采用0.9%生理盐水（35 mL/kg体重，37 °C）进行表面活性物质冲洗，结合低呼气末正压（PEEP）下的高潮气量通气，可导致中度呼吸机相关性肺损伤（VILI），从而建立实验性急性呼吸窘迫综合征（ARDS）模型。该方法可产生低/有限可复张性的肺损伤模型，适用于长期研究不同通气策略的影响。
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方法文章
表面活性物质耗竭联合损伤性通气可建立可重复的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
目前存在多种动物模型用于研究急性呼吸窘迫综合征（ARDS）复杂的病理机制。这些模型包括肺动脉注射油酸、内毒素或细菌输注、盲肠结扎穿孔、各种肺炎模型、肺缺血/再灌注模型，以及表面活性物质耗竭模型等。表面活性物质耗竭可导致肺气体交换和血流动力学迅速且可重复地恶化，可在麻醉猪中通过反复使用0.9%生理盐水（35 mL/kg体重，37 °C）进行肺灌洗来诱导。该表面活性物质耗竭模型支持采用临床常规设备进行标准呼吸和血流动力学监测的研究。然而，该模型具有相对较高的肺泡可复张性，使用高气道压通气可立即通过重新开放萎陷的肺区域而减轻损伤程度。因此，该模型不适用于研究采用高气道压的呼吸机通气策略。将表面活性物质耗竭与高潮气量/低呼气末正压（高Tv/低PEEP）的损伤性通气相结合，以诱发呼吸机相关性肺损伤（VILI），可降低所形成肺损伤的可复张性。该联合模型仍保留了可及时诱导损伤以及在类似重症监护病房环境下开展实验研究的优势。
引言
自1967年Ashbough和Petty首次描述急性呼吸窘迫综合征（ARDS）以来，尽管开展了大量研究，其死亡率仍高达40%以上12。由于伦理问题以及基础病理、环境条件和合并用药缺乏标准化，临床上对新型治疗方法的探索受到限制，而动物模型则能够在标准化条件下实现系统性研究。
因此，可通过多种方法在大型动物（如猪）或小型动物（如啮齿类动物）中诱导实验性急性呼吸窘迫综合征（ARDS），这些方法包括肺动脉灌注油酸、静脉（i.v.）输注细菌和内毒素，或通过盲肠结扎穿刺（CLP）模型引发脓毒症所致的ARDS。此外，还可采用由烧伤和烟雾吸入或肺缺血/再灌注（I/R）引起的直接肺损伤模型3。其中一种常用的直接肺损伤模型是通过肺灌洗清除肺表面活性物质，该方法最初由Lachmann等人在豚鼠中描述4。
表面活性物质耗竭是一种高度可重复的方法，可迅速导致气体交换和血流动力学功能受损5。其主要优势在于可在大型动物物种中应用，从而支持使用临床常用机械通气机、导管和监护仪开展相关研究。然而，表面活性物质耗竭模型的一个主要缺点是，当施加高气道压力或肺复张操作（如俯卧位）时，会立即复张已萎陷的肺区域。因此，该模型不适用于研究例如长时间采用高呼气末正压（PEEP）的自动化通气策略6。Yoshida 等人描述了一种将表面活性物质耗竭与高吸气气道压力通气相结合的方法，以诱导 实验性急性呼吸窘迫综合征（ARDS）7，但该模型需要通过反复进行血气分析，并根据吸气压力与PEEP的滑动调节表不断调整驱动压，以维持氧分压（PaO2）在预设范围内，操作较为复杂。
总体而言，采用过度激进的损伤性通气方式，或频繁费力地调整通气策略，可能导致肺部结构损伤过于严重，进而引发多器官功能衰竭。因此，本文详细介绍了一种易于实现的实验性急性呼吸窘迫综合征（ARDS）模型，该模型通过表面活性物质耗竭联合高潮气量/低呼气末正压（高Tv/低PEEP）的损伤性通气方式建立，可支持在较长时间内使用临床相关通气参数开展研究。
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方案
实验在德国柏林夏里特—柏林大学医学中心实验医学系（根据 EN DIN ISO 9001:2000 认证）进行，并在实验开始前获得德国柏林联邦动物实验管理机构的批准（批准号：G0229/18）。所有实验均遵循实验室动物护理原则，并符合欧洲和德国实验动物科学学会的指导方针。
1. 实验动物与动物福利
- 在3-4月龄、体重（bw）为30-40 kg的深度麻醉雄性猪（German Landrace × Large White）中进行所有实验。
2. 麻醉、插管和机械通气
- 麻醉前12小时不要提供干饲料，以避免猪胃内食物过满。可自由饮水，并提供稻草或干草以减轻应激。
