在活体斑马鱼中同时进行钙成像与葡萄糖刺激以研究体内β细胞功能

摘要

本研究提供了一种对斑马鱼胰岛β细胞进行钙成像及葡萄糖刺激的实验方案 在体.

摘要

胰腺β细胞通过根据血糖水平产生和分泌胰岛素来维持全身的葡萄糖稳态。β细胞功能缺陷与高血糖相关，可能导致糖尿病。在胰岛素分泌过程中，β细胞经历Ca²⁺内流，从而触发胰岛素囊泡的胞吐作用。 关键词：胰腺β细胞，胰岛素分泌，葡萄糖稳态，Ca²⁺内流，β细胞功能，高血糖，糖尿病²⁺因此，成像葡萄糖刺激下的Ca²⁺²⁺ 使用基因编码的钙离子指示剂（GECIs）检测钙离子内流为研究β细胞功能提供了一条途径。先前的研究表明，表达GCaMP6s的分离自斑马鱼的胰岛表现出显著的Ca²⁺ 在给予特定葡萄糖浓度刺激后检测其活性。然而，至关重要的是研究β细胞在体内原生环境中对葡萄糖的响应，而非孤立状态下；在此环境中，β细胞系统性地相互连接，并具有丰富的血管化和密集的神经支配。为此，本研究利用了斑马鱼幼体在发育早期阶段的光学透明特性，以观察β细胞的活性 体内. 本文提供了一种详细的 Ca²⁺ 成像与葡萄糖刺激相结合以研究β细胞功能 体内 被呈现。该技术可用于监测协调的 Ca²⁺ 以单细胞分辨率研究β细胞中的动态变化。此外，该方法还可用于注射其他可注射溶液，如小分子或肽类。总体而言，该方案展示了斑马鱼模型在研究胰岛协调功能方面的潜力 体内 并表征环境和遗传因素可能如何影响β细胞功能。

引言

胰腺β细胞具有响应葡萄糖而分泌胰岛素的独特能力。在摄入富含碳水化合物的食物后，血糖水平升高并进入β细胞，在细胞内迅速代谢产生ATP。细胞内ATP/ADP比率的升高导致ATP依赖性K⁺通道关闭，引起细胞膜去极化，从而激活电压依赖性Ca²⁺通道。细胞内Ca²⁺浓度的迅速上升刺激β细胞分泌胰岛素颗粒。

对小鼠完整胰腺内胰岛细胞进行成像具有较高难度，通常需要将整个器官外置。一种有效的非侵入性替代方法 体内 成像方法是将胰岛移植到小鼠眼球的前房（AC）中¹将胰岛移植到小鼠前房（AC）中可模拟一种 体内 环境，支持纵向研究和Ca²⁺ 成像 体内^2,3然而，胰岛移植后的胰岛再血管化过程可能需要数周时间⁴因此，保留β细胞原有的天然环境，即β细胞具有血管化并连接于机体代谢状态的环境，并实现 体内 单细胞成像分辨率仍然极具挑战性且耗时。

为了克服这些局限性，研究人员开发了在β细胞中表达GECI的斑马鱼转基因品系，可实现Ca²⁺动态的实时可视化²⁺

方案

本研究中使用的先前建立的转基因品系为 Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)⁶ 和 Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP)¹⁴。所有实验均遵循欧盟和德国法律（Tierschutzgesetz）进行，并获得德累斯顿工业大学（TU Dresden）以及萨克森州管理局（Landesdirektion Sachsen）伦理委员会的批准（批准编号：AZ 24D-9168,11-1/2013-14、TV38/2015、T12/2016、T13/2016、TVV50/2017、TVV 45/2018 和 TVV33-2019）。本研究中所有活体成像（in vivo）、葡萄糖注射以及实验操作均使用受精后不超过5天（dpf）的斑马鱼幼体进行，符合动物保护法规（TierSchVersV §14）的规定。根据欧盟指令2010/63/EU，使用此类早期发育阶段的斑马鱼可减少实验动物的使用数量，符合3R原则。

1. 准备

注意：本方案涉及对 Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP)；Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry) 双转基因幼鱼中斑马鱼初级胰岛进行的 体内 Ca<....

