利用配体差异径向毛细管作用分析法（DRaCALA）鉴定小分子配体的结合蛋白

摘要

利用ORFeome文库，差异径向毛细管配体结合分析法（DRaCALA）可用于鉴定生物体中的小分子配体结合蛋白。

摘要

过去十年中，人们对细菌生理学中小信号分子的理解取得了巨大进展。特别是，多种核苷酸衍生的第二信使（NSMs）的靶蛋白已在模式生物中被系统性地鉴定和研究。这些进展主要得益于若干新技术的发展，包括捕获化合物技术以及配体差异径向毛细管作用分析法（DRaCALA），这些技术被用于系统性鉴定这些小分子的靶蛋白。本文以核苷四磷酸和五磷酸鸟苷（(p)ppGpp）这类NSMs为例，介绍并视频演示DRaCALA技术的应用。通过DRaCALA技术，在模式生物大肠杆菌（Escherichia coli）K-12中成功鉴定了20个已知靶蛋白中的9个以及12个新靶蛋白，展示了该分析方法的强大能力。原则上，DRaCALA可用于研究能够被放射性同位素或荧光染料标记的小分子配体。本文还讨论了DRaCALA技术的关键步骤、优势与局限性，以促进该技术的进一步应用。

引言

细菌利用多种小分子信号物质来适应持续变化的环境^1,2。例如，自诱导物N-酰基高丝氨酸内酯及其修饰的寡肽可在细菌之间介导细胞间通讯，协调群体行为，这一现象被称为群体感应²。另一类小分子信号物质是NSMs，包括被广泛研究的环腺苷酸（cAMP）、环二-AMP、环二-鸟苷酸单磷酸（cyclic di-GMP）以及鸟苷五磷酸和四磷酸（p)ppGpp¹。细菌在应对多种不同应激条件时会产生这些NSMs。一旦生成，这些分子会结合其靶蛋白，调控多种不同的生理和代谢通路，以应对所遭遇的应激环境并增强细菌的存活能力。因此，鉴定这些小分子的靶蛋白是解析其分子功能不可或缺的前提条件。

过去十年见证了人们对这些小信号分子的认识迅速增长，这主要得益于几项技术创新，这些技术揭示了这些小分子的作用靶标蛋白。这些技术包括捕获化合物技术^3,4,5，以及本文将要讨论的配体差异径向毛细管作用分析法（DRaCALA）⁶。

由 Vincent Lee 及其同事于 2011 年发明⁶，DRaCALA 利用硝酸纤维素膜对游离配体与蛋白结合配体的选择性截留能力。蛋白质等分子无法在硝酸纤维素膜上扩散，而小分子配体（如 NSM）则可以。通过将 NSM（例如，ppGpp）与待测蛋白质混合后点样于膜上，可预期出现两种情况（图1：如果(p)ppGpp与蛋白质结合，放射性标记的(p)ppGpp将被蛋白质保留在斑点中心，不会向外扩散，从而形成一个浓密的小点即然而，如果 (p)ppGpp 不与蛋白质结合，则会自由向外扩散，形成一个放射性信号均匀的大斑点。

此外，如果蛋白质在全细胞裂解液中存在足够的量，DRaCALA 可以检测小分子与未纯化蛋白质之间的相互作用。这种简便性使得 DRaCALA 可用于利用 ORFeome 表达文库快速鉴定蛋白质靶标。事实上，已通过 DRaCALA 系统性地鉴定了 cAMP⁷、环二-AMP⁸、环二-GMP^9,10 以及 (p)ppGpp^11,12,13 的靶蛋白。本视频文章以 (p)ppGpp 为例，演示并描述了成功进行 DRaCALA 筛选的关键步骤和注意事项。需要注意的是，在开展 DRaCALA 实验前，强烈建议结合阅读关于 DRaCALA¹⁴ 的更详尽描述。

