在新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）母体免疫研究中的鼻内免疫与乳汁采集

摘要

本文介绍并演示了鼻内疫苗的给药方法以及从哺乳期兔子（Oryctolagus cuniculus）采集乳汁的操作，以此作为在母体免疫转化研究模型中评估黏膜免疫反应的手段。

摘要

由于兔子在胎盘结构和抗体转移方面与人类具有相似性，因此是研究母体免疫化的理想模型。该研究模型的其他优势还包括易于繁殖和采集样本、妊娠期相对较短以及每窝产仔数较多。常见的免疫接种途径包括皮下注射、肌肉注射、鼻内注射和皮内注射。为了按时间序列检测对这些免疫接种产生的免疫学反应，需进行非终末性样本采集，包括从母兔及其仔兔采集血液，以及从哺乳期母兔采集乳汁。本文将介绍本实验室在新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）母体免疫化研究中所采用的技术，包括鼻内免疫接种和乳汁采集方法。

引言

母体免疫及抗体转移的研究具有诸多重要价值，因为这是新生儿和婴儿获得免疫力并继而抵御病原体和疾病侵害的最初途径。通过在这一脆弱时期降低特定病原体相关的发病率和死亡率，母体免疫有望在全球范围内对母亲及婴儿/儿童健康产生积极影响¹。该策略的主要目标是在整个妊娠期间提高母体特异性抗体的水平，使这些抗体能够以足够的浓度转移给新生儿和婴儿，从而在婴儿自身免疫系统尚未发育成熟、无法有效应对病原体挑战的阶段提供保护^1,2,3。既往研究表明，出生时较高的抗体滴度与多种新生儿感染性疾病的完全保护、发病延迟或病情减轻相关，这些疾病包括破伤风、百日咳、呼吸道合胞病毒（RSV）感染、流感以及B族链球菌感染^1,2,3。

在人类中，母体抗体通过胎盘被动转移，也可通过哺乳经母乳传递。先前的研究表明，感染该病毒的母亲其母乳中抗 HIV 特异性 IgA 水平与产后病毒传播减少相关，提示母乳中抗 HIV IgA 具有保护作用⁴。在非人灵长类动物中的研究表明，针对 HIV 的免疫接种可在母乳中诱导显著的抗体反应；尽管系统性免疫与黏膜免疫均可诱导相似的血清 IgG 反应，但黏膜免疫在母乳中诱导的 IgA 反应显著更高^5,6。

在为这些研究选择具有转化适用性的动物模型时，应考虑胎盘类型、被动抗体转移机制以及通过乳汁转移抗体的情况。哺乳动物的胎盘类型根据母胎界面的组织类型和层次可分为三种主要类型：血绒毛膜胎盘（灵长类、啮齿类和兔）、内皮绒毛膜胎盘（食肉动物）和上皮绒毛膜胎盘（马、猪和反刍动物）。其中血绒毛膜胎盘侵入性最强，可使母体血液与绒毛膜（最外层的胎儿膜）直接接触。根据滋养层细胞层数的不同，血绒毛膜胎盘又可分为多种亚型，包括灵长类中的单层血绒毛膜胎盘（hemomonochorial placenta）、兔中的双层血绒毛膜胎盘（hemodichorial placenta），以及大鼠和小鼠中所见的三层血绒毛膜胎盘（hemotrichorial placenta）。⁷母体血液供应与绒毛膜之间的这种直接接触，使得抗体在妊娠期间能够通过胎盘进行被动转移。IgG 是唯一一种能够显著穿过人类胎盘的抗体类别。⁸，而IgA是人乳中主要的免疫球蛋白类别⁹在具有科学意义的模型中，仅有灵长类动物（包括人类）、兔子和豚鼠能够转移IgG 在子宫内 以及乳汁中的IgA^10,11因此，兔模型包含了与人类相似的影响IgG胎盘转移和IgA哺乳转移的因素。

除了作为母体免疫和疫苗开发的优秀模型外，兔与人类鼻腔结构的相似性也使其成为鼻内免疫的合适模型。基于相对体质量，兔鼻腔的容积比啮齿类动物模型更接近人类¹²。此外，Casteleyn 等人¹²的研究表明，兔的鼻相关淋巴组织（NALT）比啮齿类动物更为发达。在兔中，NALT 主要位于下鼻甲的腹侧和腹内侧区域，以及鼻咽道的外侧和背外侧区域；而在啮齿类动物中，淋巴组织仅存在于鼻咽道的腹侧区域¹²。兔的上皮内淋巴细胞、固有层淋巴细胞以及孤立淋巴滤泡的结构和位置与人类相似¹²。

