末的程序。

Abstract

描述了制备用于微晶电子衍射（MicroED）实验的小分子样品的详细方案。MicroED已被开发用于使用标准电子冷冻显微镜（cryo-EM）设备解决蛋白质和小分子的结构。通过这种方式，小分子、肽、可溶性蛋白和膜蛋白最近被测定到高分辨率。这里介绍了以药物卡马西平为例制备小分子药物网格的方案。提出了筛选和收集数据的协议。整个过程中的其他步骤（如数据集成、结构确定和优化）将在别处介绍。准备小分子网格所需的时间估计不到30分钟。

Introduction

微晶电子衍射（MicroED）是一种电子冷冻显微镜（cryo-EM）方法，用于从亚微米尺寸的晶体^1，2中确定原子分辨率结构。将晶体应用于标准透射电子显微镜（TEM）网格，并通过投入液态乙烷或液氮进行冷冻。然后将网格加载到在低温下运行的TEM中。晶体位于网格上并筛选初始衍射质量。连续旋转 MicroED数据是从筛选晶体的子集中收集的，其中数据使用快速相机保存为电影³。这些电影被转换为标准的晶体学格式，并且处理方式几乎与X射线晶体学实验⁴相同。

MicroED最初是为了研究蛋白质微晶^1，2而开发的。蛋白质晶体学的一个瓶颈是为传统的同步加速器X射线衍射实验生长出大而有序的晶体。由于电子与比X射线强几个数量级的物质相互作用，产生可检测衍射所需的晶体尺寸的限制^要小得多5。此外，弹性与非弹性散射事件的比例对电子更有利，这表明可以在较小的^{整体暴露5}下收集更多有用的数据。不断发展使得MicroED数据可以从最具挑战性的微晶⁶....

Protocol

1. 制备小分子样品

1. 将少量（0.01 - 1 mg）粉末、液体或固体转移到小瓶或管中。
2. 对于已经呈粉末形式的样品，使用盖子密封试管，直到需要样品为止。在尝试方法1（步骤3）或步骤2（步骤4）之前，将液体样品干燥成粉末。
   注意:溶解在液体中的样品可以使用下面的方法3（5.X）

2. 准备透射电镜网格

注意:一些带有自动加载系统的TEM要求在加载到TEM柱之前将网格夹住并放入盒中。削波涉及将 3 mm TEM 网格物理固定到自动加载机可以操作的金属环中。此步骤和后续步骤可以使用普通 TEM 网格或已裁剪的 TEM 网格执行。对于这些实验，如果提前剪裁网格，则通常更容易操作网格。

1. 将塑料薄膜缠绕在玻璃盖玻片的一端。
2. 将TEM网格放在盖玻片顶部的薄膜上，碳面朝上。在灯光下识别网格的两侧。铜面发光并呈现金属色，而碳面呈现单调的棕色（图 1C，D）。对于夹紧的网格，碳面应面向夹环的平面。
3. 将带有网格的载玻片放入辉光放电室。使用15 pA的负设置对盖侧进行辉光放电约30秒。在将样品添加到网格之前，将网格存储在衬有滤纸的玻璃培养皿内的盖玻片上。

3. 通过创建均匀....

Results

MicroED是一种冷冻电镜方法，它利用电子和物质之间的强相互作用，可以研究消失的小晶体^12，13。在这些步骤之后，有望从微晶中收集晶体学格式的衍射电影（视频1）。在这里，使用卡马西平¹²演示该技术。结果显示了来自在TEM网格上鉴定的卡马西平微晶的连续旋转MicroED数据集（视频1）。一个好的数据集具有强大、清晰的斑点，不会拖尾或分裂，并且每帧上只有一个晶格，通过逐步浏览电影¹⁹ 可以轻松跟踪。这些数据可以使用标准 X 射线晶体学软件轻松索引、集成和缩放⁴.从已经破裂的晶体中可以看到分裂的斑点，同一晶体的两个方向紧密对齐，但不完全重合¹⁹。也可能发生多个晶格，特别是对于这些小分子晶体，其中多个单晶在网格上粘在一起。另一种常见的情况是晶体在碎裂过程中被错误地冻结或处.......

Discussion

样品制备通常是一个迭代过程，在筛选和数据收集后进行优化。对于小分子样品，通常谨慎的做法是首先尝试网格制备而不对网格进行辉光放电，因为许多药物往往是疏水性的^10，11。如果网格的纳米晶沉积物太少，最好在第一次对网格进行辉光放电后重试。可能是冻干粉末的晶体太大太厚，无法收集良好的数据。在这些情况下，可以从较大晶体的边缘或较薄部分收集数据。如果这证明是困难的，则可能需要使用更粗糙的表面（例如研钵和研杵）将粉末研磨成更细的稠度。

MicroED数据通常在TEM在微^{探针模式下操作}4^，20的情况下收集。在这里，对应于0.01 e- ^{Å-2 s-1}曝光率的TEM光束的尺寸通常约为10μm，远大于典型的微晶体^1，

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-1.5 mL Eppendorf 试管	Fisher Scientific	14-282-300	任何样品瓶或试管都可以。
自动网格夹	Thermo-Fisher	1036173	MicroED 不需要夹住的网格。配备自动进样器系统的 Thermo-Fisher TEM 需要它们。
自动网格 C 形环	Thermo-Fisher	1036171
卡马扎平	Sigma	C4024-1G	任何数量都足够用于这些实验
基于 CMOS 的探测器	Thermo-Fisher	CetaD 16M	我们使用了 CetaD 16M，但任何具有滚动快门模式或足够快读数的探测器都是可以接受的。
Delphi 软件	Thermo-Fisher	不适用	Thermo-Fisher TEM 系统上的软件，允许手动旋转样品台
EPU-D 软件	Thermo-Fisher	N/A	用于采集 MicroED 数据的商业软件
玻璃盖玻片	Hampton	HR3-231
发光卸料器	Pelco	easiGlow
高精度镊子	EMS	78325-AC	任何高精度镊子都可以
液氮容器	Spear Lab	FD-800	用于处理液氮下标本的标准泡沫容器 - 800mL
SerialEM 软件	UC Boulder	N/A	由 D. Mastronarde 分发的免费软件。分子、细胞和发育生物学系
TEM 网格	Quantifoil/EMS	Q310CMA	这里使用了 Multi-A 300 网格，但任何薄碳网格都可以使用。对于这些小分子，我们建议从连续碳开始。
透射电子显微镜 （TEM）	Thermo-Fisher	Talos Arctica
Whatman 圆形滤纸	Millipore-Sigma	WHA1001090	90mm 或更大