- 在动物仍处于饲养设施中时，为尽量减少应激，通过肌肉注射给予猪颈部肌肉以下混合药物进行术前给药：氮哌酮（3 mg/kg 体重）、阿托品（0.03 mg/kg 体重）、氯胺酮（25 mg/kg 体重）和赛拉嗪（3.5 mg/kg 体重）。
注意：实验前每天训练时，在喂食几块糖块的同时抚摸动物颈部，并在注射时以训练过的相同方式喂食糖块，有助于顺利进行术前给药，并进一步减轻动物应激。- 将动物置于担架上，麻醉达到适当水平后，用布遮盖眼睛以便运输。
- 将猪转移至手术室，并始终确保其具有足够的自主呼吸。
- 若饲养设施与实验室不相邻，在运送猪只时应携带氧气瓶、连接管路和面罩，以提供补充氧气。
- 将猪置于俯卧位，并使用适合动物吻部的面罩，以高流量氧气（例如10 L/min）进行预充氧。
- 使用外周静脉导管（通常为18或20 G）建立静脉通路。用酒精棉片消毒后，将外周静脉导管置入耳缘静脉之一。
- 使用平衡晶体液开始输注，并确保导管位置正确，以便后续输注麻醉药物。
- 以500 mL平衡晶体液静脉快速输注，随后以4 mL/kg/h持续输注以维持液体支持。
- 开始监测外周血氧饱和度（SpO₂）2）通过固定 SpO2-传感器置于一只耳朵或尾部。
- 通过注射丙泊酚（约5-10 mg/kg，确切剂量取决于预麻醉药物的效果，因动物个体而异）诱导麻醉，以进行经口插管。
注意：预先注射阿片类药物可进一步促进插管，但需要充足的经验以避免动物过早出现呼吸暂停。可在注射丙泊酚前重复给予100 µg芬太尼（枸橼酸芬太尼，100 µg/mL），直至自主呼吸频率减慢至约20次/分钟。 - 使用带套囊的气管插管（内径 7.5 - 8.0 mm）和专为大型动物设计的喉镜（直型镜片，长约 25 cm）对动物进行插管。
注意：根据 Theisen 等人详细描述的方法，俯卧位下进行插管最为方便。8.- 通过观察典型的二氧化碳波形来确认气管插管的位置2 在呼气过程中于 CO2- 监护仪（二氧化碳波形监测仪）。
- 通过听诊检查双侧呼吸音是否对称。
注意：如果插管失败或延迟，可通过双手手动挤压肋骨两侧进行机械通气，同时以高流量供给氧气。
- 设定吸入氧分数（F我O2）调至1.0，呼吸频率调至15–20次/分钟，潮气量调至8–9 mL/kg体重，吸气与呼气比（I:E）调至1:1.5，并施加5 cmH₂O的呼气末正压（PEEP）2O 开始机械通气。调整参数设置，以达到目标呼气末二氧化碳分压（P和CO2) 为 35-40 mmHg，且 SpO2 高于 95%。
- 使用硫喷妥钠（20 mg/kg/h）和芬太尼（7 µg/kg/h）持续静脉输注以维持麻醉。
注意：所需剂量可能因动物个体及实验条件的不同而有所差异。为保障动物福利并确保科学性，实验过程中必须维持足够的麻醉深度。 - 在操作过程中密切监测动物的应激/疼痛反应（如心率、血压或呼吸频率升高）。
注意：如果麻醉深度足够，可在不使用肌肉松弛剂的情况下进行器械操作。 - 如实验需要肌肉松弛（例如，在表面活性剂耗竭前、在损伤性通气前），可给予肌肉松弛剂，例如泮库溴铵（0.15 mg/kg 体重静脉推注，随后以 0.15 mg/kg 体重/小时持续输注，或重复推注给药） 肺顺应性测量
- 使用硫喷妥钠（20 mg/kg/h）和芬太尼（7 µg/kg/h）持续静脉输注以维持麻醉。
- 仪器技术
- 将动物置于仰卧位。
- 翻转动物时，固定好气管插管和静脉输液管。
- 使用绷带回缩腿部，以拉伸计划切口部位上方的皮肤。
- 使用适当的皮肤消毒剂（如酒精和1%碘溶液）对操作区域进行消毒。
- 用中心静脉导管穿刺外颈静脉，同时将肺动脉导管（PAC）的引入鞘插入同一静脉。
- 在连接下颌骨与胸骨的连线上做一条10 cm的皮肤切口（可选择左侧或右侧）。
- 始终重新评估麻醉深度，并在必要时调整剂量。
- 用组织镊和手术剪分离皮下组织和胸骨舌骨肌，直至暴露出肩胛舌骨肌和胸锁乳突肌。
- 继续采用钝性分离法，切开肌肉间的筋膜，直至暴露出颈外静脉。
- 使用塞耳丁格技术9 使用中心静脉导管和导入鞘对外颈静脉进行插管，以便后续插入肺动脉导管（PAC）。
注意：不要使用扩张器扩张静脉，这与经皮入路的方法不同，否则会导致静脉撕裂。使用标准缝线进行关闭。鞘管的尺寸取决于所选肺动脉导管（PAC）的大小。在体重为30–40 kg的猪中，可使用6F导引鞘管（长度10 cm）和5F肺动脉导管（长度75 cm）。 通常使用。
- 股动脉插管以进行有创血压监测。
- 确定后肢（左侧或右侧均可）股薄肌与缝匠肌之间的皱褶，以放置动脉导管。
注意：股动脉搏动应容易触及。 - 采用塞丁格技术经皮穿刺插管动脉9.
