本文介绍并演示了鼻内疫苗的给药方法以及从哺乳期兔子（Oryctolagus cuniculus）采集乳汁的操作，以此作为在母体免疫转化研究模型中评估黏膜免疫反应的手段。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
由于兔子在胎盘结构和抗体转移方面与人类具有相似性，因此是研究母体免疫化的理想模型。该研究模型的其他优势还包括易于繁殖和采集样本、妊娠期相对较短以及每窝产仔数较多。常见的免疫接种途径包括皮下注射、肌肉注射、鼻内注射和皮内注射。为了按时间序列检测对这些免疫接种产生的免疫学反应，需进行非终末性样本采集，包括从母兔及其仔兔采集血液，以及从哺乳期母兔采集乳汁。本文将介绍本实验室在新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）母体免疫化研究中所采用的技术，包括鼻内免疫接种和乳汁采集方法。
引言
母体免疫及抗体转移的研究具有诸多重要价值，因为这是新生儿和婴儿获得免疫力并继而抵御病原体和疾病侵害的最初途径。通过在这一脆弱时期降低特定病原体相关的发病率和死亡率，母体免疫有望在全球范围内对母亲及婴儿/儿童健康产生积极影响1。该策略的主要目标是在整个妊娠期间提高母体特异性抗体的水平，使这些抗体能够以足够的浓度转移给新生儿和婴儿，从而在婴儿自身免疫系统尚未发育成熟、无法有效应对病原体挑战的阶段提供保护1,2,3。既往研究表明，出生时较高的抗体滴度与多种新生儿感染性疾病的完全保护、发病延迟或病情减轻相关，这些疾病包括破伤风、百日咳、呼吸道合胞病毒（RSV）感染、流感以及B族链球菌感染1,2,3。
在人类中，母体抗体通过胎盘被动转移，也可通过哺乳经母乳传递。先前的研究表明，感染该病毒的母亲其母乳中抗 HIV 特异性 IgA 水平与产后病毒传播减少相关，提示母乳中抗 HIV IgA 具有保护作用4。在非人灵长类动物中的研....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有操作均经杜克大学动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循其相关政策进行。
注意：所需材料见材料表。
1. 家兔的镇静与麻醉
- 通过肌肉注射（IM）给予雌性兔（性成熟；约5-30月龄）每千克体重1 mg的乙酰丙嗪进行镇静。根据动物体型，使用1 mL或3 mL注射器配25 G针头。背侧肌群是肌肉注射的首选部位。
注意：乙酰丙嗪也可皮下注射，但本实验室更倾向于肌肉注射，因其起效更快，并可减少皮肤病变的发生。 - 等待10-15分钟，使乙酰丙嗪充分发挥作用。
- 将连接好的鼻罩置于兔鼻部，使用异氟烷对其进行麻醉。调节挥发器，使异氟烷浓度最高达4%，并配合最高4升/分钟的氧气。兔对异氟烷具有较强抗拒性，因此在实施面罩麻醉时需妥善固定动物。
- 当通过耳廓、足底和/或眼睑反射评估确认兔已完全麻醉后，向每只眼睛涂抹眼用润滑剂，以防止角膜干燥及继发性角膜溃疡。
- 在麻醉期间持续监测反射和呼吸情况，一旦达到适当的麻醉深度，即将异氟烷浓度下调至1-2%。
2. 鼻内免疫
- 在处理动物前，准备好免疫用溶液。
- 按照上述方法对兔子进行镇静。
- 当实验人员准备接种疫苗且兔子已达....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
典型的母体鼻内免疫研究设计概览如图1所示，包括免疫接种、配种、分娩、哺乳及抗体转移过程。尽管图中未显示，建议在首次免疫接种前采集血液样本以获取基线数据，并在后续研究过程中定期采集。通过中央耳动脉采血操作简便，仅需轻度镇静和局部镇痛剂（例如2.5%利多卡因和2.5%丙胺卡因乳膏）。可在这些样本中检测抗原特异性IgG水平。雌性家兔通过鼻内途径进行免疫接种，具体方法如本方案所述并由视频演示。根据研究需要，疫苗可能需要加强免疫，或通过其他途径（如肌内或皮下注射）给予。研究开始后对家兔进行配种；我们建议从供应商处购买已验证具有繁殖能力的种兔，以确保较高的妊娠率。根据免疫时间安排，家兔在妊娠期间可能需接受额外的免疫接种。抗原特异性IgG可通过胎盘转移至仔兔，配种后约30-32天，妊娠母兔将分娩。建议在出生后的最初几天尽量减少对仔兔的干预，以降低母兔排斥的风险。可采集仔兔血液样本，以评估经胎盘转移的抗原特异性IgG水平（图3）。除多种营养物质外，哺乳期母兔在哺乳过程中还会向仔兔提供IgA。仔兔通常在4-8周龄断奶，但在断奶前可按视频.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
