利用配体差异径向毛细管作用分析法（DRaCALA）鉴定小分子配体的结合蛋白

摘要

利用ORFeome文库，差异径向毛细管配体结合分析法（DRaCALA）可用于鉴定生物体中的小分子配体结合蛋白。

摘要

过去十年中，人们对细菌生理学中小信号分子的理解取得了巨大进展。特别是，多种核苷酸衍生的第二信使（NSMs）的靶蛋白已在模式生物中被系统性地鉴定和研究。这些进展主要得益于若干新技术的发展，包括捕获化合物技术以及配体差异径向毛细管作用分析法（DRaCALA），这些技术被用于系统性鉴定这些小分子的靶蛋白。本文以核苷四磷酸和五磷酸鸟苷（(p)ppGpp）这类NSMs为例，介绍并视频演示DRaCALA技术的应用。通过DRaCALA技术，在模式生物大肠杆菌（Escherichia coli）K-12中成功鉴定了20个已知靶蛋白中的9个以及12个新靶蛋白，展示了该分析方法的强大能力。原则上，DRaCALA可用于研究能够被放射性同位素或荧光染料标记的小分子配体。本文还讨论了DRaCALA技术的关键步骤、优势与局限性，以促进该技术的进一步应用。

引言

细菌利用多种小分子信号物质来适应持续变化的环境^1,2。例如，自诱导物N-酰基高丝氨酸内酯及其修饰的寡肽可在细菌之间介导细胞间通讯，协调群体行为，这一现象被称为群体感应²。另一类小分子信号物质是NSMs，包括被广泛研究的环腺苷酸（cAMP）、环二腺苷酸（cyclic di-AMP）、环二鸟苷酸（cyclic di-GMP）以及鸟苷五磷酸和四磷酸（p)ppGpp¹。细菌在应对多种不同应激条件时会生成这些NSMs。一旦生成，这些分子便会结合其靶蛋白，调控多种不同的生理和代谢通路，以应对所遭遇的应激环境并增强细菌的存活能力。因此，鉴定这些小分子的靶蛋白是解析其分子功能不可或缺的前提条件。

过去十年间，人们对这些小信号分子的认识迅速增长，这主要得益于几项技术革新，这些技术揭示了这些小分子的作用靶蛋白。这些技术包括捕获化合物技术^3,4,5，以及本文将要讨论的配体差异径向毛细管作用分析法（DRaCALA）⁶

方案

1. 全细胞裂解液的制备

1. 接种 E. coli K-12 ASKA ORFeome文库菌株¹⁵ 加入含有1.5 mL 赖氨酸肉汤（LB）的容器中 25 µg/mL 氯霉素置于96孔深孔板中。于37°C培养18小时过夜（O/N）。 30 °C 以160 rpm振荡培养。次日，向过夜培养物中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（终浓度0.5 mM），以诱导蛋白表达 30 °C 6 小时。
2. 500 × 离心收集细胞 g 10分钟。将沉淀在-80 °C 直至使用。为裂解细胞，加入 150 µL 裂解缓冲液L1（40 mM Tris pH 7.5，100 mM NaCl，10 mM MgCl₂）₂，加入2 mM苯基甲基磺酰氟（PMSF） 40 µg/mL DNase 1 和 0.5 mg/mL 溶菌酶）重悬沉淀。
3. 将细胞在 -80 °C 30 分钟，然后在 37 °C 20分钟。重复此循环三次以裂解细胞。将裂解物储存在-80 °C 使用前

2. Rel_seq 和 GppA 的纯化

注意：使用来自马链球菌（Streptococcus equisimilis）的重组蛋白 Rel_seq 和来....

结果

按照上述方案操作通常会产生两种类型的结果（图3）。

图3A 显示了一个背景结合信号相对较低的孔板（大多数孔的结合分数 < 0.025）。其中H3孔的阳性结合信号结合分数约为0.35，远高于其他孔的信号值。即使未经定量分析，H3孔的信号也十分显著，提示在H3孔中表达的靶蛋白可能与pppGpp、ppGpp或两者均发生结合。事实上，在H3孔中过表达的蛋白为次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶Hpt，已知其能够结合(p)ppGpp^12,16。