图1：DRaCALA 的原理。（A）DRaCALA 测定的示意图。详见正文。（B）结合分数的定量与计算。详见正文。简言之，通过绘制两个圆圈来分析 DRaCALA 斑点，其中一个圆圈包围整个斑点，另一个圆圈包围内部深色小点（即，由于被测蛋白质结合而保留的 (p)ppGpp）。特异性结合信号为内圈的放射性信号（S1），减去非特异性背景信号（通过 A₁ × ((S₂-S₁)/(A₂-A₁)) 计算得出）。结合分数为特异性结合信号除以总放射性信号（S2）。缩写：DRaCALA = 配体差异径向毛细管作用测定法；(p)ppGpp = 鸟苷五磷酸和四磷酸；RT = 室温。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 全细胞裂解液的制备

1. 接种 E. coli K-12 ASKA ORFeome文库菌株¹⁵ 转入含有25 µg/mL氯霉素的1.5 mL LB培养基中，置于96孔深孔板内，于30 °C、160 rpm振荡培养过夜（O/N）18 h。次日，向过夜培养物中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（终浓度0.5 mM），在30 °C诱导蛋白表达6 h。
2. 500 × 离心收集细胞 g 10分钟。将沉淀在-80 °C冷冻保存备用。裂解细胞时，加入150 µL裂解缓冲液L1（40 mM Tris pH 7.5，100 mM NaCl，10 mM MgCl₂）₂，加入2 mM苯基甲基磺酰氟（PMSF）、40 µg/mL DNase 1和0.5 mg/mL溶菌酶）重悬沉淀。
3. 在 -80 °C 下冷冻细胞 30 分钟，然后在 37 °C 下解冻 20 分钟。重复此冻融循环三次以裂解细胞。裂解液在使用前于 -80 °C 保存。

2. Rel_seq 和 GppA 的纯化

注意：使用来自马氏链球菌（Streptococcus equisimilis）的重组蛋白 Rel_seq 和来自大肠杆菌（E. coli）K-12 的 GppA 分别合成放射性标记的 pppGpp 和 ppGpp。

1. 培养并收集过表达每种蛋白的细胞。
   1. 在LB肉汤中将E. coli BL21 DE3菌株培养至对数生长期（光密度（OD）约为0.3–0.4），取1 mL培养物在6000 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，用100 µL冰冻TSB肉汤（LB肉汤中添加0.1 g/mL PEG3350、0.05 mL/mL二甲基亚砜和20 mM MgCl₂）重悬细胞。
   2. 将分别含有组氨酸标签的rel_seq和gppA质粒各100 ng加入上述TSB细胞悬液中，冰上孵育30分钟。42 °C热激40秒，再将混合物放回冰上2分钟，随后加入1 mL室温LB肉汤，在37 °C、160 rpm振荡条件下恢复培养1小时。
   3. 将恢复后的细胞涂布于添加相应抗生素的LB琼脂平板上（Rel_seq：100 µg/mL氨苄青霉素；GppA：30 µg/mL卡那霉素）。次日，挑取单菌落接种至LB肉汤中，于37 °C开始过夜预培养两种菌株。
   4. 18小时后，取10 mL过夜培养物接种至500 mL LB培养基中，并加入相应的抗生素。在37 °C、160 rpm振荡条件下培养，当OD_600nm达到0.5–0.7时，加入0.5 mM IPTG诱导蛋白表达，继续在30 °C、160 rpm振荡条件下培养3小时。
   5. 在4 °C条件下以6084 × g离心10分钟收集细胞。用20 mL冰冻的1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬沉淀，在4 °C条件下以1912 × g再次离心20分钟。弃去上清液，将沉淀于-20 °C冷冻保存，待用。
2. 镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）亲和纯化
   ​注意：从本步骤开始，确保所有样品保持低温。
   1. 加入40 mL冰冻的裂解缓冲液L2（50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，5%甘油，10 mM咪唑，10 mM β-巯基乙醇，并加入蛋白酶抑制剂（无EDTA片剂；见材料表）重悬沉淀。通过超声处理裂解细胞（60%振幅，开2秒/关4秒，累计开启8分钟）。在4 °C条件下以23,426 × g离心40分钟澄清裂解液，取上清液进行后续纯化。
   2. 在上述离心过程中，准备Ni-NTA树脂。
      1. 将500 µL均质化的Ni-NTA树脂转移至直立的聚丙烯层析柱中，静置15分钟使储存液自然流出。用超纯水洗涤树脂两次，每次15 mL，然后用15 mL裂解缓冲液L2洗涤层析柱。
   3. 将第1步获得的澄清裂解液上清液加载至层析柱，使其自然流过。用30 mL洗涤缓冲液（50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，5%甘油，20 mM咪唑）洗涤层析柱。
   4. 用400 µL洗脱缓冲液（50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，5%甘油，500 mM咪唑）洗脱蛋白三次，随后再用300 µL洗脱缓冲液重复洗脱一次。合并所有洗脱组分，最终体积为700 µL。
3. 凝胶过滤
   1. 配制凝胶过滤缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5；200 mM NaCl；5%甘油）。用一个柱体积（25 mL）的凝胶过滤缓冲液洗涤尺寸排阻层析柱。
   2. 使用500 µL进样环加载上述700 µL样品，流速设为0.5 mL/min，收集2–3个含有目标蛋白的组分，每管0.5 mL。
   3. 合并含有各目标蛋白的组分，使用离心浓缩柱进行浓缩，并通过Bradford法测定蛋白浓度。

