本方案旨在通过建立在受控的实验室条件下使蜜蜂（Apis mellifera）蜂王及其工蜂照料者接触农药的方法，并系统监测其相关反应，从而加深对农药如何影响蜜蜂繁殖的理解。
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本文内容
摘要
摘要
目前对蜜蜂的风险评估策略主要依赖于在成年或未成熟工蜂上进行的实验室测试，但这些方法可能无法准确反映农药暴露对蜜蜂蜂王的影响。作为蜂群中唯一能够产下受精卵的个体，蜂王可以说是整个功能蜂群中最重要的单一个体。因此，了解农药如何影响蜂王的健康与繁殖能力，应被视为农药风险评估中的关键环节。本文介绍了一种改进的方法，通过工蜂饲料向蜂王及其工蜂侍从施加农药胁迫，随后在实验室中监测蜂王的产卵情况，并利用一种称为“蜂王监测笼”的特殊装置评估一龄幼虫的孵化情况。为说明该方法的应用，本文描述了一项实验结果：向蜂王的工蜂侍从饲喂含有吡虫啉亚致死剂量的饲料后，对蜂王所受影响进行了监测。
引言
由于全球对农产品的需求不断增长，现代农业生产通常需要使用农用化学品来控制多种已知会降低或损害作物产量的害虫1。与此同时，许多水果、蔬菜和坚果作物的种植者依赖商业饲养的蜜蜂（Apis mellifera）蜂群提供的授粉服务，以确保作物高产2。这些做法可能导致包括蜜蜂在内的授粉昆虫接触到有害水平的农药残留3。与此同时，蜜蜂蜂群中普遍存在寄生性狄氏瓦螨（Varroa destructor）的侵扰，养蜂人通常需要使用杀螨剂对蜂巢进行处理，而这些药物也可能对蜂群的健康和寿命产生负面影响4,5,6。为了减少和缓解农用化学品的有害影响，在推广应用前必须全面评估其对蜜蜂的安全性，以便提出使用建议，保护有益昆虫。
目前，美国环境保护署（EPA）依赖一种分级风险评估策略来评估蜜蜂对农药的暴露风险，该策略包括对成年蜜蜂进行实验室测试，有时还包括对蜜蜂幼虫的测试7。如果低层级的实验室测试未能消除对毒性的担忧，则可能建议开展更高层级的野外或半野外测试。尽管这些实验室测试能够为农用化学品对工蜂寿....
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方案
1. QMC 组装
- 按照图1A所示，使用各部件组装蜂王产卵笼（QMC），插入一块产卵板（ELP），如图1B所示。在将工蜂加入笼具前，不要安装饲喂管。暂时用实验室级胶带封住4个饲喂孔。
- 将蜂王隔离栅和饲喂室门安装在饲喂室上方，防止蜂王进入饲喂室并接触处理过的饲料。更多组装细节参见 Fine 等人32。
- 在成年工蜂羽化前24小时，从蜜蜂蜂群中采集带有封盖工蜂蛹的蜂蜡巢脾，并将其放入育雏箱内的恒温培养箱中（34.5 °C）。24小时后，将羽化的蜜蜂从巢脾上刷下，放入已涂有防爬涂料（例如 Fluon）的开放容器中，以防止蜜蜂爬出。
- 按重量向每个QMC的产卵室加入至少50只蜜蜂（5 g ≈ 50只蜜蜂44,45）。为确保实验中包含多样化的工蜂遗传背景，应从至少三个蜂群中采集大致相等数量的工蜂，并在加入QMC前将其混合。
注意：羽化不足1天的新生工蜂由于飞行肌未发育完全且体壁尚未硬化，尚不具备飞行和蜇刺能力。若在此阶段加入，无需在操作前进行麻醉。可通过使用小号¼杯量杯轻轻从容器中舀取蜜蜂，并将其转移至另一个已去皮的容器（内壁涂有防爬涂料，如 Fluon）中进行称重。为确....