- 如果动脉不易触及，应采用直接法。
- 用手术剪沿5 cm长切口切开皮肤，用组织镊分离皮下组织。
- 采用钝性分离技术，沿肌间隙切开筋膜，直至股动脉水平。
注意：进行切开操作时，切勿在隐静脉血管的头侧进行，以免损伤隐静脉血管。 - 在股动脉周围结扎一根结扎线，以便在穿刺部位发生出血时可闭合血管。应尽可能避免此步骤，因其会损害后肢的血液供应。
- 采用塞丁格技术进行动脉插管9.
- 确定后肢（左侧或右侧均可）股薄肌与缝匠肌之间的皱褶，以放置动脉导管。
- 将传感器与大气压（零点）校准，并分别与200 mmHg（动脉导管）或50 mmHg（中心静脉导管）进行校准，然后将其连接至动脉导管和中心静脉导管，开始监测。
- 将压力传感器置于胸腔高度约一半处，即右心房的估计位置。
- 在膀胱上方的皮肤处做一个4-5 cm的小切口，以进行膀胱导尿。
- 使用钝性器械分离皮下组织。
- 在膀胱壁上缝合一圈荷包缝合线（直径1-2 cm）。
注意：缝合不应穿透膀胱壁全层，否则会导致尿液从穿刺处渗漏。 - 在缝线中间做一个小切口，并插入导尿管。
- 立即用10 mL蒸馏水封闭球囊，并将导管向膀胱壁方向牵拉，直至感到轻微阻力。
- 收紧导管周围的荷包缝合线。使用标准缝合方法闭合皮肤。
3. 肺动脉导管（PAC）的置入
- 根据导管尺寸，使用 0.5–1 mL 空气检查肺动脉导管（PAC）气囊的通畅性，然后再次将气囊放气。
- 将肺动脉导管连接至压力传感器系统，并以大气压（零点）和 100 mmHg 为参考校准传感器。
- 将气囊放气后，通过置入鞘管送入肺动脉导管 10–15 cm（根据鞘管长度而定）。
- 导管离开鞘管后，充盈气囊，并在持续监测压力及压力监测仪上典型波形的同时继续推进导管。
- 在观察到右心房、右心室和肺动脉的典型波形时继续前送导管，当出现肺毛细血管楔压（PCWP）波形时停止推进。
- 在呼气末记录 PCWP 数值，随后放空气囊（参见 图1 中相应曲线）。
注意：气囊放气后，PCWP 波形应消失，同时应重新出现肺动脉压力波形。若无法观察到肺动脉压力波形，则提示导管很可能插入过深，已进入肺动脉分支并形成“自楔压”位置，导致肺血管持续阻塞。此时必须将导管回撤，直至肺动脉压力波形重新出现，以避免并发症（如肺血管破裂）10。在猪模型中，肺动脉导管常经下腔静脉误入肝静脉。因此，若送管约 30–50 cm 后仍未记录到右心室压力信号，应将导管回撤并重新操作。
4. 用于血流动力学测量的肺动脉热稀释技术
- 使用热稀释法测量心输出量（CO）11.