3. ³²P标记的pppGpp和ppGpp的合成

1. 在螺口管中组装小规模的 Rel_seq 反应（见表1）。
   注意：仅可在取得许可的场所并佩戴个人防护装备的情况下操作放射性试剂。

	体积 (μL)
	小规模	大规模
超纯水
10x Relseq 缓冲液*	2	50
ATP（终浓度 8 mM）
Relseq （终浓度 4 μM）
32P-α-鸟苷三磷酸（GTP）（终浓度 120 nM）（注意）	0.2	5
总量	20	500

表1：小规模和大规模合成³²P标记pppGpp的反应组装信息。 *10× Relseq缓冲液包含250 mM Tris-HCl，pH 8.6；1 M NaCl；80 mM MgCl₂。缩写：pppGpp = 鸟苷五磷酸。

2. 将离心管置于37 °C恒温混匀仪中孵育1 h，随后在95 °C孵育5 min，再置于冰上5 min。在15,700 x g条件下离心沉淀蛋白 g 5 分钟后，转移上清液（合成的） ³²将P-pppGpp转移至新的螺口管中。
3. 合成 ³²P-ppGpp 来自 ³²P-pppGpp，转移一半的 ³²将p-pppGpp产物转移至新的螺旋盖管中，加入1 µM GppA。在37 °C孵育10分钟，95 °C孵育5分钟，然后置于冰上5分钟。
4. 15,700 x g 离心沉淀蛋白质 g 5 分钟后，转移上清液（合成的 ³²将 P-ppGpp 转移至新的螺旋盖管中。
5. 分析 ³²P-pppGpp 和 ³²使用1.5 M KH，通过在薄层色谱（TLC）板（聚乙烯亚胺修饰的纤维素TLC板）上点样1 µL样品来检测P-ppGpp₂PO₄，pH 3.4，作为流动相。
   注意：使用 α-³²P标记的鸟苷5'-三磷酸（³²P-α-GTP 作为对照。
6. 将薄层色谱板完全干燥后，置于透明塑料文件夹之间，再与存储磷屏接触曝光5分钟。使用磷屏成像仪对信号进行成像和定量分析。
   注意：当比例为 ³²P-pppGpp 和 ³²P-ppGpp 纯度高于 85% 时，可组装并合成大规模反应体系（500 µL，足以用于 20 块 96 孔板的筛选） 表1.

