利用ORFeome文库，差异径向毛细管配体结合分析法（DRaCALA）可用于鉴定生物体中的小分子配体结合蛋白。
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摘要
摘要
过去十年中，人们对细菌生理学中小信号分子的理解取得了巨大进展。特别是，多种核苷酸衍生的第二信使（NSMs）的靶蛋白已在模式生物中被系统性地鉴定和研究。这些进展主要得益于若干新技术的发展，包括捕获化合物技术以及配体差异径向毛细管作用分析法（DRaCALA），这些技术被用于系统性鉴定这些小分子的靶蛋白。本文以核苷四磷酸和五磷酸鸟苷（(p)ppGpp）这类NSMs为例，介绍并视频演示DRaCALA技术的应用。通过DRaCALA技术，在模式生物大肠杆菌（Escherichia coli）K-12中成功鉴定了20个已知靶蛋白中的9个以及12个新靶蛋白，展示了该分析方法的强大能力。原则上，DRaCALA可用于研究能够被放射性同位素或荧光染料标记的小分子配体。本文还讨论了DRaCALA技术的关键步骤、优势与局限性，以促进该技术的进一步应用。
引言
细菌利用多种小分子信号物质来适应持续变化的环境1,2。例如，自诱导物N-酰基高丝氨酸内酯及其修饰的寡肽可在细菌之间介导细胞间通讯，协调群体行为，这一现象被称为群体感应2。另一类小分子信号物质是NSMs，包括被广泛研究的环腺苷酸（cAMP）、环二腺苷酸（cyclic di-AMP）、环二鸟苷酸（cyclic di-GMP）以及鸟苷五磷酸和四磷酸（p)ppGpp1。细菌在应对多种不同应激条件时会生成这些NSMs。一旦生成，这些分子便会结合其靶蛋白，调控多种不同的生理和代谢通路，以应对所遭遇的应激环境并增强细菌的存活能力。因此，鉴定这些小分子的靶蛋白是解析其分子功能不可或缺的前提条件。
过去十年间，人们对这些小信号分子的认识迅速增长，这主要得益于几项技术革新，这些技术揭示了这些小分子的作用靶蛋白。这些技术包括捕获化合物技术3,4,5，以及本文将要讨论的配体差异径向毛细管作用分析法（DRaCALA）6。
由 Vincent Lee 及其同事于 2011 年发明6，DRaCALA 利用硝酸纤维素膜对游离配体与蛋白结合配体的选择性截留能力。蛋白质等分子无法在硝酸纤维素膜上扩散，而小分子配体（如 NSM）则可以。通过将 NSM（例如，ppGpp）与待测蛋白质混合后点样于膜上，可预期出现两种情况（图1：如果(p)ppGpp与蛋白质结合，放射性标记的(p)ppGpp将被蛋白质保留在斑点中心，不会向外扩散，从而形成一个浓密的小点即然而，如果 (p)ppGpp 未与蛋白质结合，则会自由向外扩散，形成一个具有均匀背景放射性信号的大斑点，在磷屏成像仪下呈现强放射性信号。
此外，如果蛋白质在全细胞裂解液中含量足够，DRaCALA 可用于检测小分子与未纯化蛋白质之间的相互作用。这种简便性使得 DRaCALA 可结合 ORFeome 表达文库，快速鉴定蛋白质靶标。事实上，已通过 DRaCALA 系统性地鉴定了 cAMP7、环二-AMP8、环二-GMP9,10 以及 (p)ppGpp11,12,13 的靶蛋白。本视频文章以 (p)ppGpp 为例，演示并描述了成功实施 DRaCALA 筛选的关键步骤和注意事项。需要注意的是，在开展 DRaCALA 实验前，强烈建议结合阅读关于 DRaCALA14 的更详尽描述。
图 1：DRaCALA 的原理。（A）DRaCALA 实验的示意图。详见正文。（B）结合分数的定量与计算。详见正文。简而言之，通过绘制两个圆圈来分析 DRaCALA 斑点，其中一个圆圈包围整个斑点，另一个圆圈包围内部深色斑点（即，由于被测蛋白质结合而保留的 (p)ppGpp）。特异性结合信号为内圈的放射性信号（S1），减去非特异性背景信号（通过 A1 × ((S2-S1)/(A2-A1)) 计算得出）。结合分数为特异性结合信号除以总放射性信号（S2）。缩写：DRaCALA = 配体差异径向毛细管作用分析法；(p)ppGpp = 鸟苷五磷酸和四磷酸；RT = 室温。请点击此处查看该图的放大版本。
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方案
1. 全细胞裂解液的制备