讨论

进行DRaCALA筛选的关键步骤之一是获得高质量的全细胞裂解液。首先，目标蛋白应大量表达并以可溶形式存在。其次，细胞裂解必须彻底，且裂解液的黏度必须尽可能低。加入溶菌酶并进行三次冻融循环通常足以实现完全的细胞裂解。然而，染色体DNA的释放会使裂解液变得黏稠，并导致非特异性结合信号升高，从而产生假阳性结果，如图3B、C所示。为减轻这一问题，可使用DNase 1和/或粘质沙雷氏菌（S. marcescens）来源的内切核酸酶，并延长孵育时间以充分降解DNA。

在进行大规模筛选之前，应使用阴性对照（空质粒载体）和阳性对照（已知靶蛋白）来优化全细胞裂解液制备及DRaCALA结合实验的条件。一旦确定了最佳条件，在后续每块板的实际筛选过程中便无需再加入对照。这是因为筛选流程非常短暂，且预计每块板中的大部分蛋白质不会与(p)ppGpp结合。因此，这些蛋白质在定量结合比例时可作为阴性对照（图3）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
32P-α-GTP	Perkinelmer	BLU006X250UC
96 孔针工具	V&P Scientific	VP 404	96 孔螺栓复制器，中心间距 9 mm，螺栓直径 4.2 mm，长度 24 mm
96 孔 V 型底微孔板	Sterilin	MIC9004	Sterilin 微孔板 V 型孔 611V96
琼脂	OXOID - 赛默飞世尔科技	LP0011	琼脂 No. 1
ASKA 文库菌株	NBRP, SHIGEN, 日本		参考文献：DNA Research，第 12 卷，第 5 期，2005 年，第 291–299 页。https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
苯并核酸酶（Benzonase）	SIGMA	E1014-25KU	来自粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的基因工程核酸内切酶
Bradford 蛋白检测试剂	伯乐（Bio-Rad）	5000006	试剂浓缩液
DMSO	SIGMA	D8418	≥99.9%
DNase 1	SIGMA	DN25-1G
凝胶过滤柱（10x300）	GE Healthcare	28990944	含 20% 乙醇作为防腐剂
甘油	PanReac AppliChem	122329.1214	分析纯 87% 甘油
HyperCassette	Amersham	RPN 11647	20 x 40 cm
咪唑	SIGMA	56750	特级纯，≥ 99.5%（GC）
IP 储存式磷屏	FUJIFILM	28956474	BAS-MS 2040 20 x 40 cm
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）	SIGMA	I6758	异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
溶菌肉汤（LB）	英韦特根 - 赛默飞世尔科技	12795027	Miller's LB 肉汤基础
溶菌酶	SIGMA	L4949	来源于鸡蛋清；BioUltra，冻干粉末，≥98%
MgCl2（氯化镁）	SIGMA	208337
MilliQ 水			超纯水
多通道移液器	赛默飞世尔科技	4661110	F1 - Clip Tip；1-10 µl，8 通道
NaCl	VWR Chemicals	27810	AnalaR NORMAPUR，ACS，Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA 琼脂糖	Qiagen	30230
硝酸纤维素印迹膜	Amersham Protran	10600003	优质 0.45 µm 300 mm x 4 m
PBS	OXOID - 赛默飞世尔科技	BR0014G	磷酸盐缓冲液（Dulbecco A），片剂
PEG3350（聚乙二醇 3350）	SIGMA	202444
苯甲基磺酰氟（PMSF）	SIGMA	93482	苯甲基磺酰氟溶液 - 0.1 M 乙醇溶液（T）
磷屏成像仪	GE Healthcare	28955809	Typhoon FLA-7000 磷屏成像仪
带滤芯移液器吸头	赛默飞世尔科技	94410040	ClipTip 12.5 μl 非无菌
Poly-Prep 层析柱	伯乐（Bio-Rad）	7311550	聚丙烯层析柱
蛋白酶抑制剂片（Mini）	Pierce	A32955	片剂，不含 EDTA
螺口离心管	赛默飞世尔科技	3488	微量离心管，2.0 ml 带螺口盖，非无菌
SLS 96 孔深孔板	Greiner	780285	MASTERBLOCK，2 ml，聚丙烯，V 型底，无色
离心柱	Millipore	UFC500396	Amicon Ultra -0.5 ml 离心过滤器
恒温混匀仪	Eppendorf	5382000015	Thermomixer C
TLC 板（PEI-纤维素 F TLC 板）	默克 Millipore	105579	DC PEI-纤维素 F（20 x 20 cm）
Tris	SIGMA	BP152	分子生物学级 Tris 碱
Tween 20	SIGMA	P1379	粘稠非离子型去污剂
β-巯基乙醇	SIGMA	M3148	99%（GC/滴定）