利用高细胞密度生物反应器通过实时定量细胞内核磁共振监测人体细胞中的蛋白质-配体相互作用

摘要

本方案描述了核磁共振生物反应器的建立方法，可使包封的人源细胞在长达72小时内保持活性，随后进行时间分辨的细胞内核磁共振数据采集与分析。该方法学被应用于实时监测细胞内蛋白质-配体相互作用。

摘要

细胞内核磁共振（in-cell NMR）是一种独特的方法，可在活细胞内以原子分辨率直接观测生物大分子的结构与动态特性。该方法能够观测蛋白质折叠、化学修饰以及配体结合所诱导的构象变化，因此在药物开发领域具有巨大潜力。然而，人类细胞在核磁共振波谱仪中存活时间较短，限制了细胞内核磁共振的应用范围。为解决这一问题，研究人员采用核磁共振生物反应器，可显著提高细胞样品随时间推移的稳定性，并且重要的是，能够实现细胞内核磁共振谱图的实时采集。通过这种方式，可实时监测配体穿透细胞并结合胞内蛋白质靶点等过程的动态演变。然而，生物反应器通常在高细胞密度下存在细胞活力低的问题，导致实验整体灵敏度与细胞活力之间存在权衡。我们近期报道了一种核磁共振生物反应器，可在长达72小时的时间内维持大量人类细胞的代谢活性。该系统已被用于监测蛋白质-配体相互作用及蛋白质的化学修饰过程。我们还提出了一种基于多变量曲线分辨的实时核磁共振数据定量分析工作流程。该方法可提供细胞内各化学物种随时间变化的浓度变化曲线，进一步分析可获得相关的动力学参数。本文中，我们详细描述了该核磁共振生物反应器的构建及其在人类细胞中监测蛋白质-配体相互作用的应用。

引言

细胞内核磁共振（NMR）波谱技术近年来已成为研究大分子在细胞环境中结构与动力学特性的强大手段^1,2,3,4,5,6。细胞内NMR已成功用于研究多种功能相关过程，包括蛋白质折叠/错误折叠^7,8,9、金属结合^7,10、二硫键形成^11,12、蛋白质-蛋白质相互作用¹³、蛋白质-配体相互作用^14,15,16以及核酸-配体相互作用^17,18，这些研究均在活的人类细胞中进行。细胞内NMR应用的一个限制因素是实验过程中细胞寿命较短。解决该问题的方法是使用NMR生物反应器。在这些装置中，细胞被限制在核磁共振波谱仪内，并持续通入培养基，以提供氧气和营养物质，同时清除有毒代谢产物。随着细胞内NMR技术的发展，已开发出多种NMR生物反应器设计，可长时间维持细菌或哺乳动物细胞的活性，其中细胞被包埋于水凝胶中^19,20,21,22，或通过微透析膜保持悬浮状态并进行灌流²³。 此类生物反应器使得更长时间的NMR实验成为可能，显著提高了信噪比（S/N）⁵，更重要的是，可用于实时监测细胞内的生物学过程^22,23,24。得益于NMR对化学环境和构象的高度敏感性，这一应用能够在原子分辨率水平上提供关于活细胞内功能过程动力学的宝贵信息。

在本实验方案中，我们展示了如何建立并运行一种近期报道的改进型生物反应器²⁵，该反应器通过将一种现有的模块化生物反应器设计²³与基于水凝胶包封细胞的技术相结合而获得，后者由其他研究团队率先开发^{19,20,21,22,26,27}。我们描述了该生物反应器在HEK293T细胞中用于实时细胞内NMR研究胞内蛋白-配体结合的应用。在该生物反应器中，细胞以高密度包封于琼脂糖凝胶丝中，并可在长达72小时的时间内保持高度存活且代谢活跃，期间可连续采集实时细胞内NMR数据。该生物反应器由一根可适配标准5 mm NMR探头的玻璃管构成，密封良好，并连接至管架，使内部样品腔的内径为4.2 mm，高度为38 mm，容积为526 µL。入口为一根7米长的PEEK毛细管（外径 = 1/32"，内径 = 0.5 mm），插入样品腔内，距底部约6 mm；出口为一根7米长的PTFE毛细管（外径 = 1/32"，内径 = 0.5 mm），连接于管架顶部（图1）。管路同轴插入一条连接恒温水浴的温控管线中。入口和出口通过PEEK管连接至一个四通两位阀，该阀连接FPLC泵以控制培养基流速，并连接废液容器。