- 接种 E. coli K-12 ASKA ORFeome文库菌株15 加入含有1.5 mL 赖氨酸肉汤（LB）的容器中 25 µg/mL 氯霉素置于96孔深孔板中。于37°C培养18小时过夜（O/N）。 30 °C 以160 rpm振荡培养。次日，向过夜培养物中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（终浓度0.5 mM），以诱导蛋白表达 30 °C 6 小时。
- 500 × 离心收集细胞 g 10分钟。将沉淀在-80 °C 直至使用。为裂解细胞，加入 150 µL 裂解缓冲液L1（40 mM Tris pH 7.5，100 mM NaCl，10 mM MgCl₂）2，加入2 mM苯基甲基磺酰氟（PMSF） 40 µg/mL DNase 1 和 0.5 mg/mL 溶菌酶）重悬沉淀。
- 将细胞在 -80 °C 30 分钟，然后在 37 °C 20分钟。重复此循环三次以裂解细胞。将裂解物储存在-80 °C 使用前
2. Relseq 和 GppA 的纯化
注意：使用来自马链球菌（Streptococcus equisimilis）的重组蛋白 Relseq 和来自大肠杆菌（E. coli）K-12 的 GppA 分别合成放射性标记的 pppGpp 和 ppGpp。
- 培养并收集过表达每种蛋白的细胞。
- 在LB肉汤中将E. coli BL21 DE3菌株培养至对数生长期（光密度（OD）约为0.3–0.4），取1 mL培养物在6000 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，用100 µL冰冻TSB肉汤（LB肉汤中添加0.1 g/mL PEG3350、0.05 mL/mL二甲基亚砜和20 mM MgCl2）重悬细胞。
- 将分别含有组氨酸标签的relseq和gppA质粒各100 ng加入上述TSB细胞悬液中，冰上孵育30分钟。42 °C热激40秒，再将混合物放回冰上2分钟，随后加入1 mL室温LB肉汤，在37 °C、160 rpm振荡条件下恢复培养1小时。
- 将恢复后的细胞涂布于添加相应抗生素的LB琼脂平板上（Relseq：100 µg/mL氨苄青霉素；GppA：30 µg/mL卡那霉素）。次日，挑取单菌落接种至LB肉汤中，于37 °C开始过夜预培养两种菌株。
- 18小时后，取10 mL过夜培养物接种至500 mL LB培养基中，并加入相应的抗生素。在37 °C、160 rpm振荡条件下培养，当OD600nm达到0.5–0.7时，加入0.5 mM IPTG诱导蛋白表达，继续在30 °C、160 rpm振荡条件下培养3小时。
- 在4 °C条件下以6084 × g离心10分钟收集细胞。用20 mL冰冻的1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬沉淀，在4 °C条件下以1912 × g再次离心20分钟。弃去上清液，将沉淀于-20 °C冷冻保存，待用。
- 镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）亲和纯化
注意：从本步骤开始，确保所有样品保持低温。- 加入40 mL冰冻的裂解缓冲液L2（50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，5%甘油，10 mM咪唑，10 mM β-巯基乙醇，并加入蛋白酶抑制剂（无EDTA片剂；见材料表）以重悬沉淀。通过超声处理裂解细胞（60%振幅，开2秒/关4秒，累计开启8分钟）。在4 °C条件下以23,426 × g离心40分钟澄清裂解液，取上清液进行后续纯化。
- 在上述离心过程中，准备Ni-NTA树脂。
- 将500 µL均质化的Ni-NTA树脂转移至直立的聚丙烯层析柱中，静置15分钟，使保存液自然流出。用超纯水洗涤树脂两次，每次15 mL，然后用15 mL裂解缓冲液L2洗涤层析柱。
- 将第1步获得的澄清裂解上清液上样至层析柱，使其自然流过。用30 mL洗涤缓冲液（50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，5%甘油，20 mM咪唑）洗涤层析柱。
- 用400 µL洗脱缓冲液（50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，5%甘油，500 mM咪唑）洗脱蛋白三次，随后再用300 µL洗脱缓冲液重复洗脱一次。合并所有洗脱组分，最终体积为700 µL。
- 凝胶过滤
