评估杀虫剂对交配后蜜蜂蜂王的风险

摘要

本方案旨在通过建立在受控的实验室条件下使蜜蜂（Apis mellifera）蜂王及其工蜂照料者接触农药的方法，并系统监测其相关反应，从而加深对农药如何影响蜜蜂繁殖的理解。

摘要

目前对蜜蜂的风险评估策略主要依赖于在成年或未成熟工蜂上进行的实验室测试，但这些方法可能无法准确反映农药暴露对蜜蜂蜂王的影响。作为蜂群中唯一能够产下受精卵的个体，蜂王可以说是整个功能蜂群中最重要的单一个体。因此，了解农药如何影响蜂王的健康与繁殖能力，应被视为农药风险评估中的关键环节。本文介绍了一种改进的方法，通过工蜂饲料向蜂王及其工蜂侍从施加农药胁迫，随后在实验室中监测蜂王的产卵情况，并利用一种称为“蜂王监测笼”的特殊装置评估一龄幼虫的孵化情况。为说明该方法的应用，本文描述了一项实验结果：向蜂王的工蜂侍从饲喂含有吡虫啉亚致死剂量的饲料后，对蜂王所受影响进行了监测。

引言

由于全球对农产品的需求不断增长，现代农业生产通常需要使用农用化学品来控制多种已知会降低或损害作物产量的害虫¹。与此同时，许多水果、蔬菜和坚果作物的种植者依赖商业饲养的蜜蜂（Apis mellifera）蜂群提供的授粉服务，以确保作物高产²。这些做法可能导致包括蜜蜂在内的授粉昆虫接触到有害水平的农药残留³。与此同时，蜜蜂蜂群中普遍存在寄生性狄氏瓦螨（Varroa destructor）的侵扰，养蜂人通常需要使用杀螨剂对蜂巢进行处理，而这些药物也可能对蜂群的健康和寿命产生负面影响^4,5,6。为了减少和缓解农用化学品的有害影响，在推广应用前必须全面评估其对蜜蜂的安全性，以便提出使用建议，保护有益昆虫。

目前，美国环境保护署（EPA）依赖一种分级风险评估策略来评估蜜蜂对农药的暴露风险，该策略包括对成年蜜蜂进行实验室测试，有时还包括对蜜蜂幼虫的测试⁷。如果低层级的实验室测试未能消除对毒性的担忧，则可能建议开展更高层级的野外或半野外测试。尽管这些实验室测试能够为农用化学品对工蜂寿命的潜在影响提供有价值的见解，但它们未必能准确预测这些化学品对蜂王的影响，因为蜂王在生物学⁸和行为学⁹上与工蜂存在显著差异。此外，农用化学品对昆虫的影响远不止致死效应，还可能对依赖协调行为以群体为单位运作的社会性昆虫产生重大后果^10,11。

尽管死亡率是农业化学农药最常见的效应¹²，但这些产品可能对靶标和非靶标节肢动物产生广泛影响，包括行为改变^13,14,15,16、驱避性或引诱性^17,18,19、摄食模式变化^20,21,22，以及繁殖力升高或降低^{20,21,22,23,24,25}。对于社会性昆虫而言，这些效应可能系统性地破坏蜂群内部的相互作用与功能¹¹。在这些功能中，繁殖过程高度依赖于由整个蜂群单位支持的单一产卵蜂后⁹，因此可能特别容易受到农药暴露的干扰。

对未成熟蜂王开展的研究表明，发育期间暴露于杀螨剂会影响成年蜂王的行为、生理机能和存活率^26,27同样，使用完整或缩小规模蜂群的研究表明，农用化学品可通过降低交配成功率影响成年蜜蜂蜂后²⁸，减少产卵²⁹，降低所产卵子的存活率^25,30,31这些现象以往由于缺乏可用的实验方法，难以在不使用整个蜂群的情况下进行观察。然而，利用蜂王监测笼（Queen Monitoring Cages, QMC），现已建立了一种可在严格控制的实验室条件下研究蜂王产卵行为的方法。³² 最近已将其改进用于研究农用化学品对蜂王繁殖力的影响³³在此，详细描述了这些技术以及用于测量和追踪QMC中工蜂饮食摄入的其他方法。