尽管上述方案中未作描述，但成功繁殖兔子对于该母体模型的建立以及乳汁采集至关重要。在科研环境中，兔子可通过自然交配方式进行繁殖。建议将母兔转移到公兔的笼子中进行交配，因为若将公兔放入母兔笼中，母兔可能表现出领地性并具有攻击性。如果母兔在15分钟后仍不接受交配（表现为逃跑、咬人或发出叫声），应将其放回自己的笼子。目前网上可查阅到多个关于兔子繁殖的详细视频和教程29，通常在交配完成后，公兔会侧身倒下，并可能发出叫声。一旦观察到此现象，即可将母兔送回其笼中。公兔每天可交配2–3次，且精子数量不会明显下降30。根据我们经IACUC批准的实验方案，公兔每周最多交配10–12只母兔，并保证每周至少休息两天，因为文献指出，一只公兔通常足以配种10–15只母兔31。我们团队建议从供应商处购买已有繁殖记录的种兔，以提高繁殖成功率。由于兔子属于诱导排卵动物，排卵通常发生在交配后10–13小时31，我们发现母兔在早晨交配一次、下午再交配一次，或在该10–13小时窗口期内交.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨向杜克大学实验动物资源部及其饲养团队致以诚挚谢意，感谢他们为实验动物提供的协助与悉心照料。此外，作者还感谢病理学系PhotoPath团队在稿件音频和视频部分提供的帮助。本研究得到了斯塔茨实验室自主研究经费的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 鼻内免疫接种 | |||
| 麻醉机/蒸发器 | Vet Equip | 901807 | |
| 皮下注射针头（25 g） | Terumo | 07-806-7584 | |
| 异氟烷（250 mL 瓶装） | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | 2-4% |
| 鲁尔锁扣注射器（1 mL） | Air-Tite | 07-892-7410 | |
| 黏膜疫苗 | N/A | N/A | 实验性疫苗 |
| 鼻罩 | McCulloch Medical | 07891-1097 | |
| 移液器吸头 | VWR | 53503-290 | |
| 移液器 | VWR | 89079-962 | |
| PromAce（马来酸乙酰丙嗪） | Boehringer Ingelheim | 07-893-5734 | 1mg/kg 肌内注射 |
| Puralube 无菌眼用软膏 | Dechra | 07-888-2572 | |
| 乳汁采集 | |||
| 酒精消毒片（双层） | Covidien | 07-839-8871 | |
| 麻醉机/蒸发器 | Vet Equip | 901807 | |
| 皮下注射针头（25 g） | Terumo | 07-806-7584 | |
| 异氟烷（250 mL 瓶装） | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | 2-4% |
| 鲁尔锁扣注射器（1 mL） | Air-Tite | 07-892-7410 | |
| 无纺布海绵（4x4） | Covidien | 07-891-5815 | |
| 鼻罩 | McCulloch Medical | 07891-1097 | |
| PromAce（马来酸乙酰丙嗪） | Boehringer Ingelheim | 07-893-5734 | 1mg/kg 肌内注射 |
| Puralube 无菌眼用软膏 | Dechra | 07-888-2572 | |
| 无菌锥形瓶（15 mL） | Falcon | 14-959-49B |
参考文献
- Munoz, F. M. Current Challenges and Achievements in Maternal Immunization Research. Frontiers in Immunology. 9, 436(2018).
- Kachikis, A., Englund, J. A. Maternal immunization: Optimizing protection for the mother and infant. The Journal of Infect....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