- 配制凝胶过滤缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5；200 mM NaCl；5%甘油）。用一个柱体积（25 mL）的凝胶过滤缓冲液洗涤尺寸排阻层析柱。
- 使用500 µL进样环加载上述700 µL样品，流速设为0.5 mL/min，收集2–3个含有目标蛋白的组分，每管0.5 mL。
- 合并含有各目标蛋白的组分，使用离心浓缩柱进行浓缩，并通过Bradford法测定蛋白浓度。
3. 32P标记的pppGpp和ppGpp的合成
- 在螺口管中配制小规模的 Relseq 反应体系（见表 1）。
注意：放射性试剂操作仅可在取得许可的场所进行，并须佩戴个人防护装备。
| 体积 (μL) | ||
| 小规模 | 大规模 | |
| 超纯水 | ||
| 10x Relseq 缓冲液* | 2 | 50 |
| ATP（终浓度 8 mM） | ||
| Relseq （终浓度 4 μM） | ||
| 32P-α-鸟苷三磷酸（GTP）（终浓度 120 nM）（注意） | 0.2 | 5 |
| 总体积 | 20 | 500 |
表1：小规模与大规模合成32P标记pppGpp的反应组装信息。 *10x Relseq缓冲液含有250 mM Tris-HCl，pH 8.6；1 M NaCl；80 mM MgCl2。缩写：pppGpp = 鸟苷五磷酸。
- 将离心管置于37 °C的恒温混匀仪中孵育1小时，随后在95 °C孵育5分钟，再置于冰上5分钟。在15,700 x g 条件下离心5分钟，沉淀蛋白质，将上清液（合成的32P-pppGpp）转移至新的螺旋盖离心管中。
- 为从32P-pppGpp合成32P-ppGpp，取一半的32P-pppGpp产物转移至新的螺旋盖离心管中，加入1 µM GppA。在37 °C孵育10分钟，95 °C孵育5分钟，然后置于冰上5分钟。
- 在15,700 x g 条件下离心5分钟，沉淀蛋白质，将上清液（合成的32P-ppGpp）转移至新的螺旋盖离心管中。
- 取1 µL样品，在薄层色谱（TLC）板（聚乙烯亚胺修饰的纤维素TLC板）上进行电泳分析32P-pppGpp和32P-ppGpp，以1.5 M KH2PO4（pH 3.4）作为流动相。
注意：使用α-32P标记的鸟苷-5'-三磷酸（32P-α-GTP）作为对照。 - 将TLC板完全干燥，夹在透明塑料文件夹中，暴露于存储磷屏5分钟。使用磷屏成像仪对信号进行成像和定量。
注意：当32P-pppGpp与32P-ppGpp的比率高于85%时，可参照表1配制并合成大规模反应体系（500 µL，足以用于20块96孔板的筛选）。
4. (p)ppGpp 靶蛋白的 DRaCALA 筛选
- 将20 µL全细胞裂解液解冻并转移至96孔V型底微孔板中。每孔加入2.5 U来自Serratia marcescens的内切核酸酶，在37 °C孵育15分钟以降低裂解液黏度。将裂解液置于冰上20分钟。
- 将32P-pppGpp与32P-ppGpp按1:1比例混合，加入1倍体积的L1裂解缓冲液，使(p)ppGpp的终浓度为4 nM。
注意：由于pppGpp与ppGpp在化学结构上相似，使用两者的混合物可简化筛选过程。 - 使用多通道移液器和带滤芯的吸头，将10 µL (p)ppGpp混合物加入细胞裂解液中并混匀。室温（RT）孵育5分钟。
- 将96针工具浸入0.01%非离子型去污剂溶液中清洗30秒，然后在纸巾上干燥30秒。重复清洗该针工具3次。
- 将针工具插入上述96孔样品板中，静置30秒。垂直提起针工具，并垂直下压至硝酸纤维素膜上，保持30秒。
注意：若某点样缺失，可用移液器和带滤芯吸头点加2 µL相应样品。建议如下方所示对同一样品进行重复点样。 - 室温干燥膜5分钟。将膜夹在透明塑料文件夹之间，暴露于存储磷屏5分钟，使用磷光成像仪进行检测。
5. 潜在靶蛋白的定量与鉴定
- 使用与磷屏成像仪配套的分析软件打开已显影平板的 .gel 文件。利用阵列分析功能，通过设置 12 列 × 8 行的网格来定义 96 个斑点。
- 定义大圆以包围整个斑点的外缘（见图 1B）。导出所定义大圆的体积+背景和面积，并保存至电子表格中。
注意：如有需要，可重新调整每个单独圆圈的位置，使其与斑点完全重叠，并调整每个圆圈的大小，使其略大于实际斑点。 - 将已定义的圆缩小，以包围内部的小点。导出所定义小圆的体积+背景和面积，并保存至电子表格中。
- 在电子表格中使用图 1B中的公式计算结合分数，并绘制数据图。通过比较其他大多数孔的结合分数，识别出显示高结合分数孔中潜在的结合蛋白。