结果

使用本方案，可表征天然微环境中单个β细胞的葡萄糖反应。为此，将斑马鱼幼体固定于玻璃底培养皿中。利用三维操纵器将玻璃毛细管插入循环系统，靶向SV（静脉窦）图1 和 图2）。这使得能够注入具有确定浓度的特定体积溶液。同时，葡萄糖诱导的Ca²⁺内流²⁺ 记录了成像平面上所有β细胞的荧光强度值，并使用FIJI提取荧光强度数值。¹⁷最后，评估了每个β细胞的反应时间 体内 (图3 和 补充影片 1）。为此，可绘制每个单独的 β 细胞中 GCaMP6s 信号的变化，如图所示 图3A,3B 和 补充影片 1荧光归一化可用来比较细胞的反应时间（图3B反应时间 T_2.......

讨论

在本实验方案中，研究了β细胞在其天然微环境中单细胞分辨率下的Ca²⁺动态变化。该研究通过向斑马鱼血液循环中注射葡萄糖以刺激β细胞，同时利用GCaMP6s记录其Ca²⁺动态变化来实现。

该方案具有三个主要优势。首先，研究人员已证实，斑马鱼β细胞对葡萄糖刺激表现出协调性反应 体内^7,13,18相比之下，在细胞培养中观察到β细胞的反应通常不协调¹⁹因此， 体内 成像对于维持β细胞的生理性和协调性反应至关重要。其次，该方案保留了胰岛所处的天然微环境，其中胰岛受到密集的神经支配并由血液充分灌注。特别是，血液灌注可使β细胞对葡萄糖产生快速反应。 平均值 体内 反应时间平均发生在葡萄糖注射后4秒（标准差 = ±4.40秒，n = 40），比此前报道的更快 <.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 直径玻璃底培养皿	Mattek	P35G-1.5-14-C	我们使用这种玻璃底培养皿固定斑马鱼幼鱼，并进行共聚焦显微镜观察
蓝绿色滤光片组	ZEISS	489038-9901-000	滤光片组 38 HE
共聚焦显微镜	ZEISS	LSM 980
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7528
Excel (2016)			https://www.office.com/
Femtojet	Eppendorf	5252000013	该设备为气动微注射泵，可实现精确的体积输送，并配有毛细管固定装置。我们使用 Femtojet 微注射泵（注射压力为 500–1000 hPa；补偿压力 = 0 hPa；注射时间为 1 秒）。
Femtotips，即预装玻璃毛细管	Eppendorf	5242952008	这些是可直接使用的玻璃毛细管，可替代自行拉制的毛细管
FIJI，使用 ImageJ 版本：1.51c			https://fiji.sc/
荧光灯	ZEISS	423013-9010-000	HXP 120 V 照明器
玻璃毛细管 3.5"	Drummonds Scientific Company	3-000-203-G/X	我们使用这些玻璃毛细管，通过毛细管拉制仪拉制注射用毛细管
Injectman	Eppendorf	5192000019	该设备可实现对毛细管固定装置的三维操控
低熔点琼脂糖	Biozym	货号：840101	我们使用该琼脂糖将斑马鱼固定在玻璃底培养皿上
用于玻璃微量毛细管的 Microloader 吸头，0.5 – 20 µL，100 mm	Eppendorf	5242956003	用于向玻璃毛细管中加样溶液的长吸头
显微镊子	Dumont 瑞士制造	0102-4-PO	我们使用显微镊子在固定过程中移动斑马鱼幼鱼，并剪断玻璃毛细管的尖端（例如 Dumont，4 号规格）。
矿物油	Sigma-Aldrich	M5904	我们使用矿物油校准待注射液滴的大小
P-1000 Next Generation 毛细管拉制仪	Science Products	P-1000	我们使用该毛细管拉制仪，以 Drummond 毛细管制备玻璃毛细管。使用 P-1000 毛细管拉制仪的参数如下：加热温度：650，拉力：20，速度：160，时间：200，气压：500。
PTU（1-苯基-2-硫脲）	Sigma-Aldrich	P7629	我们使用该化合物抑制斑马鱼发育过程中的色素形成
红色滤光片组	ZEISS	000000-1114-462	滤光片组 45 HQ TexasRed
体视显微镜	ZEISS	495015-0001-000	SteREO Discovery.V8
无菌注射器滤器，孔径 0.2 µm	Pall Corporation	4612	我们使用这些滤器过滤所有溶液，防止毛细管针头堵塞
转基因斑马鱼品系：Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP)；Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)
三卡因甲磺酸盐（MS222）	Sigma-Aldrich	E10521	我们使用该化合物麻醉鱼苗