生物反应器被用于研究此前已报道的相互作用动力学^14,25，乙酰唑胺（AAZ）与甲唑胺（MZA）在表达人碳酸酐酶第二亚型（CA II）的人类细胞中的比较，CA II 是一个具有药理学意义的靶点^28,29,30，以及小分子依布硒啉促进分子内二硫键形成的动力学过程^25,31人铜锌超氧化物歧化酶（SOD1）的无铜、锌结合形式，该抗氧化酶与肌萎缩侧索硬化症的发病相关^7,8,32最后，使用 MATLAB 中的多变量曲线分辨-交替最小二乘法（MCR-ALS）算法对实时核磁共振数据进行定量分析³³，由此获得所观察物种随时间变化的纯光谱组分和浓度分布，可进一步分析以得到相关的动力学参数。

该方案起始于一个T75培养瓶中的HEK293T细胞（每瓶约3 × 10⁷个细胞），这些细胞瞬时过表达人CA II（未标记）或人SOD1（¹⁵N标记）。细胞在T75培养瓶中用DMEM高糖培养基培养和传代，每3-4天按1:10比例传代一次，并在实验前48小时转染编码目标蛋白的cDNA。本阶段所涉及的步骤已在其他文献中详细报道³⁴。

方案

1. 试剂与溶液的准备

1. 配制完全DMEM培养基：在440 mL DMEM中加入5 mL 200 mM L-谷氨酰胺、5 mL 100倍青霉素-链霉素溶液和50 mL胎牛血清（FBS，终浓度为10% vol/vol）。
   注意：该溶液可在4 °C保存1个月。
2. 制备琼脂糖溶液：将150 mg低熔点琼脂糖溶于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，于85 °C加热溶解，得到1.5%（w/v）的溶液。使用0.22 µm滤膜过滤除菌。将琼脂糖溶液分装至1.5 mL带盖离心管中，每管1 mL，4 °C保存。
3. 配制生物反应器培养基。
   1. 将13.4 g DMEM粉末溶于1 L超纯H₂O中。
      注意：根据具体应用，所需终体积可能不同（例如，配制500 mL培养基时，将6.7 g粉末溶于500 mL H₂O中）。
   2. 加入2% FBS、10 mM NaHCO₃、1倍青霉素-链霉素（100倍储备液）和2% D₂O（例如，配制500 mL培养基时，加入10 mL FBS、0.4 g NaHCO₃、5 mL 100倍青霉素-链霉素溶液和10 mL D₂O）。
   3. 使用pH计测量pH值，必要时用HCl调节至7.4。
      ​注意：通常初始pH值已非常接近7.4。
   4. 使用真空驱动的无菌滤器将生物反应器培养基过滤至无菌的250 mL或500 mL玻璃瓶中。
   5. 在超净工作台内，用带有两个软管接口的无菌金属头盖密封瓶口，并连接氟化乙烯丙烯共聚物（FEP）管路（外径 = 1/8"，内径 = 1.6 mm），该管路将连接至泵以及用于进气的0.22 µm聚四氟乙烯（PTFE）注射器滤器。