使用家兔作为母体免疫和黏膜免疫模型的其他优势包括其高繁殖力和相对较短的妊娠期。较大的耳部血管便于多次采集较大量的血液。可收集多种黏膜样本用于抗原特异性抗体反应检测，包括乳汁¹³（哺乳期间）、黏膜分泌物或冲洗液（例如口腔^14,15,16、支气管肺泡灌洗液^13,17,18,19、阴道分泌物^20,21,22）以及粪便^20,23,24,25。在哺乳期可轻松采集乳汁样本，以评估抗原特异性抗体反应的存在情况。尽管针对家兔的实验试剂不如人类和小鼠丰富，但仍存在大量适用于家兔特异性研究和检测的试剂。本文中，我们将描述并演示新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）的鼻内免疫接种和乳汁采集方法。

方案

所有操作均经杜克大学动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循其相关政策进行。

注意：所需材料见材料表。

1. 家兔的镇静与麻醉

1. 通过肌肉注射（IM）给予雌性兔（性成熟；约5-30月龄）每千克体重1 mg的乙酰丙嗪进行镇静。根据动物体型，使用1 mL或3 mL注射器配25 G针头。背侧肌群是肌肉注射的首选部位。
   注意：乙酰丙嗪也可皮下注射，但本实验室更倾向于肌肉注射，因其起效更快，并可减少皮肤病变的发生。
2. 等待10-15分钟，使乙酰丙嗪充分发挥作用。
3. 将连接好的鼻罩置于兔鼻部，使用异氟烷对其进行麻醉。调节挥发器，使异氟烷浓度最高达4%，并配合最高4升/分钟的氧气。兔对异氟烷具有较强抗拒性，因此在实施面罩麻醉时需妥善固定动物。
4. 当通过耳廓、足底和/或眼睑反射评估确认兔已完全麻醉后，向每只眼睛涂抹眼用润滑剂，以防止角膜干燥及继发性角膜溃疡。
5. 在麻醉期间持续监测反射和呼吸情况，一旦达到适当的麻醉深度，即将异氟烷浓度下调至1-2%。

2. 鼻内免疫

1. 在处理动物前，准备好免疫用溶液。
2. 按照上述方法对兔子进行镇静。
3. 当实验人员准备接种疫苗且兔子已达到适当的麻醉深度时，关闭异氟烷和氧气，取下鼻罩。
4. 将兔子置于仰卧位，并将其颈部和头部支撑在约45°角的位置，以便实验人员能够方便地接触并清晰观察两侧鼻孔。
5. 用移液器吸取不超过100 µL的疫苗溶液，迅速将溶液分别滴入两侧鼻孔。移液器应保持约45°角，朝向鼻腔内侧方向。
   注意：免疫的目的是使溶液接触鼻腔黏膜，因此移液器尖端不应插入鼻孔内部，以免造成黏膜组织擦伤或刺激，进而可能影响鼻腔接种疫苗的免疫原性。疫苗应快速给予，并以相同方式在另一侧鼻孔重复操作。
6. 两侧鼻腔给药后，保持兔子仰卧位30秒，以尽量减少疫苗溶液外漏。
   注意：实验室通常每次每侧鼻孔给予不超过100 µL。若需给予更大体积（总量最多500 µL），可分次给予，每次100 µL，两次免疫之间间隔30秒，并重复此过程，每次给药后休息30秒，直至完成全部疫苗剂量的接种。
7. 免疫完成后，将兔子置于俯卧位以促进恢复，并密切监测动物状态，直至其能够维持胸卧位。

3. 乳汁采集

1. 按照上述方法使哺乳期兔只镇静。
2. 用酒精棉签/擦拭垫清洁耳缘静脉处的皮肤。
3. 使用1 mL注射器和25 g针头，通过耳缘静脉注射约1-2 IU催产素，以诱导泌乳。
   注意：由于平滑肌松弛，兔只在注射催产素后常会出现排尿或排便现象。
4. 注射催产素后，用纱布按压注射部位。
5. 保持麻醉面罩覆盖兔只鼻部的同时，将兔只后肢抬起支撑，使其臀部着地直立。
   注意：也可在动物侧卧位时进行乳汁采集，但本实验室发现，由助手扶持兔只使其臀部着地直立并同时维持麻醉面罩时，采集操作更为方便。
6. 打开无菌管以准备乳汁采集，定位乳腺组织及其相应的乳头。乳头周围通常因近期哺乳而被湿润的毛发包围，当乳腺充满乳汁时，乳腺组织可轻易触及。
7. 用拇指和食指夹住与乳头相连的乳腺组织，朝乳头方向对腺体组织施加轻柔的按摩压力。将收集管置于乳头上，以收集挤出的乳汁。
   注意：催产素起效有时需要数分钟，且不同乳腺之间的泌乳量可能存在差异。若某一乳头未能成功挤出乳汁，可等待数分钟，或转向其他乳腺尝试。所有乳头采集的乳汁可收集于同一管中。通常，从一只哺乳期母兔可轻松采集数毫升乳汁。
8. 乳汁采集完成后，关闭异氟烷和氧气，让兔只在密切监护下恢复，直至动物能够维持胸卧位。