图 2：DRaCALA 筛选流程的整体工作路线图。 从 Escherichia coli ASKA 文库中诱导表达蛋白质，并裂解细胞。同时，纯化重组蛋白 Relseq-His 和 GppA-His，并利用 32P-α-GTP 合成 32P 标记的 pppGpp 和 ppGpp。将放射性标记的 (p)ppGpp 分子与裂解液混合后，使用 96 孔点样工具将混合物点样至硝酸纤维素膜上，随后进行磷屏曝光、成像及放射性信号的定量分析。缩写：DRaCALA = 配体差异径向毛细管作用分析法；(p)ppGpp = 鸟苷五磷酸和四磷酸；RT = 室温；IPTG = 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；GTP = 鸟苷-5'-三磷酸；SDS-PAGE = 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；TLC = 薄层层析。 请点击此处查看该图的放大版本。
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结果
按照上述方案操作通常会产生两种类型的结果（图3）。
图3A 显示了一个背景结合信号相对较低的孔板（大多数孔的结合分数 < 0.025）。其中H3孔的阳性结合信号结合分数约为0.35，远高于其他孔的信号值。即使未经定量分析，H3孔的信号也十分显著，提示在H3孔中表达的靶蛋白可能与pppGpp、ppGpp或两者均发生结合。事实上，在H3孔中过表达的蛋白为次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶Hpt，已知其能够结合(p)ppGpp12,16。
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讨论
进行DRaCALA筛选的关键步骤之一是获得高质量的全细胞裂解液。首先，目标蛋白应大量表达并以可溶形式存在。其次，细胞裂解必须彻底，且裂解液的黏度必须尽可能低。加入溶菌酶并进行三次冻融循环通常足以实现完全的细胞裂解。然而，染色体DNA的释放会使裂解液变得黏稠，并导致非特异性结合信号升高，从而产生假阳性结果，如图3B、C所示。为减轻这一问题，可使用DNase 1和/或粘质沙雷氏菌（S. marcescens）来源的内切核酸酶，并延长孵育时间以充分降解DNA。
在进行大规模筛选之前，应使用阴性对照（空质粒载体）和阳性对照（已知靶蛋白）来优化全细胞裂解液制备及DRaCALA结合实验的条件。一旦确定了最佳条件，在后续每块板的实际筛选过程中便无需再加入对照。这是因为筛选流程非常短暂，且预计每块板中的大部分蛋白质不会与(p)ppGpp结合。因此，这些蛋白质在定量结合比例时可作为阴性对照（图3）。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由丹麦诺和诺德基金会项目资助（NNF19OC0058331）资助YEZ，以及欧盟“地平线2020”研究与创新计划下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议（Nº 801199）资助MLS。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 32P-α-GTP | Perkinelmer | BLU006X250UC | |
| 96 孔针工具 | V&P Scientific | VP 404 | 96 孔螺栓复制器，中心间距 9 mm，螺栓直径 4.2 mm，长度 24 mm |
| 96 孔 V 型底微孔板 | Sterilin | MIC9004 | Sterilin 微孔板 V 型孔 611V96 |
| 琼脂 | OXOID - 赛默飞世尔科技 | LP0011 | 琼脂 No. 1 |
| ASKA 文库菌株 | NBRP, SHIGEN, 日本 | 参考文献：DNA Research，第 12 卷，第 5 期，2005 年，第 291–299 页。https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012 | |
| 苯并核酸酶（Benzonase） | SIGMA | E1014-25KU | 来自粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的基因工程核酸内切酶 |