2. 生物反应器设置

1. 使用第二个流动单元核磁共振管组装流动单元，该管随后将被含有细胞的核磁共振管替换。请参考流动单元操作说明书进行正确组装。
   注意：此时流路单元应已完成清洗（若未清洗，请执行步骤4.2）。
2. 将连接至流控单元温度控制系统的水浴箱设置为 37 °C。将储液瓶放入水浴中。
3. 将储液瓶的FEP管路连接至泵。
4. 转动生物反应器阀门至 "旁路" 并用培养基预填充泵。
5. 转动生物反应器阀门至 "流" 以0.1 mL/min的流速向生物反应器中预填充培养基。

3. 细胞样品的制备

1. 从 CO₂ 培养箱中收集细胞。
   1. 从 CO₂ 培养箱中取出一个装有转染 HEK293T 细胞的 T75 培养瓶，并弃去旧培养基。
   2. 用 7 mL（每次）室温（约 20 °C）的 PBS 洗涤细胞两次。
   3. 加入 2 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液使细胞脱落。添加溶液后，在室温下孵育 5 分钟以使细胞脱落。
      注意：转染后的细胞可能需要稍长时间才能脱落。如有必要，可在 37 °C 下孵育细胞。
   4. 加入 20 mL 完全 DMEM 培养基以灭活胰蛋白酶；通过反复吹打充分重悬细胞，并将其转移至 50 mL 离心管中。
   5. 在室温下以 800 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   6. 用 10 mL 室温 PBS 洗涤细胞，以去除残留的培养基。
   7. 在室温下以 800 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   8. 将细胞沉淀转移至一个 1.5 mL 带盖离心管中。
2. 将细胞包埋于琼脂糖丝中。
   1. 将一份凝固的琼脂糖在 85 °C 水浴中融化，随后置于 37 °C 金属浴中保温，保持液态。
   2. 使用巴斯德吸管，向流动单元 NMR 管底部加入 60–70 µL 的 1.5% 琼脂糖凝胶，并将其置于冰上。这将形成一个约 5 mm 高的底部塞，以便将细胞样品置于 ¹H NMR 线圈的有效检测区域内。
   3. 将步骤 3.1.8 获得的细胞沉淀在 37 °C 金属浴中加热 15–20 秒。
   4. 将细胞重悬于 450 µL 琼脂糖溶液中。操作时需小心，避免产生气泡。
   5. 将细胞-琼脂糖悬液吸入一段长约 30 cm 的色谱 PEEK 管（内径 = 0.75 mm），该管连接至 1 mL 注射器。
      ​注意：在吸入前，应先用室温 PBS 预填充 PEEK 管及注射器的死体积，以避免气泡形成。管子的长度并非关键因素。
   6. 让 PEEK 管在室温下冷却 2 分钟。
   7. 用 100 µL 室温 PBS 预填充流动单元 NMR 管。
   8. 缓慢推动注射器，将包埋在琼脂糖中的细胞丝注入流动单元 NMR 管中。
      ​注意：为使 NMR 管填充均匀，应先将 PEEK 管末端置于 NMR 管底部，然后一边缓慢左右摆动，一边向上推进。
   9. 重复步骤 3.2.5、3.2.6 和 3.2.8，直至所有细胞-琼脂糖悬液均被注入。
3. 将细胞插入生物反应器。
   1. 从流动单元中取出空的 NMR 管，并将流速提高至 2 mL/min，持续数分钟，以清除进样管路中的残留气泡。
   2. 将流速调至 0.2 mL/min，然后缓慢而稳定地向上推入含有细胞的 NMR 管。
      ​注意：持续的培养基流动可防止在插入过程中发生进样管内容物倒流。