4. (p)ppGpp 靶蛋白的 DRaCALA 筛选

1. 将20 µL全细胞裂解液解冻并转移至96孔V型底微孔板中。每孔加入2.5 U来自Serratia marcescens的内切核酸酶，在37 °C孵育15分钟以降低裂解液黏度。将裂解液置于冰上20分钟。
2. 将³²P-pppGpp与³²P-ppGpp按1:1比例混合，加入1倍体积的L1裂解缓冲液，使(p)ppGpp的终浓度为4 nM。
   注意：由于pppGpp与ppGpp在化学结构上相似，使用两者的混合物可简化筛选过程。
3. 使用多通道移液器和带滤芯的移液吸头，将10 µL (p)ppGpp混合物加入细胞裂解液中并混匀。室温（RT）孵育5分钟。
4. 将96针点样工具浸入0.01%非离子型去污剂溶液中清洗30秒，然后在纸巾上干燥30秒。重复清洗该点样工具3次。
5. 将点样工具插入上述96孔样品板中，静置30秒。垂直提起点样工具，再垂直将其压入硝酸纤维素膜上，保持30秒。
   ​注意：若出现斑点缺失，可用移液器和带滤芯吸头点加2 µL相应样品。建议如下方所示对同一样品制作重复斑点。
6. 室温干燥膜5分钟。将膜夹在透明塑料文件夹之间，暴露于存储磷屏5分钟，使用磷光成像仪进行检测。

5. 潜在靶蛋白的定量与鉴定

1. 使用与磷屏成像仪配套的分析软件打开可视化平板的.gel文件。利用阵列分析功能，通过设置12列×8行的网格来定义96个斑点。
2. 定义大圆以包围整个斑点的外缘（见图1B）。导出所定义大圆的体积+背景和面积，并保存至电子表格中。
   注意：如有需要，可重新调整每个单独圆圈的位置，使其与斑点完全重合，并调整每个圆圈大小，使其略大于实际斑点。
3. 将已定义的圆缩小，以包围内部的小点。导出所定义小圆的体积+背景和面积，并保存至电子表格中。
4. 在电子表格中使用图1B中的公式计算结合分数，并绘制数据图。通过比较多数其他孔的结合分数，识别出结合分数较高的孔中潜在的结合蛋白。

图 2：DRaCALA 筛选流程的整体工作流程图。 诱导来自 Escherichia coli ASKA 文库的蛋白质表达，并裂解细胞。同时，纯化重组蛋白 Rel_seq-His 和 GppA-His，并用于以 ³²P-α-GTP 为原料合成 ³²P 标记的 pppGpp 和 ppGpp。将放射性标记的 (p)ppGpp 分子与裂解液混合后，使用 96 孔点样工具将混合物点样至硝酸纤维素膜上，随后进行磷屏曝光、成像及放射性信号的定量分析。缩略语：DRaCALA = 配体差异径向毛细作用分析法；(p)ppGpp = 鸟苷五磷酸和四磷酸；RT = 室温；IPTG = 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；GTP = 鸟苷 5'-三磷酸；SDS-PAGE = 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；TLC = 薄层色谱法。 请点击此处查看此图的放大版本。

结果

按照上述方案操作通常会产生两种类型的结果（图3）。

图3A 显示一个多数孔的背景结合信号较低（结合分数 < 0.025）的平板。H3孔的阳性结合信号结合分数约为0.35，远高于其他孔的信号。即使未经定量分析，H3孔的信号也十分显著，提示在H3孔中表达的靶蛋白能够结合pppGpp、ppGpp或两者。事实上，在H3孔中过表达的蛋白是次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶Hpt，已知其可结合(p)ppGpp^12,16。

讨论

进行DRaCALA筛选的关键步骤之一是获得高质量的全细胞裂解液。首先，目标蛋白应大量表达并以可溶形式存在。其次，细胞裂解必须彻底，且裂解液的黏度必须尽可能低。加入溶菌酶并进行三次冻融循环通常足以实现完全的细胞裂解。然而，染色体DNA的释放会使裂解液变得黏稠，并导致非特异性结合信号升高，从而产生假阳性结果，如图3B、C所示。为减轻这一问题，可使用DNase 1和/或粘质沙雷氏菌（S. marcescens）来源的内切核酸酶，并延长孵育时间以充分降解DNA。