这些方法相较于需要完整规模蜂群的实验更具优势，因为它们能够以显著减少的工蜂数量（相对于蜂群中通常存在的数万只工蜂）施加精确剂量的农用化学品，随后由这些工蜂为蜂后提供营养³⁴。这种暴露方式模拟了在现实情况下蜂后所经历的间接暴露，因为在蜂群内部，蜂后不会自行取食，而是依赖工蜂为其提供食物⁹。同样，蜂后通常不会离开蜂巢，只有在蜂群繁殖（分蜂）期间进行交配飞行时例外³⁵。已交配的蜜蜂蜂后可从商业蜂后繁育者处购买，并通过隔夜快递运输。通常情况下，蜂后繁育者在确认蜂后已开始产卵后即直接出售，产卵被视为成功交配的标志。如果需要关于蜂后年龄或亲缘关系的更精确信息，研究人员可在下单前与蜂后繁育者沟通咨询。

蜂王幼虫培养系统（QMCs）可精确观察和量化蜜蜂蜂王的产卵率及卵的孵化率^32,33，从而获得有关农业化学品暴露对蜂王繁殖力影响的宝贵数据。本文展示的代表性结果描述了一项实验，该实验在持续暴露于田间相关浓度的新烟碱类神经毒性杀虫剂吡虫啉的条件下，利用QMCs量化了蜂王的产卵量、摄食量以及胚胎存活率³⁶。施用后，吡虫啉会转移到植物组织中³⁷，并在多种蜜蜂授粉植物的花粉和花蜜中检测到其残留^38,39,40。蜜蜂暴露于吡虫啉可能产生多种有害效应，包括觅食能力受损¹⁶、免疫功能下降⁴¹，以及蜂群扩张速度和存活率降低^42,43。本研究选择吡虫啉作为测试物质，是因为已有田间实验表明其可影响蜜蜂蜂王的产卵行为²⁹

方案

1. QMC 组装

1. 按照图1A所示，使用各部件组装蜂王产卵笼（QMC），插入一块产卵板（ELP），如图1B所示。在将工蜂加入笼具前，不要安装饲喂管。暂时用实验室级胶带封住4个饲喂孔。
2. 将蜂王隔离栅和饲喂室门安装在饲喂室上方，防止蜂王进入饲喂室并接触处理过的饲料。更多组装细节参见 Fine 等人³²。
3. 在成年工蜂羽化前24小时，从蜜蜂蜂群中采集带有封盖工蜂蛹的蜂蜡巢脾，并将其放入育雏箱内的恒温培养箱中（34.5 °C）。24小时后，将羽化的蜜蜂从巢脾上刷下，放入已涂有防爬涂料（例如 Fluon）的开放容器中，以防止蜜蜂爬出。
4. 按重量向每个QMC的产卵室加入至少50只蜜蜂（5 g ≈ 50只蜜蜂^44,45）。为确保实验中包含多样化的工蜂遗传背景，应从至少三个蜂群中采集大致相等数量的工蜂，并在加入QMC前将其混合。
   注意：羽化不足1天的新生工蜂由于飞行肌未发育完全且体壁尚未硬化，尚不具备飞行和蜇刺能力。若在此阶段加入，无需在操作前进行麻醉。可通过使用小号¼杯量杯轻轻从容器中舀取蜜蜂，并将其转移至另一个已去皮的容器（内壁涂有防爬涂料，如 Fluon）中进行称重。为确保各来源蜂群在QMC工蜂群体中代表性均衡，各巢脾上封盖蛹所占面积应大致相等。可通过将来自所有蜂群的新羽化工蜂一同刷入同一容器中，混合5分钟，以实现工蜂群体的均质化。
5. 加入含有蔗糖溶液、水和花粉补充剂的饲喂器（参见第2节）。
6. 对已交配的蜂王个体暴露于CO₂气体中，以刺激其产卵⁴⁶，并便于转移至QMC中。
   1. 使用购自商业育种商的蜂王，并在收到后48小时内使用。将蜂王仍置于运输笼中时，放入透明塑料袋内。将连接至CO₂气罐的塑料管一端插入袋中，轻轻打开气罐阀门，使CO₂气体流入袋内。
   2. 当塑料袋膨胀后，同时关闭气罐阀门并捏紧袋口，使气体封闭在袋内。保持封闭状态30秒，或直至蜂王停止活动。观察到蜂王失去意识后，取出蜂王并打开运输笼。
7. 部分打开产卵室门，轻柔地将失去意识的蜂王放入其中，然后关闭盖子，注意避免压伤蜂王或内部的工蜂。按照图1C所示，向每个QMC中加入第二块产卵板。在两块ELP顶部贴上一条实验室胶带，防止其从QMC框架上分离，并阻止工蜂逃出笼具。
8. 将笼具置于黑暗的恒温培养箱中，保持稳定的环境条件：34 ± 0.5 °C，相对湿度60% ± 10%，模拟正常蜂群内部的环境。

