本文介绍了我们实验室为微晶电子衍射（MicroED）实验制备小分子晶体粉末所建立的操作流程。
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本文内容
摘要
摘要
本文描述了一种用于微晶电子衍射（MicroED）实验中小分子样品制备的详细方案。MicroED 技术利用标准的冷冻电子显微镜（cryo-EM）设备，用于解析蛋白质和小分子的结构。近年来，该方法已成功实现对小分子、多肽、可溶性蛋白以及膜蛋白的高分辨率结构测定。本文以药物卡马西平（carbamazepine）为例，介绍了小分子药物样品载网的制备方案，并提供了用于样品筛选和数据采集的实验流程。整个流程中的其他步骤，如数据整合、结构解析与精修，将在其他文献中另行介绍。小分子载网的制备时间预计少于 30 分钟。
引言
微晶电子衍射（MicroED）是一种电子冷冻显微镜（cryo-EM）方法，可用于从亚微米尺度的晶体中解析原子分辨率结构1,2。将晶体样品施加到标准的透射电子显微镜（TEM）载网上，并通过浸入液态乙烷或液氮中进行快速冷冻。随后将载网装载至在低温条件下运行的透射电子显微镜中。在载网上定位晶体，并初步筛选其衍射质量。对部分筛选出的晶体进行连续旋转的MicroED数据采集，数据通过快速相机以电影形式记录3。这些电影数据被转换为标准的晶体学格式，并以与X射线晶体学实验几乎相同的方式进行处理4。
MicroED 最初被开发用于研究蛋白质微晶1,2。蛋白质晶体学中的一个瓶颈是难以生长出适用于传统同步辐射X射线衍射实验的大尺寸、高度有序的晶体。由于电子与物质的相互作用强度比X射线高出数个数量级，因此产生可检测衍射信号所需的晶体尺寸限制显著减小5。此外，电子的弹性散射与非弹性散射事件之比更为有利，表明在总体辐射剂量更低的情况下即可收集到更多有用的数据5。持续的技术进步使得从....
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方案
1. 小分子样品的制备
- 取少量（0.01 - 1 mg）粉末、液体或固体样品，转移至小瓶或离心管中。
- 对于已是粉末形态的样品，在需要使用前用盖子密封离心管。在进行方法1（步骤3）或方法2（步骤4）前，需先将液体样品干燥转化为粉末。
注意：溶解于液体中的样品可采用下文的方法3（5.X）
2. 准备透射电镜载网
注意：某些带有自动进样系统的透射电子显微镜（TEM）要求在将载网装入TEM镜筒前，先将载网固定并放入样品盒中。固定过程是指将3 mm的TEM载网物理固定在金属环内，以便自动进样系统能够操作。此步骤及后续步骤可使用普通TEM载网或已固定的TEM载网进行。在这些实验中，若提前完成载网固定，通常更便于操作。
- 将塑料薄膜包裹在玻璃盖玻片的一端。
- 将透射电镜（TEM）载网放置在盖玻片顶部的薄膜上，碳膜面朝上。在光线下辨认载网的两面：铜面具有金属光泽，而碳面呈暗褐色（图1C，D）。对于带夹环的载网，碳膜面应朝向夹环的平面一侧。
- 将带有载网的盖玻片放入电晕放电室中，使用负极设置在15 pA条件下进行约30秒的电晕放电处理。在向载网加样前，将载网连同盖玻片一起存放于内衬滤纸的玻璃培养皿中。
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结果
MicroED 是一种利用电子与物质之间强相互作用的冷冻电镜方法，能够用于研究极其微小的晶体12,13。完成这些步骤后，预期将获得一份以晶体学格式记录的、来自微晶的衍射电影数据（Movie 1）。此处以卡马西平为例进行该技术的演示12。结果显示，从透射电镜载网上识别出的一个卡马西平微晶获得了连续旋转的 MicroED 数据集（Movie 1）。理想的数据集在每一帧中应呈现强度高、清晰且未弥散或分裂的衍射点，并且每帧仅显示一个晶格，可通过逐帧播放电影轻松追踪19。这些数据可使用标准X射线晶体学软件轻松完成指标化、积分和缩放处理4。当晶体发生破裂时，可观察到分裂的衍射点，此时同一晶体的两个取向接近对齐但并未完全重合19。多晶格现象也可能出现，尤其在这些小分子晶体中，多个.......
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讨论
样品制备通常是一个迭代过程，在筛选和数据收集阶段之后进行优化。对于小分子样品，通常可以首先尝试不进行辉光放电处理载网的制样方法，因为许多药物具有疏水性10,11。如果载网上纳米晶体沉积过少，建议在首次辉光放电处理载网后再次尝试。有时，由冻干粉末形成的晶体可能过大或过厚，难以获得高质量的数据。在此情况下，可尝试从较大晶体的边缘或较薄区域收集数据。若此方法仍存在困难，则可能需要使用更粗糙的表面（如研钵和研杵）将粉末研磨至更细的粒度。
MicroED 数据通常在透射电子显微镜（TEM）处于微探针模式下进行采集4,20。在此模式下，对应于 0.01 e- Å-2 s-1 曝光速率的 TEM 电子束直径通常约为 10 µm，远大于典型的微晶尺寸1<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Gonen 实验室由霍华德·休斯医学研究所的资金支持。本研究由美国国立卫生研究院 P41GM136508 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1-1.5 mL 离心管 | Fisher Scientific | 14-282-300 | 任何小瓶或试管均可使用。 |
| Autogrid 夹子 | Thermo-Fisher | 1036173 | MicroED 实验无需使用带夹子的载网。但若使用配备自动进样系统的 Thermo-Fisher 透射电镜，则必须使用。 |
| Autogrid C 型环 | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| 卡马西平（Carbamazapine） | Sigma | C4024-1G | 任何用量均足以完成本实验 |
| 基于 CMOS 的探测器 | Thermo-Fisher | CetaD 16M | 我们使用了 CetaD 16M 探测器，但任何具备滚动快门模式或足够快速读出速度的探测器均可接受。 |
| Delphi 软件 | Thermo-Fisher | N/A | Thermo-Fisher 透射电镜系统上的软件，可用于手动旋转样品台 |
| EPU-D 软件 | Thermo-Fisher | N/A | 用于采集 MicroED 数据的商业软件 |
| 玻璃盖玻片 | Hampton | HR3-231 | |
| 电晕放电仪 | Pelco | easiGlow | |
| 高精度镊子 | EMS | 78325-AC | 任何高精度镊子均可使用 |
| 液氮容器 | Spear Lab | FD-800 | 用于在液氮条件下处理样品的标准泡沫容器，容量为 800 mL |
| SerialEM 软件 | UC Boulder | N/A | 由 D. Mastronarde 分发的免费软件，分子、细胞与发育生物学系 |
| 透射电镜载网（TEM grids） | Quantifoil/EMS | Q310CMA | 本实验使用了 Multi-A 300 目载网，但任何薄碳膜载网均可使用。对于这些小分子样品，我们建议从连续碳膜开始尝试。 |
| 透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM） | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman 圆形滤纸 | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 直径 90 mm 或更大 |
参考文献
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345(2013).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data ....
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重印与许可
