本研究提供了一种对斑马鱼胰岛β细胞进行钙成像及葡萄糖刺激的实验方案 在体.
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摘要
摘要
胰腺β细胞通过根据血糖水平产生和分泌胰岛素来维持全身的葡萄糖稳态。β细胞功能缺陷与高血糖相关，可能导致糖尿病。在胰岛素分泌过程中，β细胞经历Ca²⁺内流，从而触发胰岛素囊泡的胞吐作用。 关键词：胰腺β细胞，胰岛素分泌，葡萄糖稳态，Ca²⁺内流，β细胞功能，高血糖，糖尿病2+因此，成像葡萄糖刺激下的Ca²⁺2+ 使用基因编码的钙离子指示剂（GECIs）检测钙离子内流为研究β细胞功能提供了一条途径。先前的研究表明，表达GCaMP6s的分离自斑马鱼的胰岛表现出显著的Ca2+ 在给予特定葡萄糖浓度刺激后检测其活性。然而，至关重要的是研究β细胞在体内原生环境中对葡萄糖的响应，而非孤立状态下；在此环境中，β细胞系统性地相互连接，并具有丰富的血管化和密集的神经支配。为此，本研究利用了斑马鱼幼体在发育早期阶段的光学透明特性，以观察β细胞的活性 体内. 本文提供了一种详细的 Ca2+ 成像与葡萄糖刺激相结合以研究β细胞功能 体内 被呈现。该技术可用于监测协调的 Ca2+ 以单细胞分辨率研究β细胞中的动态变化。此外，该方法还可用于注射其他可注射溶液，如小分子或肽类。总体而言，该方案展示了斑马鱼模型在研究胰岛协调功能方面的潜力 体内 并表征环境和遗传因素可能如何影响β细胞功能。
引言
胰腺β细胞具有响应葡萄糖而分泌胰岛素的独特能力。在摄入富含碳水化合物的食物后，血糖水平升高并进入β细胞，在细胞内迅速代谢产生ATP。细胞内ATP/ADP比率的升高导致ATP依赖性K+通道关闭，引起细胞膜去极化，从而激活电压依赖性Ca2+通道。细胞内Ca2+浓度的迅速上升刺激β细胞分泌胰岛素颗粒。
对小鼠完整胰腺内胰岛细胞进行成像具有较高难度，通常需要将整个器官外置。一种有效的非侵入性替代方法 体内 成像方法是将胰岛移植到小鼠眼球的前房（AC）中1将胰岛移植到小鼠前房（AC）中可模拟一种 体内 环境，支持纵向研究和Ca2+ 成像 体内2,3然而，胰岛移植后的胰岛再血管化过程可能需要数周时间4因此，保留β细胞原有的天然环境，即β细胞具有血管化并连接于机体代谢状态的环境，并实现 体内 单细胞成像分辨率仍然极具挑战性且耗时。
为了克服这些局限性，研究人员开发了在β细胞中表达GECI的斑马鱼转基因品系，可实现Ca²⁺动态的实时可视化2+ β细胞中的内流5,6,7,8,9利用这些工具，研究人员发现，在细胞培养条件下，斑马鱼β细胞对高浓度葡萄糖的反应与小鼠和人类胰岛相似，表现出保守的功能特性。此外，斑马鱼幼体具有良好的光学通透性，使得研究人员能够在原生环境中观察β细胞的功能。重要的是，早在受精后4天（dpf），斑马鱼主胰岛的β细胞即表达成熟的分子标志物，例如斑马鱼的尿皮质素3（urocortin3）同源物ucn3l）并展示 体外 生理浓度范围内的葡萄糖反应6此外，斑马鱼胰岛具有密集的血管化和神经支配。10在此阶段对β细胞进行基因消融会导致葡萄糖耐受不良。此外，斑马鱼对胰岛素和磺脲类等降糖药物表现出保守的反应，表明其原始胰岛是能够响应葡萄糖并系统性调控血糖水平的组织。这些特性使斑马鱼成为研究胰岛β细胞功能的独特模型 体内11,12.