4. 生物反应器操作与清洗

1. 核磁共振实验期间的生物反应器操作。
   1. 将核磁共振波谱仪的温度设置为 310 K。
   2. 将流动单元插入波谱仪中。
   3. 在整个原位核磁共振实验过程中，以 0.1 mL/min 的流速供给生物反应器培养基。
   4. 在实验所需的特定时间点，使用无菌长针注射器穿刺硅胶管，向培养基储液瓶中注入浓缩的外源分子溶液。
      注意：培养基中外源分子的终浓度应根据已知的细胞毒性数据，以及（如可获得）分子跨细胞膜的预测或估算扩散速率来确定。
   5. 核磁共振实验结束后，将含有细胞的管道更换为空管，并用水冲洗流动单元。
2. 生物反应器原位清洗。
   1. 以 1 mL/min 的流速依次流过以下溶液清洗流动单元：0.2 M 氢氧化钠（NaOH）；3 M 柠檬酸；0.2 M NaOH，每种溶液至少清洗 30 分钟，最后用经无菌过滤的超纯水冲洗 >2 小时。
   2. 每次运行后，清洗并高压灭菌储液瓶和管路组件。

5. 核磁共振实验

1. 核磁共振实验的设置。
   注意：在制备细胞内核磁共振样品之前，应提前完成这些步骤，以避免细胞收集与数据采集之间出现任何延迟。
   1. 在核磁共振波谱仪上创建一个新的数据集，并设置所需核磁共振实验的参数。
   2. 设置一维¹H核磁共振实验的参数。
   3. 将¹H载波频率中心设在水信号的4.7 ppm处。
   4. 选择zgesgp脉冲程序，设置谱宽为20 ppm，并使用1,000 µs的180°方波脉冲进行水信号抑制。设置扫描间延迟为1 s。采集32次扫描的谱图。
   5. 对于表达未标记CA II的细胞：选择p3919gp脉冲程序，设置谱宽为30 ppm以覆盖谱图的亚氨基区域，并调整二项式水信号抑制的延迟，使最大激发位于目标信号的化学位移处（在950 MHz下d7 = 20 µs）。设置扫描间延迟≥1 s。采集512次扫描。
   6. 对于表达¹⁵N标记SOD1的细胞：选择sfhmqf3gpph脉冲程序，设置¹H和¹⁵N的谱宽分别为16 ppm和50 ppm，形状脉冲偏移和激发带宽分别为8.5 ppm和6 ppm，并使用350 µs脉冲用于去耦方案（根据仪器选择garp4或其他）。设置扫描间延迟为0.3 s。采集16次扫描，并在¹⁵N维上设置128个增量。
2. 实时核磁共振谱图采集。
   1. 将生物反应器插入核磁共振波谱仪后，等待几分钟以允许培养基交换。
      注意：随着PBS被含2% D₂O的培养基替换，锁场信号的出现可轻松监测此过程。
   2. 调节¹H通道的匹配与调谐，匀场，并计算¹H 90°硬脉冲长度。
   3. 根据¹H硬脉冲调整每个脉冲序列中的¹H功率水平。
   4. 记录第一张zgesgp ¹H谱图，以检查样品内容和磁场均匀性。
   5. 将zgesgp以及p3919gp/sfhmqcf3gpph实验复制到所需数量，并将其加入采集队列中。
      注意：zgesgp谱图仅用于监控样品状态和磁场均匀性；因此，可选择跳过或减少采集频率。
   6. 对于表达未标记CA II的细胞：通过应用零填充和指数线宽窗口函数（LB = 20 Hz）处理p3919gp谱图。
   7. 对于表达¹⁵N标记SOD1的细胞：在两个维度上应用零填充和平方正弦钟窗函数（SSB = 2）处理sfhmqcf3gpph谱图。
      ​注意：可通过去除无信号区域进一步减小处理后谱图的大小（在Topspin中，通过设置所需的STSR和STSI值实现）。

