从小鼠肩胛间棕色脂肪组织中分离棕色脂肪细胞用于基因和蛋白质表达分析

摘要

本研究介绍了一种分离小鼠棕色脂肪细胞以进行基因和蛋白质表达分析的新方法。

摘要

棕色脂肪组织（BAT）负责哺乳动物的非颤抖性产热，而棕色脂肪细胞（BAs）是BAT的功能单位。BAs含有多个小脂滴和丰富的线粒体，并表达解偶联蛋白1（UCP1）。根据其来源，BAs可分为两种亚型：胚胎来源的经典棕色脂肪细胞（cBAs）和由白色脂肪细胞转化而来的棕色脂肪细胞。由于密度较低，传统离心法难以从BAT中分离出BAs。本研究建立了一种新的方法，用于从小鼠中分离BAs，以进行基因和蛋白质表达分析。在该方案中，成年小鼠肩胛间BAT经胶原酶和分散酶溶液消化后，使用6%碘克沙醇溶液富集解离的BAs，随后用Trizol裂解分离得到的BAs。 用于同时分离 RNA、DNA 和蛋白质的试剂。在 RNA 分离后，裂解液的有机相用于蛋白质提取。我们的数据显示，6% 碘克沙醇溶液能有效富集胆汁酸（BAs），且不影响后续的基因和蛋白质表达研究。血小板源性生长因子（PDGF）是一种调控间充质细胞生长与增殖的生长因子。与棕色脂肪组织相比，分离得到的胆汁酸（BAs）中相关基因的表达水平显著升高 Pdgfa总之，这种新方法为在单细胞类型水平上研究棕色脂肪细胞的生物学特性提供了一个平台。

引言

小鼠和人类都具有两种类型的脂肪组织：白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）¹。WAT 以甘油三酯的形式将能量储存在白色脂肪细胞中，而 BAT 中的棕色脂肪细胞（BAs）则将化学能以热能形式耗散²。根据其发育来源，BAs 可进一步分为在胚胎发育过程中形成的经典棕色脂肪细胞（cBAs）以及由白色脂肪细胞转化而来的棕色样脂肪细胞（米色/褐脂细胞，可在应激条件下由白色脂肪细胞转化而来）³。BAs 呈多房室结构，并表达产热蛋白解偶联蛋白1（UCP1）⁴。肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）库是小型哺乳动物中主要的 cBAs 储存部位之一⁵，而米色细胞则分散存在于白色脂肪组织中⁶。

由于具有耗散能量的特性，棕色脂肪细胞（BAs）作为减轻肥胖的治疗靶点已受到广泛关注⁷。为了利用BAs治疗肥胖，必须深入了解调控BAs功能、存活及募集的分子机制。包括棕色脂肪组织（BAT）和白色脂肪组织（WAT）在内的脂肪组织具有异质性。除脂肪细胞外，脂肪组织还包含多种其他细胞类型，例如内皮细胞、间充质干细胞和巨噬细胞⁸。尽管已有可....

方案

所有小鼠均饲养于无病原体环境中，所有实验程序均经马森医学研究机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。UCP1::Cre⁹ 和 Rosa 26^tdTomato 小鼠品系¹³ 此前已有报道。所有小鼠均置于室温条件下，维持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。

1. 溶液与棕色脂肪组织（BAT）的制备

1. 在15 mL离心管中配制消化液和分离液。
2. 10 mL BAT消化液：在10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中加入3.5 mg/mL Dispase II、1 mg/mL Collagenase II和10 mM CaCl₂，配制成BAT消化液。
3. 10 mL 12%碘克沙醇溶液（分离液）：将1 mL 10× PBS、2 mL 60%碘克沙醇、0.01 mL 1 M MgCl₂、0.025 mL 1 M KCl、0.1 mL 0.2 M乙二胺四乙酸（EDTA）和6.865 mL ddH₂O混合，得到12%碘克沙醇溶液。
4. 使用过量CO₂处死一只成年小鼠。具体操作：以每分钟10–30%笼体积的置换速率向小鼠笼内通入100% CO₂，5分钟后通过观察是否无呼吸迹象来确认死亡。

