从小鼠肩胛间棕色脂肪组织中分离棕色脂肪细胞用于基因和蛋白质表达分析

摘要

本研究介绍了一种分离小鼠棕色脂肪细胞以进行基因和蛋白质表达分析的新方法。

摘要

棕色脂肪组织（BAT）负责哺乳动物的非颤抖性产热，而棕色脂肪细胞（BAs）是BAT的功能单位。BAs含有多个小脂滴和丰富的线粒体，并表达解偶联蛋白1（UCP1）。根据其来源，BAs可分为两种亚型：胚胎来源的经典棕色脂肪细胞（cBAs）和由白色脂肪细胞转化而来的棕色脂肪细胞。由于密度较低，传统离心法难以从BAT中分离出BAs。本研究建立了一种新的方法，用于从小鼠中分离BAs，以进行基因和蛋白质表达分析。在该方案中，成年小鼠肩胛间BAT经胶原酶和分散酶溶液消化后，使用6%碘克沙醇溶液富集解离的BAs，随后用Trizol裂解分离得到的BAs。 用于同时分离 RNA、DNA 和蛋白质的试剂。在 RNA 分离后，裂解液的有机相用于蛋白质提取。我们的数据显示，6% 碘克沙醇溶液能有效富集胆汁酸（BAs），且不影响后续的基因和蛋白质表达研究。血小板源性生长因子（PDGF）是一种调控间充质细胞生长与增殖的生长因子。与棕色脂肪组织相比，分离得到的胆汁酸（BAs）中相关基因的表达水平显著升高 Pdgfa总之，这种新方法为在单细胞类型水平上研究棕色脂肪细胞的生物学特性提供了一个平台。

引言

小鼠和人类都具有两种类型的脂肪组织：白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）¹。WAT 以甘油三酯的形式将能量储存在白色脂肪细胞中，而 BAT 中的棕色脂肪细胞（BAs）则将化学能以热能形式耗散²。根据其发育来源，BAs 可进一步分为在胚胎发育过程中形成的经典棕色脂肪细胞（cBAs）以及由白色脂肪细胞转化而来的棕色样脂肪细胞（米色/褐脂细胞，可在应激条件下由白色脂肪细胞转化而来）³。BAs 呈多房室结构，并表达产热蛋白解偶联蛋白1（UCP1）⁴。肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）库是小型哺乳动物中主要的 cBAs 储存部位之一⁵，而米色细胞则分散存在于白色脂肪组织中⁶。

由于具有耗散能量的特性，棕色脂肪细胞（BAs）作为减轻肥胖的治疗靶点已受到广泛关注⁷。为了利用BAs治疗肥胖，必须深入了解调控BAs功能、存活及募集的分子机制。包括棕色脂肪组织（BAT）和白色脂肪组织（WAT）在内的脂肪组织具有异质性。除脂肪细胞外，脂肪组织还包含多种其他细胞类型，例如内皮细胞、间充质干细胞和巨噬细胞⁸。尽管已有可用于在小鼠BAs中特异性敲除候选基因的遗传工具（如UCP1::Cre品系）⁹，但用于从BAT或WAT中纯化BAs的技术仍十分有限，这使得在单细胞类型水平上研究BAs变得困难。此外，若无法获得纯化的BAs，则BAs与非BAs之间的关系将难以明确界定。例如，血小板源性生长因子受体α（PDGFRα）已被用作未分化间充质细胞的标志物，其在BAT的内皮细胞和间质细胞中均有表达。在寒冷应激的BAT中，PDGFRα阳性的前体细胞可分化为新的BAs¹⁰。PDGFRα可被其配体PDGF激活，PDGF是一种调控间充质细胞生长与增殖的生长因子¹¹；然而，目前尚不清楚BAs是否通过分泌PDGF来影响PDGFRα阳性前体细胞的行为。

最近发表了一种基于荧光激活细胞分选（FACS）的胆管细胞（BAs）分离方案¹²。该方案使用3%牛血清白蛋白（BSA）溶液将胆管细胞与非胆管细胞分离，再通过FACS进一步纯化富集的胆管细胞。由于该方案依赖于FACS设备及操作经验，其应用受到一定限制。在本研究中，我们建立了一种从棕色脂肪组织（BAT）中分离胆管细胞的新方案。利用该方案分离的胆管细胞可直接用于基因和蛋白质表达研究。此外，本研究的数据表明，胆管细胞是血小板衍生生长因子（PDGF）的主要来源之一。