6. MCR-ALS 分析

1. 对于 CA II 谱图的分析，在 MATLAB R2019b 中导入一维谱图区域。
   1. 在软件中，于 Process Dataset List 菜单中创建待导出的实验列表。
   2. 使用修改版的 au 程序 convbin2asc，将每张谱图中感兴趣的谱图区域以 ASCII 格式导出。
      注：此操作将在每个谱图子目录中生成一个名为 ascii-spec.txt 的文本文件。
   3. 在 MATLAB 中，使用自定义脚本 Load_ascii_spectra 导入谱图区域。
      注：该脚本需要输入数据集目录，生成一个包含堆叠的一维谱图的二维数组 spectra，以及一个包含化学位移的一维数组 cs。
   4. 运行 Load_acqus 脚本，从一维谱图中提取时间戳。
      注：该脚本生成一个一维数组 times_hours，其中包含每张谱图的时间增量（以小时为单位），初始谱图的时间为 0。
2. 对于 SOD1 谱图的分析，在 MATLAB R2020b 中导入二维谱图。
   1. 在 Topspin 中，于 Process Dataset List 菜单中创建待导出的实验列表。
   2. 在 MATLAB 中，使用自定义脚本 Load_2D_spectra 导入二维谱图。
      注：该脚本需要输入数据集目录，生成一个包含堆叠的二维谱图的三维数组 Spectra，以及一个包含化学位移的一维数组 cs。
   3. 运行 Load_acqus 脚本，从二维谱图中提取时间戳。
   4. 在自定义脚本 Cut_2D_spectra 中指定感兴趣的谱图区域，并运行该脚本以切割出三维子数组 [（¹H × ¹⁵N）谱图强度 × 时间]；将其重塑为二维数组（时间点 × 谱图强度），并连接在一起。
      注：此操作生成一个二维数组 JoinSpec_flat，其中包含经重塑和连接的谱图区域。
3. 以图形用户界面（GUI）模式运行 MCR-ALS 2.0。
   1. 通过运行 mcr_main 脚本打开 MCR-ALS 2.0 图形用户界面。
   2. 在 数据选择 选项卡中，加载谱图数据或 JoinSpec_flat 矩阵。数据可绘图以供检查。
   3. 通过奇异值分解（SVD）或手动方式评估组分数目。
      注：组分数目应与实验中存在的不同物种数目相对应。本例中 n = 2，对应游离态和结合态蛋白质。
   4. 选择纯谱图初始估计的方法。可使用最纯变量检测法或渐进因子分析法（EFA）。
   5. 在 数据集选择 窗口中，选择 继续。
   6. 在 约束条件：行模式 窗口中设置浓度的约束条件。应用非负性约束，选择 fnnls（快速非负最小二乘法）作为 "实现方式，并设置 2 个物种"。应用 1 个闭合约束，将约束值设为 1，闭合条件设为 "等于"，并应用于所有物种。
      注：此约束强制每个物种的浓度之和等于 1，从而使各物种的浓度分布相对于总蛋白浓度归一化。
   7. 在 约束条件：列模式 窗口中设置谱图的约束条件。应用非负性约束，选择 fnnls 作为 "实现方式，并设置 2 个物种"。
      注：若核磁共振（NMR）谱图中存在负信号，则不应应用此约束。
   8. 在最终窗口中，设置迭代次数为 50，收敛判据为 0.01。指定浓度、谱图和标准偏差的输出名称。点击 继续 以运行 MCR-ALS 拟合。
      ​注：图形窗口将显示拟合结果，包括各纯组分的浓度分布和谱图。
   9. 对于 SOD1 数据集：使用自定义脚本 Rebuild_2D_spectra，从 MCR-ALS 的一维输出重建二维谱图区域并进行绘图。