在进行大规模筛选之前，应使用阴性对照（空质粒载体）和阳性对照（已知靶蛋白）来优化全细胞裂解液制备及DRaCALA结合实验的条件。一旦确定了最佳条件，在后续每块板的实际筛选过程中便无需再加入对照。这是因为筛选流程非常短暂，且预计每块板中的大部分蛋白质不会与(p)ppGpp结合。因此，这些蛋白质在定量结合比例时可作为阴性对照（图3）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
32P-α-GTP	Perkinelmer	BLU006X250UC
96 孔针工具	V&P Scientific	VP 404	96 孔螺栓复制器，中心间距 9 mm，螺栓直径 4.2 mm，长度 24 mm
96 孔 V 型底微孔板	Sterilin	MIC9004	Sterilin 微孔板 V 型孔 611V96
琼脂	OXOID - 赛默飞世尔科技	LP0011	琼脂 No. 1
ASKA 文库菌株	NBRP, SHIGEN, 日本		参考文献：DNA Research，第 12 卷，第 5 期，2005 年，第 291–299 页。https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
苯并核酸酶（Benzonase）	SIGMA	E1014-25KU	来自粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的基因工程核酸内切酶
Bradford 蛋白检测试剂	伯乐（Bio-Rad）	5000006	试剂浓缩液
DMSO	SIGMA	D8418	≥99.9%
DNase 1	SIGMA	DN25-1G
凝胶过滤柱（10x300）	GE Healthcare	28990944	含 20% 乙醇作为防腐剂
甘油	PanReac AppliChem	122329.1214	分析纯 87% 甘油
HyperCassette	Amersham	RPN 11647	20 x 40 cm
咪唑	SIGMA	56750	特级纯，≥ 99.5%（GC）
IP 储存式磷屏	FUJIFILM	28956474	BAS-MS 2040 20 x 40 cm
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）	SIGMA	I6758	异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
溶菌肉汤（LB）	英韦特根 - 赛默飞世尔科技	12795027	Miller's LB 肉汤基础
溶菌酶	SIGMA	L4949	来源于鸡蛋清；BioUltra，冻干粉末，≥98%
MgCl2（氯化镁）	SIGMA	208337
MilliQ 水			超纯水
多通道移液器	赛默飞世尔科技	4661110	F1 - Clip Tip；1-10 µl，8 通道
NaCl	VWR Chemicals	27810	AnalaR NORMAPUR，ACS，Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA 琼脂糖	Qiagen	30230
硝酸纤维素印迹膜	Amersham Protran	10600003	优质 0.45 µm 300 mm x 4 m
PBS	OXOID - 赛默飞世尔科技	BR0014G	磷酸盐缓冲液（Dulbecco A），片剂
PEG3350（聚乙二醇 3350）	SIGMA	202444
苯甲基磺酰氟（PMSF）	SIGMA	93482	苯甲基磺酰氟溶液 - 0.1 M 乙醇溶液（T）
磷屏成像仪	GE Healthcare	28955809	Typhoon FLA-7000 磷屏成像仪
带滤芯移液器吸头	赛默飞世尔科技	94410040	ClipTip 12.5 μl 非无菌
Poly-Prep 层析柱	伯乐（Bio-Rad）	7311550	聚丙烯层析柱
蛋白酶抑制剂片（Mini）	Pierce	A32955	片剂，不含 EDTA
螺口离心管	赛默飞世尔科技	3488	微量离心管，2.0 ml 带螺口盖，非无菌
SLS 96 孔深孔板	Greiner	780285	MASTERBLOCK，2 ml，聚丙烯，V 型底，无色
离心柱	Millipore	UFC500396	Amicon Ultra -0.5 ml 离心过滤器
恒温混匀仪	Eppendorf	5382000015	Thermomixer C
TLC 板（PEI-纤维素 F TLC 板）	默克 Millipore	105579	DC PEI-纤维素 F（20 x 20 cm）
Tris	SIGMA	BP152	分子生物学级 Tris 碱
Tween 20	SIGMA	P1379	粘稠非离子型去污剂
β-巯基乙醇	SIGMA	M3148	99%（GC/滴定）