- 将热敏电阻和流通式探头外壳连接至肺动脉导管（PAC）相应的管腔。
- 接下来，将血流动力学监测仪与肺动脉导管（PAC）的远端温度端口（红色帽）连接。
- 根据导管尺寸、导管长度、注入盐水体积及盐水温度，将血流动力学监测仪调整至相应的校正模式。
- 以最快速度注射适当体积的0.9%生理盐水（通常为5或10 mL、温度为4 °C的0.9%生理盐水）。
- 等待测量完成。
- 在呼吸机的呼吸周期内快速连续随机化五次测量。
- 删除最高值和最低值，使用剩余的三个值计算平均值。
- 将该平均值记为心输出量。
- 随后通过充盈导管气囊测量肺毛细血管楔压（PCWP），测量完成后放空气囊。
- 使用平均动脉压（MAP）、肺动脉压（PAP）、中心静脉压（CVP）、肺毛细血管楔压（PCWP）和心输出量（CO）进行所有后续的血流动力学计算。
注意：测量前必须将生理盐水的体积和温度输入监护仪。生理盐水必须保持在相同温度（通常 <5 °C）以确保测量准确。还需输入导管的尺寸和长度。某些监护仪需要输入校正系数。 - 对于涉及电解质平衡精确测量的研究，应使用5%葡萄糖溶液而非0.9%生理盐水。
- 务必记录所有参数。在心输出量测定前或后不久，同时采集动脉血和混合静脉血样本，以便计算肺内右向左分流。
- 记录所有所需的呼吸参数和测量值，以完成数据集，例如 峰压、平台压和呼气末压力。
注意：麻醉诱导、插管和完全仪器连接可能需要1.5小时，具体时间取决于研究人员的经验和人数。
- 记录所有所需的呼吸参数和测量值，以完成数据集，例如 峰压、平台压和呼气末压力。
5. 表面活性剂去除
- 以 1.0 的 FIO2 对动物进行通气。
- 将动物与呼吸机断开。
- 通过连接至气管插管的漏斗，向肺内灌注预热的 0.9% 生理盐水（37 °C，35 mL/kg）。
- 操作时，将漏斗抬高至动物上方约 1 米处。
注：静水压力可使生理盐水分布至所有肺部区域。 - 当平均动脉压（MAP）降至 <50 mmHg 时，立即停止灌注。
- 操作时，将漏斗抬高至动物上方约 1 米处。
- 将漏斗降至地面水平以排出灌洗液。将动物重新连接至呼吸机以进行氧合。
- 等待动物恢复，必要时尽快重复灌洗操作。
注：是否需要进一步灌洗由 PaO2/FIO2 比值决定。- 每次灌洗后 5 分钟采集动脉血气样本。
- 重复灌洗，直至在 FIO2 为 1.0 且呼气末正压（PEEP）> 5 cmH2O 的条件下，PaO2/FIO2 比值（Horowitz 指数）持续低于 100 mmHg 至少 5 分钟。
注：在灌洗期间必须调整呼吸频率，以维持动脉 pH 值高于 7.25，防止血流动力学失代偿。
- 请注意，该动物模型基于表面活性物质耗竭与呼吸机诱导性肺损伤（VILI）的联合机制。
注：当 PaO2/FIO2 比值在 5 分钟内持续低于 100 时即停止灌洗，而非如先前报道的无 VILI 的表面活性物质冲洗模型那样在 60 分钟后停止5。- 达到目标 PaO2/FIO2 比值后，开始高潮气量/低 PEEP 通气模式。
注：否则，过度强烈的表面活性物质耗竭结合 VILI 可能导致多器官功能衰竭，从而影响实验结果。由于目标为特定的 PaO2/FIO2 比值，不同动物的表面活性物质耗竭所需时间存在差异，通常为 45 分钟至 1.5 小时。
- 达到目标 PaO2/FIO2 比值后，开始高潮气量/低 PEEP 通气模式。
6. 高潮气量/低呼气末正压（高Tv/低PEEP）所致的损伤性通气
- 维持吸入氧浓度（FIO2）为1.0。
- 将呼吸机设置为容量保证、压力控制通气模式。
- 将气道峰压报警阈值提高至60 mbar。
注意：呼吸机应施加最高达60 mbar的吸气压，但不得超过此值。 - 将呼吸频率降低至12次/分钟，并将吸气与呼气时间比（I:E）设置为1:1.5（即吸气时间为2秒，呼气时间为3秒）。
- 在至少2分钟内缓慢增加潮气量至17 mL/kg体重。
- 若达到60 mbar的吸气压力，则不再继续增加潮气量。
注意：由于肺表面活性物质冲洗后可能造成肺损伤，受限的吸气压力可能导致潮气量低于17 mL/kg体重。潮气量的突然增加可能导致气压伤或血流动力学失代偿。因此，必须在数分钟内缓慢递增潮气量。
- 若达到60 mbar的吸气压力，则不再继续增加潮气量。
- 将呼气末正压（PEEP）降低至2 mbar。
- 以该参数通气最长2小时（通气参数及流量曲线见图2）。
注意：使用高潮气量通气可实现良好的动物氧合，但反复接近完全的肺泡扩张与塌陷会导致肺组织结构损伤。此类结构性损伤无法通过肺复张手法、俯卧位通气、高PEEP等措施逆转。由此产生的肺损伤需在整个实验过程中予以接受。根据后续实验设计及研究持续时间，可能需要缩短高潮气量/低PEEP通气的时间。