7. 台盼蓝染色实验

1. 用巴斯德移液管回收核磁管中的内容物，将琼脂糖纤维转移至一个1.5 mL带盖离心管中。
2. 用600 µL磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗琼脂糖纤维以去除残留培养基，于室温下以4,000 × g 离心1分钟，弃去上清液。
3. 加入250 µL PBS和50 µL 0.4%台盼蓝溶液。
4. 持续吹打混匀，孵育2分钟。
5. 用600 µL PBS洗涤两次，每次均弃去上清液。
6. 将少量琼脂糖纤维置于显微镜载玻片上，用刀片将其切碎，制成小片状凝胶。选择最薄的凝胶片（厚度 < 0.4 mm，理想情况下约0.2 mm）用于分析。
7. 将凝胶片转移至自制的细胞计数室中，该计数室由两片玻璃载片构成，两侧各用三层石蜡膜（总厚度约0.4 mm）隔开。
   注意：也可使用腔室载玻片；然而，若凝胶片厚度超过腔室高度（0.1 mm），则会受到挤压，导致包埋的细胞破裂。
8. 采集琼脂糖凝胶内细胞的图像，并计数无色（白色）细胞和蓝色细胞。
9. 按公式计算细胞活力：（总细胞数 - 蓝色细胞数）/ 总细胞数。

结果

上述方案可将细胞包封于水凝胶纤维中，以在较长时间内最大限度地维持细胞活性，从而实现实时观察细胞内过程。在生物反应器中，细胞可保持存活且代谢活跃长达72小时，台盼蓝染色实验已证实了这一点（图2a-c）。原则上，该方案可用于实时监测任何发生构象或化学变化的细胞内目标蛋白。在上述第一项应用中，利用该生物反应器实时监测两种抑制剂AAZ和MZA与在HEK293T细胞胞质中过表达的CA II蛋白的结合过程。首先记录的¹H激发塑形谱（zgesgp）用于评估总体信号强度（与细胞数量成正比）、过表达蛋白信号的存在情况以及磁场均匀性（图2d）。对于CA II蛋白，可通过WATERGATE 3-9-19³⁵一维¹H核磁共振谱（p3919gp）观察11至16 ppm区域内的¹H信号，来监测两种抑制剂在细胞内的结合情况。这些信号来源于CA II中与锌离子配位的组氨酸及其他芳香族残基，在配体结合后其信号会发生扰动³⁶，并随配体结合而发生变化^14,15。配体浓度可根据其扩散速率选择，或在已有数据的情况下参考先前测定的通透性值¹⁴。结合成功的标志是在目标谱图区域出现一组新的信号，并逐渐取代原有信号，可通过视觉直接确认（图3）。通过MCR-ALS分析获得时间依赖性的结合曲线，该方法可分离出来源于游离态和结合态CA II的两组核磁信号（图4a），并同时提供两种蛋白形态的相对浓度变化曲线（图4b）。在第二项应用中，该生物反应器被用于监测在人源细胞中，由谷胱甘肽过氧化物酶模拟物依布硒啉（ebselen）促进的锌结合型SOD1分子内二硫键的形成过程。该过程通过观察¹H-¹⁵N二维SOFAST-HMQC³⁷谱图（可提供蛋白质骨架构象的特征指纹）的变化进行监测，这些变化由二硫键形成所引起的蛋白质结构扰动导致。在¹H-¹⁵N谱图中，来源于二硫键氧化态SOD1的新信号逐渐出现，并逐步取代还原态SOD1的原有信号。对二维谱图中选定区域进行MCR-ALS分析，可分离出两种蛋白形态的信号（图5a），并获得其相对浓度变化曲线（图5b）。所得浓度曲线可进一步通过非线性拟合分析，以获取所研究过程的动力学信息²⁵。

图1：生物反应器示意图。 左图：空流管单元的横截面视图。右图：生物反应器装置示意图。聚醚醚酮（PEEK）进样管以绿色显示；聚四氟乙烯（PTFE）出样管以蓝色显示。左图经Luchinat等²⁵许可转载。请点击此处查看此图的放大版本。