结果

肩胛间棕色脂肪组织（BAT）的制备以分离棕色脂肪细胞
棕色脂肪细胞（BAs）的分离过程如图1A所示。整个流程，从棕色脂肪组织（BAT）的准备、消化/分离溶液的配制，到获得分离的棕色脂肪细胞，大约需要4小时。

在成年小鼠中，大量的棕色脂肪组织（BAT）存在于肩胛间区域。该肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）被肌肉层和白色脂肪组织（WAT）覆盖（图1B）。在开始消化步骤之前，需去除肌肉层和WAT，以获得干净的iBAT（图1C）。在已发表的棕色脂肪细胞（BAs）分离方案中，曾使用剪碎的BAT进行BAs的分离¹²。本研究中，使用3 mm³大小的BAT组织块进行消化，所获得的BAs数量多于使用剪碎BAT的方法（图1D）。

讨论

本研究建立了一种分离胆汁酸用于基因和蛋白质表达分析的新方法。

在已发表的胆管细胞（BAs）分离方案中，曾使用3% BSA溶液来富集BAs¹²。然而，该已发表方案所获得的富集BAs无法直接用于蛋白质表达分析，原因是BAs溶液中残留的高浓度BSA会干扰后续的蛋白质提取过程。当使用Trizol试剂处理在3% BSA溶液中富集的BAs时，会形成黏性蛋白聚集体，其中大部分在GTPC蛋白提取过程中无法溶解。此外，在GTPC蛋白提取产物中，大多数蛋白成分为BSA（图3B）。在本新方案中，以6%碘克沙醇替代3% BSA分离溶液用于纯化BAs。6%碘克沙醇溶液可高效地将BAs与非BAs成分分离，且所分离的BAs形态保持完整（图3D）。相较于3% BSA溶液，6%碘克沙醇溶液不会干扰蛋白质提取，所提取的蛋白适用于Western印迹分析（图4C、D

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>抗体
<强>抗原	<强>公司	<强>目录
PPARγ	LSBio	Ls-C368478
PDGFRa	圣克鲁斯	sc-398206
UCP1	R&D 系统	IC6158P
<强>化学试剂与溶液
胶原酶 II 型	赛默飞世尔科技	17101015
1-溴-3-氯丙烷	Sigma-Aldrich	B62404
牛血清白蛋白（BSA）	Goldbio	A-421-10
氯化钙	生物基础	CT1330
氯仿	IBI Scientific	IB05040
Dispase II，蛋白酶	Sigma-Aldrich	D5693
EDTA	Bio Basic	EB0107
乙醇	IBI Scientific	IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix	生命科学	LS01131905Y
六水合氯化镁	Boston BioProducts	P-855
OneScrip Plus cDNA合成超混合液	ABM	G454
OptiPrep（碘克沙醇）	Cosmo Bio USA	AXS-1114542
PBS（10倍浓缩液）	Caisson Labs	PBL07
PBS（1×）	Caisson Labs	PBL06
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	赛默飞世尔科技	23227
氯化钾	Boston BioProducts	P-1435
SimplyBlue 安全染色剂	Invitrogen	LC6060
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma-Aldrich	75746
Trizol试剂	Life Technologies	15596018
<强>引物
基因名称（物种）	前进	逆转
Pdgfra（小鼠）	CTCAGCTGTCTCCTCACAgG	CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa（小鼠）	TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG	TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4（小鼠）	TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC	TCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1	ACTGCCACACCTCCAGTCATT	CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
<强>仪器设备
<强>名称	<强>公司	<强>应用
Keyence BZ-X700	Keyence	成像棕色脂肪细胞
磁力搅拌器	VWR	解离棕色脂肪组织
QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量 PCR 系统	应用生物系统	定量 PCR
Odyssey Fc 成像系统	LI-COR	Western blot 成像