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结果
采用上述方法组装并维持QMC，并对每组15个蜂箱进行每日一次的卵产量观察，以监测卵的产生情况。实验所用的新交配蜂王主要为卡尼奥兰蜂种，购自一家蜂王繁育商并通过隔夜快递送达；蜜蜂工蜂则取自伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校蜜蜂研究设施中按标准商业化方法饲养的3个蜂群。本实验设置了4种饮食处理组：1）蔗糖溶液和花粉补充剂中均含有50 ppb（g/g）吡虫啉（50 ppb - p+s）；2）蔗糖溶液和花粉补充剂中均含有10 ppb吡虫啉（10 ppb - p+s）；3）仅在花粉补充剂中添加10 ppb吡虫啉（10 ppb - p）；4）对照组（CTRL），饲喂与处理组等体积丙酮的饲料。
治疗相关的每日产卵数变化评估方法参照 Fine 等人32的描述并稍作修改。简言之，采用具有自回归（AR-1）相关矩阵结构的泊松对数线性广义估计方程（GEE），以评估随时间变化的治疗对产卵量的影响。其中，时间（天数）被视为连续变量，治疗分组为分类变量。采用 Wald 卡方事后检验确定显著性。由于实验第 1 天未观察到产卵，因此将该天数据从分析中剔除，以符合 GEE .......
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讨论
独居昆虫的雌性个体以及真社会性昆虫群体中的蜂后，其繁殖力可能受到农药等非生物胁迫因素的影响25,28,29,30,33。在蜜蜂中，农药对蜂后的影响可能是间接的，例如通过影响工蜂对蜂后的照料和饲喂行为而产生作用。我们的代表性结果与一项基于田间的研究所报告的结果相似29，表明利用蜂后饲养单元（QMCs）可在实验室环境中高效地评估农药对蜂后表现的影响，并获得与田间研究方法相当的结果。此外，这些结果揭示了吡虫啉对工蜂摄食行为以及卵存活率的影响。
当吡虫啉与蔗糖溶液和花粉补充剂共同施用时，对产卵具有明显的负面影响。这与先前使用含有吡虫啉的糖浆饲喂、并允许自由采食的观察蜂群所得结果相似29.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢 Amy Cash-Ahmed 博士、Nathanael J. Beach 和 Alison L. Sankey 在开展本研究工作中提供的帮助。本出版物中提及的商标名称或商业产品仅为提供具体信息之目的，并不意味着美国农业部的推荐或认可。美国农业部为平等机会提供者和雇主。本研究得到了美国国防高级研究计划局（HR0011-16-2-0019，授予 Gene E. Robinson 和 Huimin Zhao）、美国农业部项目 2030-21000-001-00-D，以及伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校社区学院学生表型可塑性研究实习项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氟龙涂层剂（Fluon） | BioQuip, Rancho Dominguez, CA | 2871A | |
| 蜜蜂蜂王 | Olivarez Honey Bees, Orland, CA | ||
| 吡虫啉（Imidacloprid） | Sigma-Aldritch, St. Louis, MO | 37894 | |
| MegaBee 蜜粉 | MegaBee, San Dieago, CA | ||
| 2 mL 微量离心管 | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | 02-682-004 | |
| 20 号针头 | W. W. Grainger, Lake Forest, IL | 5FVK4 | |
| 硫酸钾 | Sigma-Aldritch, St. Louis, MO | P0772 | |
| 蜂王监测笼 | 伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校 | 专利申请号：20190350175 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldritch, St. Louis, MO | S8501 | |
| 通用微孔板盖 | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | 5500 |
参考文献
- Hedlund, J., Longo, S. B., York, R. Agriculture, pesticide use, and economic development: A global examination (1990-2014). Rural Sociology. 85 (2), 519-544 (2020).
- Calderone, N. W. Insect pollinat....
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