图1. A：未组装的QMC。 B：部分组装的QMC，插入1个ELP。 C：完全组装的QMC，插入2个ELP。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 制备并给予添加农药的饲料

1. 要配制 1000 g 的 50% (g/g) 蔗糖溶液，先将一个搅拌子放入洁净的 1 L 玻璃试剂瓶底部。加入 500 g 蔗糖和 500 mL 去离子水。拧开瓶盖，将试剂瓶置于加热磁力搅拌器上，设置为低热搅拌，直至蔗糖完全溶解。待溶液冷却至室温后，再加入农用化学品储备液。
2. 在合适的溶剂（如丙酮）中配制农用化学品的储备液，其浓度应能通过添加至饲料中达到目标农用化学品的所需终浓度。
   注意：当使用丙酮作为溶剂时，经济合作与发展组织（OECD）指南规定，在成年蜜蜂慢性经口毒性试验中，饲料中丙酮的终浓度必须 ≤ 5%⁴⁷。然而，某些溶剂如 n-甲基-2-吡咯烷酮^5,31 和二甲基亚砜²⁵ 在低于该浓度时也可能产生毒性作用，因此建议在处理饲料中尽可能降低溶剂浓度。根据所用溶剂的体积和类型，可能需要同时设置溶剂对照组和阴性对照组，以确保检测到由溶剂毒性引起的潜在效应。使用制剂产品时，必须根据制剂中的有效成分浓度调整使用量。根据目标农用化学品在溶剂中的稳定性，储备液可在 -20 °C 下保存最多 2 周。
3. 根据 OECD 测试编号 245《蜜蜂（Apis mellifera L.）慢性经口毒性试验（10 天喂食）》⁴⁷ 的结果选择亚致死剂量，并通过查询 Ecotox 知识库⁴⁸ 获取相关文献。
4. 将农用化学品处理物加入蔗糖溶液、市售花粉补充剂（若为粉末状）或两者中。实验当天，将适量储备液加入冷藏或室温的 50% 蔗糖溶液（w/w）中，制备实验饲料。通过涡旋振荡或中速磁力搅拌充分混匀。对于花粉补充剂，应按照生产商操作规程，用含农用化学品的蔗糖溶液代替糖浆加入粉末补充剂中，并根据花粉饲料的最终重量调整所用储备液的体积。示例计算参见 表 1。
5. 使用 2 mL 微离心管制备饲喂管。
   1. 对于液体饲料饲喂管，将 20 号针头尖端在加热板/炉灶上加热后，在管底穿刺两次。盖紧管盖，通过其中一个穿刺孔用移液器加入约 1.5 mL 蔗糖溶液或水。将管子穿刺面朝上放置，待其接入 QMC 时使用。
   2. 对于花粉补充剂饲喂管，使用剃刀片将管底切去。盖紧管盖后，将 1–2 g 花粉补充剂压成球状推入管内，直至其接触管盖。
6. 将饲喂管放入 QMC 前记录其重量。未使用的饲料在 4 °C 下存放不得超过 48 小时。

	目标浓度	目标溶剂载体浓度	蔗糖溶液的期望终体积/质量	储备液体积	储备液中的吡虫啉含量	建议的储备液配制方案
蔗糖溶液	10 ppb (w/w)	0.05% (v/v)	81.45 mL/100 g*	40.7 µL	0.001 mg/40.7 µL	0.02 mg/814 µL
花粉补充剂	10 ppb (w/w)		10 g**	4.07 µL	0.0001 mg/4.07 µL	0.02 mg/814 µL
蔗糖溶液	50 ppb (w/w)	0.05% (v/v)	78.5 mL/100 g*	40.7 µL	0.005 mg/40.7 µL	0.1 mg/814 µL
花粉补充剂	50 ppb (w/w)		10 g**	4.07 µL	0.0005 mg/4.07 µL	0.1 mg/814 µL