结果

典型的母体鼻内免疫研究设计概览如图1所示，包括免疫接种、配种、分娩、哺乳及抗体转移过程。尽管图中未显示，建议在首次免疫接种前采集血液样本以获取基线数据，并在后续研究过程中定期采集。通过中央耳动脉采血操作简便，仅需轻度镇静和局部镇痛剂（例如2.5%利多卡因和2.5%丙胺卡因乳膏）。可在这些样本中检测抗原特异性IgG水平。雌性家兔通过鼻内途径进行免疫接种，具体方法如本方案所述并由视频演示。根据研究需要，疫苗可能需要加强免疫，或通过其他途径（如肌内或皮下注射）给予。研究开始后对家兔进行配种；我们建议从供应商处购买已验证具有繁殖能力的种兔，以确保较高的妊娠率。根据免疫时间安排，家兔在妊娠期间可能需接受额外的免疫接种。抗原特异性IgG可通过胎盘转移至仔兔，配种后约30-32天，妊娠母兔将分娩。建议在出生后的最初几天尽量减少对仔兔的干预，以降低母兔排斥的风险。可采集仔兔血液样本，以评估经胎盘转移的抗原特异性IgG水平（图3）。除多种营养物质外，哺乳期母兔在哺乳过程中还会向仔兔提供IgA。仔兔通常在4-8周龄断奶，但在断奶前可按视频...

讨论

尽管上述方案中未作描述，但成功繁殖兔子对于该母体模型的建立以及乳汁采集至关重要。在科研环境中，兔子可通过自然交配方式进行繁殖。建议将母兔转移到公兔的笼子中进行交配，因为若将公兔放入母兔笼中，母兔可能表现出领地性并具有攻击性。如果母兔在15分钟后仍不接受交配（表现为逃跑、咬人或发出叫声），应将其放回自己的笼子。目前网上可查阅到多个关于兔子繁殖的详细视频和教程²⁹，通常在交配完成后，公兔会侧身倒下，并可能发出叫声。一旦观察到此现象，即可将母兔送回其笼中。公兔每天可交配2–3次，且精子数量不会明显下降³⁰。根据我们经IACUC批准的实验方案，公兔每周最多交配10–12只母兔，并保证每周至少休息两天，因为文献指出，一只公兔通常足以配种10–15只母兔³¹。我们团队建议从供应商处购买已有繁殖记录的种兔，以提高繁殖成功率。由于兔子属于诱导排卵动物，排卵通常发生在交配后10–13小时³¹，我们发现母兔在早晨交配一次、下午再交配一次，或在该10–13小时窗口期内交...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鼻内免疫接种
麻醉机/蒸发器	Vet Equip	901807
皮下注射针头（25 g）	Terumo	07-806-7584
异氟烷（250 mL 瓶装）	Patterson Veterinary	07-893-1389	2-4%
鲁尔锁扣注射器（1 mL）	Air-Tite	07-892-7410
黏膜疫苗	N/A	N/A	实验性疫苗
鼻罩	McCulloch Medical	07891-1097
移液器吸头	VWR	53503-290
移液器	VWR	89079-962
PromAce（马来酸乙酰丙嗪）	Boehringer Ingelheim	07-893-5734	1mg/kg 肌内注射
Puralube 无菌眼用软膏	Dechra	07-888-2572
乳汁采集
酒精消毒片（双层）	Covidien	07-839-8871
麻醉机/蒸发器	Vet Equip	901807
皮下注射针头（25 g）	Terumo	07-806-7584
异氟烷（250 mL 瓶装）	Patterson Veterinary	07-893-1389	2-4%
鲁尔锁扣注射器（1 mL）	Air-Tite	07-892-7410
无纺布海绵（4x4）	Covidien	07-891-5815
鼻罩	McCulloch Medical	07891-1097
PromAce（马来酸乙酰丙嗪）	Boehringer Ingelheim	07-893-5734	1mg/kg 肌内注射
Puralube 无菌眼用软膏	Dechra	07-888-2572
无菌锥形瓶（15 mL）	Falcon	14-959-49B