方案

所有小鼠均饲养于无病原体环境中，所有实验程序均经马森医学研究机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。UCP1::Cre⁹ 和 Rosa 26^tdTomato 小鼠品系¹³ 此前已有报道。所有小鼠均置于室温条件下，维持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。

1. 溶液与棕色脂肪组织（BAT）的制备

1. 在15 mL离心管中配制消化液和分离液。
2. 10 mL BAT消化液：在10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中加入3.5 mg/mL Dispase II、1 mg/mL Collagenase II和10 mM CaCl₂，配制成BAT消化液。
3. 10 mL 12%碘克沙醇溶液（分离液）：将1 mL 10× PBS、2 mL 60%碘克沙醇、0.01 mL 1 M MgCl₂、0.025 mL 1 M KCl、0.1 mL 0.2 M乙二胺四乙酸（EDTA）和6.865 mL ddH₂O混合，得到12%碘克沙醇溶液。
4. 使用过量CO₂处死一只成年小鼠。具体操作：以每分钟10–30%笼体积的置换速率向小鼠笼内通入100% CO₂，5分钟后通过观察是否无呼吸迹象来确认死亡。
5. 解剖动物并采集肩胛间棕色脂肪组织（BAT），在体视显微镜下剔除白色脂肪组织（WAT）和肌肉层。
6. 为确保充分消化，将每块BAT切成约3 mm³大小的组织块，放入含金属搅拌子和5 mL消化液的洁净50 mL烧瓶中。开始消化前，将含有BAT和消化缓冲液的烧瓶置于冰上静置1小时。
   ​注意：在后续步骤中，用于分离棕色脂肪细胞的BAT组织量约为80 mg。

2. 胆汁酸分离步骤

1. 将烧瓶置于装有磁力搅拌器的培养箱中，搅拌速度设为 60 rpm，培养箱温度设为 35 °C。消化过程持续约 30 分钟。若在消化过程中 BAT 组织块在搅拌子周围聚集，可用 1 mL 移液枪头将聚集的组织打散。
2. 将 70 µm 细胞筛置于洁净的 50 mL 离心管上。将约 4 mL 细胞悬液通过细胞筛过滤。用 4 mL 12% 碘克沙醇溶液冲洗细胞筛。反复吹打混匀细胞与碘克沙醇溶液。将细胞混合液转移至两个透明的 5 mL 聚苯乙烯试管中。
   注意：消化结束后，消化液应呈浑浊状，表明消化充分。每次均应使用新鲜配制的消化液。消化液配制后应在 2 小时内使用完毕。
3. 若消化不充分，重复步骤 2.2 和 2.3 一次。
4. 将含有分离液和脂肪组织（BAs）的透明聚苯乙烯试管置于冰上静置 1 小时，脂肪组织将在上层形成一层。
5. 取 20 µL 分离得到的脂肪组织（BAs）用于显微镜检查。

3. 从BAs中分离RNA和蛋白质

1. 将BAs层移入两个1.7 mL微量离心管中，用于RNA和蛋白质的分离。小心去除过量的碘克沙醇溶液，避免破坏BAs层。
2. 向细胞溶液中加入1 mL Trizol ，以同时分离RNA、DNA和蛋白质。充分混匀以裂解细胞。
3. 加入200 µL氯仿以分离各相。
4. 在4 °C条件下，以9,981 × g离心10分钟。
5. 离心后，取水相用于RNA提取。本研究中，总RNA用于逆转录，随后使用实时PCR进行定量RT-PCR检测。引物序列见材料表。
6. 将300 µL有机相转移至2 mL微量离心管中。
7. 向有机 相中加入2.5体积的100%乙醇，涡旋10秒。
8. 加入200 µL 1-溴-3-氯丙烷，涡旋10秒。
9. 加入600 µL双蒸水，涡旋10秒。
10. 将混合溶液在室温下静置10分钟。
11. 在4 °C条件下，以9,981 × g离心10分钟。此步骤中各相将被分离，蛋白质相位于中间层。
12. 去除上层水相，向剩余溶液中加入1 mL 100%乙醇。
13. 在4 °C条件下，以9,981 × g离心10分钟。离心后将形成蛋白质沉淀，弃去上清液。
14. 用1 mL 100%乙醇洗涤沉淀。
15. 在4 °C条件下，以9,981 × g离心10分钟。保留沉淀，弃去上清液。
16. 在室温下将沉淀空气干燥10分钟。
17. 称量湿沉淀的重量，按每毫克沉淀加入20 µL的比例加入1% SDS溶液。
18. 将离心管置于加热振荡器中溶解沉淀，设定温度为55 °C，转速为11 × g。通常需要5–10分钟即可完全溶解蛋白质沉淀。
    注意：溶解后蛋白质的浓度可通过BCA法测定¹⁴。