图2：包封细胞的台盼蓝检测及通过¹H NMR进行的样品检测。 琼脂糖中包埋细胞并用台盼蓝染色后的代表性切片：(a) 刚成型后，以及(b) 在生物反应器中培养72小时后；(c) 在核磁共振生物反应器中，通过台盼蓝检测法测定的细胞活力随时间的变化，黑色代表有主动流动的条件，红色代表静态条件；(d) 在过表达CA II的琼脂糖包埋细胞上记录的zgesgp ¹H NMR谱图，黑色谱线为生物反应器中无气泡时测得，红色谱线为有气泡时测得。后者由于磁场均匀性下降，导致谱线展宽以及溶剂抑制伪影的出现。图中已标注具有意义的谱图特征。图(a-c) 经Luchinat等²⁵许可转载。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：在生物反应器中对海藻糖包埋细胞获得的代表性实时细胞内¹H NMR数据。在NMR生物反应器中，随时间记录的过表达CA II的HEK293T细胞的一维¹H NMR谱图（15.6至11.1 ppm区间）的瀑布图，细胞分别用(a) 25 µM AAZ 和 (b) 10 µM MZA处理。配体处理时间以箭头标示。谱图强度（a.u.）采用颜色编码，从蓝色（最低）到黄色（最高）。本图经Luchinat等²⁵许可转载。请点击此处查看此图的放大版本。

图4：由一维核磁共振谱图经MCR-ALS分析得到的代表性输出结果。 （a）通过MCR-ALS重构的各纯组分的¹H核磁共振谱图：无配体存在时的CA II（黑色），以及与AAZ（红色）或MZA（洋红色）结合形成的复合物；（b）通过MCR-ALS获得的游离态（黑色）和结合态CA II随时间变化的相对浓度分布，其中加入AAZ（红色）或MZA（洋红色）的时间点以箭头标示。本图经Luchinat等人²⁵许可转载。请点击此处查看此图的放大版本。

图 5：来自二维核磁共振谱的MCR-ALS代表性输出结果。 （a）通过MCR-ALS重建的纯组分的¹H-¹⁵N谱区（标记为I-IV）：二硫键还原态SOD1（黑色）和二硫键氧化态SOD1（红色）；（b）加入依布硒啉（以箭头标记）后，通过MCR-ALS获得的纯组分相对浓度随时间变化曲线。本图经Luchinat等²⁵许可复制。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在细胞内核磁共振（NMR）实验中使用生物反应器的目的是使细胞在较长时间内保持存活并具有代谢活性。为实现这一目标，必须考虑若干关键因素。首先，在制备细胞样品和进行NMR数据采集过程中，必须严格避免细菌污染。如果实验室中使用了常用于基因克隆和重组蛋白表达的大肠杆菌（E. coli）或其他细菌菌株，这些菌株可能在样品制备过程中污染细胞。一旦进入生物反应器，细菌会迅速利用新鲜培养基生长，并因产生内毒素而导致细胞死亡。细菌污染通常仅在晚期才被发现，此时培养基会变为黄色且浑浊。此外，生物反应器清洁不彻底可能导致泵或管路被细菌、酵母或常见霉菌污染。

实验成功的关键要求是避免气泡的形成。在核磁共振线圈的活性体积内，若琼脂糖丝之间滞留有气泡，会引入显著的磁场不均匀性，导致水（H₂O）信号抑制不完全，并严重降低谱图质量（图2d）。气泡可能由系统中滞留的空气或生成的气态CO₂引起。前者可通过在插入细胞样品前用培养基冲洗系统来轻松避免；为避免后者，建议降低培养基中NaHCO₃的浓度，并使系统的各个部分保持恒定温度，以尽量减少CO₂溶解度的差异。细胞的有氧代谢也可能产生气态CO₂，可通过提高流速来防止。

每次运行后应通过台盼蓝染色法检测细胞活力。然而，该方法无法提供有关细胞代谢活性的信息。为了更全面地了解生物反应器运行过程中细胞的代谢状态，可进行³¹P核磁共振（NMR）谱分析，以评估ATP随时间的生成情况^23,25。但该测量通常需要专用探头，该探头可能允许同时记录¹H NMR信号。