表1：处理过的蔗糖溶液、花粉补充剂和储备液的示例配方。 *体积基于50% (w/w) 蔗糖溶液的密度（1.228 g/mL）。**花粉补充剂的密度会因所用产品的不同而有所变化，但如果使用此溶剂体积，花粉补充剂中最终的溶剂体积浓度将处于≤ 5% 的理想范围内。

3. 监测——卵产量

1. 每天上午和/或傍晚 1 至 2 次定量记录产卵情况。开始时将蜂王笼（QMC）从培养箱中取出以检查是否有卵。
   注意：在成功的实验中，大多数对照组 QMC 在初次组装后的 3 天内即开始产卵。每次从培养箱中取出的 QMC 数量应以可在 10 分钟内完成检查和饲喂为限。在培养箱外停留时间过长可能会干扰产卵。
2. 检查透明产卵板（ELP）背面是否有卵。若发现有卵，移除目标板前方的门板。撕去覆盖在 ELP 上的胶带，小心地将门板从 ELP 与 QMC 内部蜜蜂之间滑入，注意不要压伤正在 ELP 蜂房中清理的蜜蜂。
3. 将门板置于原位后，取出 ELP，计数并记录 ELP 蜂房内的卵数。通过将 ELP 边缘朝下（开口蜂房面朝下）轻敲坚硬表面（如废物容器边缘），使卵脱落以清除卵。卵脱落后，将空的 ELP 放回 QMC 中。轻柔地将门板从 QMC 外侧重新插入 ELP 后方并复位。必要时对第二个 ELP 重复上述操作，完成后在 QMC 上重新贴上胶带。
   ​注意：通常在 2 周后，QMC 中的产卵量会下降，死亡率上升^32,33，因此建议在 14 天后结束实验。

4. 监测——食物消耗

1. 每两天用新配制的饲料替换 QMC 饲养管中剩余的所有食物。准备新的饲养管（包括水），并在将 QMC 从培养箱中取出进行监测之前称重。将所有旧管更换为新管，并在处理未食用的饲料前称量旧管的重量。通过比较饲养管及其中未食用饲料的最终重量与该饲养管放入 QMC 前的初始重量，估算饲料消耗量。
2. 在饲养管计划更换的间隔期间，每天检查一次饲料消耗情况（与监测 QMC 产卵时间同步），以确保饲养管从不空置。若发现饲养管为空或接近空，应立即取出，重新填充，并记录填充前后管的重量，将两次重量之差加入该 QMC 两天内的饲料总消耗量中。

5. 监测——胚胎活力

1. 在QMC实验的选定时间点，根据步骤3从QMC中取出含有 freshly laid eggs 的ELP，但不要将卵从ELP上移除。
2. 用通用微孔板盖覆盖ELP，并将其放入含有饱和K₂SO₄溶液（150 g K₂SO₄ 溶于1 L水中，置于浅皿中）的干燥器内。
   注意：混合物在培养箱中达到设定温度后，皿底应可见部分未溶解的盐。
3. 将干燥器置于设定为34.5 °C的培养箱中，使干燥器内部相对湿度维持在95%，条件类似于Collins⁴⁹所采用的条件。
   注意：几乎所有卵将在产卵后72 ± 6小时内孵化⁴⁹，因此最早可在ELP从QMC取出后78小时评估孵化率。若在孔底部观察到呈“C”形的幼虫，则表明孵化成功。若卵为雄蜂卵而非工蜂卵等情况，孵化时间可能存在一定差异⁵⁰。

6. 工人采样

1. 若蜂群中工蜂数量过多，可在实验期间选定时间点取样工蜂，以评估处理措施对其生理状态的影响。取样操作应与日常饲喂和卵数统计工作同时进行，以尽量减少蜂群在培养箱外停留的时间。
2. 取样前，在ELP与蜂群内部之间放置一块门板，并移除ELP。小心地将门板从蜂笼底部抬起约0.5 cm，使用轻质镊子从蜂群内部取出一只工蜂。为防止蜜蜂逃逸，必要时可用戴手套的手指或棉块遮挡0.5 cm开口的部分区域。
3. 妥善保存采集的蜜蜂以备后续分析，并重复此过程直至获得所需数量的样本。对于基因表达分析，强烈建议将蜜蜂在液氮中速冻后立即于-80 °C保存⁵¹。