结果

肩胛间棕色脂肪组织的制备以分离棕色脂肪细胞
棕色脂肪细胞（BAs）的分离过程如图1A所示。整个流程，从棕色脂肪组织（BAT）的准备、消化/分离溶液的配制到获得分离的棕色脂肪细胞，大约需要4小时。

在成年小鼠中，大量的棕色脂肪组织（BAT）存在于肩胛间区域。该肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）被肌肉层和白色脂肪组织（WAT）覆盖（图1B）。在开始消化步骤之前，需去除肌肉层和WAT，以获得干净的iBAT（图1C）。在已发表的棕色脂肪细胞（BAs）分离方案中，曾使用剪碎的BAT进行BAs的分离¹²。本研究中，使用3 mm³大小的BAT组织块进行消化，所获得的BAs数量多于使用剪碎BAT的方法（图1D）。

讨论

本研究建立了一种分离胆汁酸用于基因和蛋白质表达分析的新方法。

在已发表的胆管细胞（BAs）分离方案中，曾使用3% BSA溶液来富集BAs¹²。然而，该已发表方案所获得的富集BAs无法直接用于蛋白质表达分析，原因是BAs溶液中残留的高浓度BSA会干扰后续的蛋白质提取过程。当使用Trizol试剂处理在3% BSA溶液中富集的BAs时，会形成黏性蛋白聚集体，其中大部分在GTPC蛋白提取过程中无法溶解。此外，在GTPC蛋白提取产物中，大多数蛋白成分为BSA（图3B）。在本新方案中，以6%碘克沙醇替代3% BSA分离溶液用于纯化BAs。6%碘克沙醇溶液可高效地将BAs与非BAs成分分离，且所分离的BAs形态保持完整（图3D）。相较于3% BSA溶液，6%碘克沙醇溶液不会干扰蛋白质提取，所提取的蛋白适用于Western印迹分析（图4C、D

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>抗体
<强>抗原	<强>公司	<强>目录
PPARγ	LSBio	Ls-C368478
PDGFRa	圣克鲁斯	sc-398206
UCP1	R&D 系统	IC6158P
<强>化学试剂与溶液
胶原酶 II 型	赛默飞世尔科技	17101015
1-溴-3-氯丙烷	Sigma-Aldrich	B62404
牛血清白蛋白（BSA）	Goldbio	A-421-10
氯化钙	生物基础	CT1330
氯仿	IBI Scientific	IB05040
Dispase II，蛋白酶	Sigma-Aldrich	D5693
EDTA	Bio Basic	EB0107
乙醇	IBI Scientific	IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix	生命科学	LS01131905Y
六水合氯化镁	Boston BioProducts	P-855
OneScrip Plus cDNA合成超混合液	ABM	G454
OptiPrep（碘克沙醇）	Cosmo Bio USA	AXS-1114542
PBS（10倍浓缩液）	Caisson Labs	PBL07
PBS（1×）	Caisson Labs	PBL06
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	赛默飞世尔科技	23227
氯化钾	Boston BioProducts	P-1435
SimplyBlue 安全染色剂	Invitrogen	LC6060
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma-Aldrich	75746
Trizol试剂	Life Technologies	15596018
<强>引物
基因名称（物种）	前进	逆转
Pdgfra（小鼠）	CTCAGCTGTCTCCTCACAgG	CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa（小鼠）	TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG	TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4（小鼠）	TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC	TCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1	ACTGCCACACCTCCAGTCATT	CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
<强>仪器设备
<强>名称	<强>公司	<强>应用
Keyence BZ-X700	Keyence	成像棕色脂肪细胞
磁力搅拌器	VWR	解离棕色脂肪组织
QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量 PCR 系统	应用生物系统	定量 PCR
Odyssey Fc 成像系统	LI-COR	Western blot 成像