对于碳酸酐酶II（CA II），其¹H谱图中非典型区域存在分辨良好的报告信号，这使得仅通过简单的1D NMR谱图即可进行分析，且在蛋白表达过程中无需进行同位素标记。通常情况下，其他蛋白也可能在其他区域产生可用于监测谱图变化的¹H信号，例如位于0至-1 ppm之间的蛋白疏水核心典型区域¹¹；然而，对于分子量大于约10 kDa的折叠蛋白，这些区域的信号通常过于拥挤。在此情况下，如SOD1所示，更优的方法是在蛋白表达过程中使用均匀¹⁵N标记的培养基对蛋白进行¹⁵N富集，并监测2D ¹H-¹⁵N NMR谱图的实时变化。2D谱图以二维数组形式导入MATLAB，重新排列为一维数组并进行堆叠，随后进行MCR-ALS分析。后一种方法普遍适用于任何能产生可检测信号的胞内蛋白，并可提供单个氨基酸残基水平上的蛋白构象变化信息。原则上，该方法可推广至n维谱图及其他同位素标记方案。

关于该方法在不同类型细胞中的应用，本方案可轻松适用于不同的细胞系，且不要求目标蛋白在细胞内直接表达。因此，可将本方案与其他细胞内核磁共振（NMR）方法结合使用，例如通过重组表达或化学合成目标大分子，再通过电穿孔或其他递送方法将其导入细胞^1,9,38。当使用不同的细胞系或样品制备方案时，可能需要根据经验优化琼脂糖浓度、纤维直径以及琼脂糖纤维中细胞的最终密度等参数。此外，本方案的适用性仅限于能够耐受琼脂糖包埋的细胞。其他类型的细胞可能需要采用不同的水凝胶配方；而对于天然悬浮生长的细胞，则建议采用不同的装置，例如使用同轴微透析膜，在保证营养物质扩散的同时将悬浮细胞限制在NMR管内²³。

与其他核磁共振生物反应器设计^19,20,21,22相比，本文所述装置基于一种市售的流动单元，仅需进行少量修改即可适配。因此，该装置可在不同实验室中轻松复制，且具有高度的可重复性。此外，若需要，该装置还支持标准化操作，并完全符合严格的实验室安全规范。总体而言，该生物反应器具备良好的灵活性和操作便捷性，除已有报道的应用^23,25外，还可拓展溶液核磁共振在细胞内及体外的多种其他应用。未来，只要找到合适的支架材料以维持样品在核磁共振波谱仪中的存活甚至生长，该生物反应器设计还可应用于更接近组织生理环境的样品，如球状体或类器官。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>材料
柠檬酸	Sigma-Aldrich	251275
D2O	Sigma-Aldrich	453366
DMEM，高糖	Life Technologies	10313-021
DMEM，高糖，粉末	Sigma-Aldrich	D5648
FBS	Life Technologies	10270
HCl	Sigma-Aldrich	30721
L-谷氨酰胺（200 mM）	Life Technologies	25030
低熔点琼脂糖，粉末	Sigma-Aldrich	A4018
NaHCO3，粉末	Carlo Erba	478537
PBS	Life Technologies	10010
青霉素–链霉素（10,000 U/ml）	Life Technologies	15140-122
NaOH，颗粒状	Sigma-Aldrich	30620
0.4% (wt/vol) 台盼蓝溶液	Sigma-Aldrich	T8154	危险性说明：H350 可能导致癌症。
胰蛋白酶–EDTA（0.05%（wt/vol））	Life Technologies	25300-054
<强>仪器设备
配备5 mm CryoProbe的Avance III波谱仪	Bruker	n/a	所有配备5 mm探头的现代光谱仪和窄孔径磁体均兼容。
InsightMR 流体单元	Bruker	n/a
P-920 泵模块来自 ÄKTA FPLC	GE Healthcare	n/a	任何FPLC、HPLC蠕动泵或注射泵均应与该流体单元兼容。