7. 工蜂死亡率

1. 通过计数饲喂室和产卵室底部的死亡工蜂数量，评估实验期间的工蜂死亡率。此项评估应与每日产卵量的定量分析同时进行。
2. 使用镊子通过饲喂孔小心移除死亡工蜂；当镊子未插入时，用戴手套的手指或棉球堵住孔口。
3. 通过将门板从笼底小心抬起约 0.5 cm 并插入镊子，从产卵室中移除死亡工蜂。为防止蜜蜂逃逸，必要时可用戴手套的手指或棉球遮挡 0.5 cm 的开口部分。
4. 实验结束时，采用前述方法从蜂王与工蜂组合（QMC）中移除并计数所有死亡工蜂，以评估工蜂死亡率。
   注意：若无工蜂存在，蜂王将无法产卵，并会在 24 小时内饿死。因此，若观察到某 QMC 中所有工蜂均已死亡，应立即将该 QMC 从实验中移除。同样，若蜂王在实验期间死亡，也应移除该 QMC，并对相关数据进行适当删失处理。

结果

采用上述方法组装并维持QMC，并对每组15个蜂箱进行每日一次的卵产量观察，以监测卵的产生情况。实验所用的新交配蜂王主要为卡尼奥兰蜂种，购自一家蜂王繁育商并通过隔夜快递送达；蜜蜂工蜂则取自伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校蜜蜂研究设施中按标准商业化方法饲养的3个蜂群。本实验设置了4种饮食处理组：1）蔗糖溶液和花粉补充剂中均含有50 ppb（g/g）吡虫啉（50 ppb - p+s）；2）蔗糖溶液和花粉补充剂中均含有10 ppb吡虫啉（10 ppb - p+s）；3）仅在花粉补充剂中添加10 ppb吡虫啉（10 ppb - p）；4）对照组（CTRL），饲喂与处理组等体积丙酮的饲料。

治疗相关的每日产卵数变化评估方法参照 Fine 等人³²的描述并稍作修改。简言之，采用具有自回归（AR-1）相关矩阵结构的泊松对数线性广义估计方程（GEE），以评估随时间变化的治疗对产卵量的影响。其中，时间（天数）被视为连续变量，治疗分组为分类变量。采用 Wald 卡方事后检验确定显著性。由于实验第 1 天未观察到产卵，因此将该天数据从分析中剔除，以符合 GEE ...

讨论

独居昆虫的雌性个体以及真社会性昆虫群体中的蜂后，其繁殖力可能受到农药等非生物胁迫因素的影响^{25,28,29,30,33}。在蜜蜂中，农药对蜂后的影响可能是间接的，例如通过影响工蜂对蜂后的照料和饲喂行为而产生作用。我们的代表性结果与一项基于田间的研究所报告的结果相似²⁹，表明利用蜂后饲养单元（QMCs）可在实验室环境中高效地评估农药对蜂后表现的影响，并获得与田间研究方法相当的结果。此外，这些结果揭示了吡虫啉对工蜂摄食行为以及卵存活率的影响。

当吡虫啉与蔗糖溶液和花粉补充剂共同施用时，对产卵具有明显的负面影响。这与先前使用含有吡虫啉的糖浆饲喂、并允许自由采食的观察蜂群所得结果相似^29...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氟龙涂层剂（Fluon）	BioQuip, Rancho Dominguez, CA	2871A
蜜蜂蜂王	Olivarez Honey Bees, Orland, CA
吡虫啉（Imidacloprid）	Sigma-Aldritch, St. Louis, MO	37894
MegaBee 蜜粉	MegaBee, San Dieago, CA
2 mL 微量离心管	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	02-682-004
20 号针头	W. W. Grainger, Lake Forest, IL	5FVK4
硫酸钾	Sigma-Aldritch, St. Louis, MO	P0772
蜂王监测笼	伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校		专利申请号：20190350175
蔗糖	Sigma-Aldritch, St. Louis, MO	S8501
通用微孔板盖	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	5500