| Bradford 蛋白检测试剂 | 伯乐（Bio-Rad） | 5000006 | 试剂浓缩液 |
| DMSO | SIGMA | D8418 | ≥99.9% |
| DNase 1 | SIGMA | DN25-1G | |
| 凝胶过滤柱（10x300） | GE Healthcare | 28990944 | 含 20% 乙醇作为防腐剂 |
| 甘油 | PanReac AppliChem | 122329.1214 | 分析纯 87% 甘油 |
| HyperCassette | Amersham | RPN 11647 | 20 x 40 cm |
| 咪唑 | SIGMA | 56750 | 特级纯，≥ 99.5%（GC） |
| IP 储存式磷屏 | FUJIFILM | 28956474 | BAS-MS 2040 20 x 40 cm |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG） | SIGMA | I6758 | 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 |
| 溶菌肉汤（LB） | 英韦特根 - 赛默飞世尔科技 | 12795027 | Miller's LB 肉汤基础 |
| 溶菌酶 | SIGMA | L4949 | 来源于鸡蛋清；BioUltra，冻干粉末，≥98% |
| MgCl2（氯化镁） | SIGMA | 208337 | |
| MilliQ 水 | 超纯水 | ||
| 多通道移液器 | 赛默飞世尔科技 | 4661110 | F1 - Clip Tip；1-10 µl，8 通道 |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810 | AnalaR NORMAPUR，ACS，Reag. Ph. Eur. |
| Ni-NTA 琼脂糖 | Qiagen | 30230 | |
| 硝酸纤维素印迹膜 | Amersham Protran | 10600003 | 优质 0.45 µm 300 mm x 4 m |
| PBS | OXOID - 赛默飞世尔科技 | BR0014G | 磷酸盐缓冲液（Dulbecco A），片剂 |
| PEG3350（聚乙二醇 3350） | SIGMA | 202444 | |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | SIGMA | 93482 | 苯甲基磺酰氟溶液 - 0.1 M 乙醇溶液（T） |
| 磷屏成像仪 | GE Healthcare | 28955809 | Typhoon FLA-7000 磷屏成像仪 |
| 带滤芯移液器吸头 | 赛默飞世尔科技 | 94410040 | ClipTip 12.5 μl 非无菌 |
| Poly-Prep 层析柱 | 伯乐（Bio-Rad） | 7311550 | 聚丙烯层析柱 |
| 蛋白酶抑制剂片（Mini） | Pierce | A32955 | 片剂，不含 EDTA |
| 螺口离心管 | 赛默飞世尔科技 | 3488 | 微量离心管，2.0 ml 带螺口盖，非无菌 |
| SLS 96 孔深孔板 | Greiner | 780285 | MASTERBLOCK，2 ml，聚丙烯，V 型底，无色 |
| 离心柱 | Millipore | UFC500396 | Amicon Ultra -0.5 ml 离心过滤器 |
| 恒温混匀仪 | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer C |
| TLC 板（PEI-纤维素 F TLC 板） | 默克 Millipore | 105579 | DC PEI-纤维素 F（20 x 20 cm） |
| Tris | SIGMA | BP152 | 分子生物学级 Tris 碱 |
| Tween 20 | SIGMA | P1379 | 粘稠非离子型去污剂 |
| β-巯基乙醇 | SIGMA | M3148 | 99%（GC/滴定） |
参考文献
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