7. 实验结束与安乐死
- 确保在诱导肺损伤后，完成实验方案中的所有测量操作。
- 通过中心静脉导管快速注射芬太尼（至少0.5 mg）以加强持续麻醉，等待至少5分钟；随后快速注射硫喷妥钠（至少1000 mg），紧接着注射至少60 mmol的钾。
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结果
所有动物在肺表面活性物质冲洗过程中，PaO2/FIO2 比值均下降（图3）。由此导致的低氧血症、高碳酸血症和肺不张引起肺动脉压升高。肺灌洗的详细操作此前已有报道6。
表面活性物质的清除操作需重复进行，直至在呼气末正压（PEEP）为5 mbar的机械通气条件下持续至少5分钟，动脉血氧分压（PaO2）与吸入氧浓度（FIO2）的比值仍低于100 mmHg。随后，采用高潮气量、低PEEP以及接近完全充气/放气的通气模式持续2小时，以诱发呼吸机诱导的肺损伤（VILI）。值得注意的是，在高潮气量通气过程中，由于周期性肺泡复张，气体交换参数（如氧饱和度、PaO2）可能有所改善，而平均肺动脉压（mPAP）通常因胸腔内压升高和高碳酸血症而持续升高（
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讨论
本文描述了一种在猪体内诱导实验性急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的方法，该方法结合了通过反复肺灌洗耗竭表面活性物质以及使用高潮气量、低呼气末正压（PEEP）并伴随肺部完全充气与放气的通气策略。这种组合可导致气体交换功能出现可重复且可比的恶化，并引发相应的血流动力学障碍，但限制了肺的可复张性。因此，该模型模拟了临床低可复张性的ARDS，可用于研究新的通气策略。
该方案存在一些局限性。首先，反复灌洗会导致出现临床（人类）急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的部分组织病理学特征，包括显著的肺不张、血管周围水肿形成以及肺泡-毛细血管膜增厚。高潮气量/低呼气末正压通气会增加诸如弥漫性肺泡出血等特征，而这些改变不易通过复张改善。然而，人类ARDS的一些重要特征，例如透明膜的形成，无法在数小时内诱导产生，因此在本模型中缺失2,3。其次，肺部的结构损伤在数小时甚至可能数天内是不可逆的。但必须注意避免对肺部造成过度的气压伤、容积伤和肺不张伤，否则将导致后续实验无法进行。根据文中所述的呼吸机参...
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披露
所有作者均声明不存在经济利益或其他任何利益冲突。
致谢
我们衷心感谢比尔吉特·布兰特（Birgit Brandt）提供的出色技术协助。本研究得到了德国联邦教育与研究部资助项目（FKZ 13GW0240A-D）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 伊芙 | Fritz Stephan GmbH | 急救呼吸机 | |
| 流通式腔室热敏电阻 | Baxter | 93-505 | 用于测量心输出量 |
| Leader Cath Set | Vygon | 1,15,805 | 动脉导管 |
| Mallinckrodt Tracheal Tube Cuffed | Covidien | 107-80 | 8.0 mm 内径 |
| MultiCath3 | Vygon | 1,57,300 | 三腔中心静脉导管，20 cm 长度 |
| Percutaneus Sheath Introducer Set | Arrow | SI-09600 | 肺动脉导管用导入鞘，适用于 4–6 Fr. 导管，10 cm 长度 |
| Swan-Ganz True Size Thermodilution Catheter | Edwards | 132F5 | 肺动脉导管，75 cm 长度 |
| 导尿管 | 无特定型号要求 | ||
| Vasofix Braunüle 20G | B Braun | 4268113B | 外周静脉导管 |
| Vigilance I | Edwards | 监护仪 |
参考文献
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