Ca的实验方案2+ 在斑马鱼循环系统中进行成像并同时直接注射葡萄糖，可用来研究β细胞对葡萄糖的响应能力 体内该方案能够实现特定葡萄糖浓度的注射，同时具备高时间分辨率和空间分辨率，从而整体揭示β细胞对葡萄糖的协调反应以及首应答β细胞的存在。 体内13. 此外，该方案可适用于任何可注射溶液，如化学化合物或小分子肽。总体而言，该方法展示了斑马鱼模型在研究β细胞协调性方面的优势 体内 并表征环境和遗传因素可能如何影响β细胞的功能。
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方案
本研究中使用的先前建立的转基因品系为 Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)6 和 Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP)14。所有实验均遵循欧盟和德国法律（Tierschutzgesetz）进行，并获得德累斯顿工业大学（TU Dresden）以及萨克森州管理局（Landesdirektion Sachsen）伦理委员会的批准（批准编号：AZ 24D-9168,11-1/2013-14、TV38/2015、T12/2016、T13/2016、TVV50/2017、TVV 45/2018 和 TVV33-2019）。本研究中所有活体成像（in vivo）、葡萄糖注射以及实验操作均使用受精后不超过5天（dpf）的斑马鱼幼体进行，符合动物保护法规（TierSchVersV §14）的规定。根据欧盟指令2010/63/EU，使用此类早期发育阶段的斑马鱼可减少实验动物的使用数量，符合3R原则。
1. 准备
注意：本方案涉及对 Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP)；Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry) 双转基因幼鱼中斑马鱼初级胰岛进行的 体内 Ca2+ 成像。在这些动物中，胰岛素启动子驱动 cdt1-mCherry 的表达，使单个 β 细胞的细胞核呈现红色荧光标记。GCaMP6s 可根据细胞内 Ca2+ 水平的变化产生绿色荧光信号。GCaMP6s 在 β 细胞中的特异性表达使得能够在无其他细胞类型或组织干扰的情况下，对单个细胞的葡萄糖响应性进行表征。
- 制备E2胚胎培养基15.
- 在10% Hanks平衡盐溶液中配制0.003%（200 µm）1-苯基-2-硫脲（PTU）15.
- 在微波炉中加热 E2 胚胎培养基中的 1% 低熔点琼脂糖（LMA），随后用滤器过滤 <25 µm 孔径滤器。将 LMA 保持在 >37 °C 下最长保存 1 周。
注意：所有溶液均需过滤，以防止堵塞注射用玻璃毛细管。 - 用979 mL无菌H₂O配制0.4%的三卡因甲烷磺酸盐（MS222）溶液2O 和 21 mL 1 M Tris（pH 9）。调节 pH 至 7。
- 将1.8 g D-葡萄糖溶于50 mL PBS中，配制200 mM D-葡萄糖溶液，并用滤器过滤 <25 µm 孔径的滤器。通过将 200 mM D-葡萄糖在 1× PBS（经滤过）中按 1:8 比例稀释，制备 D-葡萄糖工作液（25 mM）。长期储存时置于 4 °C 保存。向 1 mL 25 mM D-葡萄糖溶液中加入 5 µL 酚红，以便在注射时可视化溶液。
注意：该溶液可在 4 °C 保存 1 周。然而，25 mM 的工作液应现配现用。若储存液出现任何污染迹象，应予以弃用。 - 使用毛细管拉制仪制备拉制微注射玻璃毛细管，或采购市售的微玻璃毛细管。针头拉制参数详见 材料表.
注意：与带有内部丝状物的同类毛细管相比，由无内丝硼硅酸盐玻璃制成的显微注射毛细管效果更佳。 - 准备直径为35 mm的玻璃底培养皿用于固定斑马鱼幼鱼。本方案中使用的玻璃底培养皿其玻璃盖厚度为0.17 mm，适用于共聚焦显微系统中玻璃校正物镜的成像。
- 采购微量上样移液器吸头。本方案中使用了20 µL、长度为100 mm的微量上样器。
- 准备一套显微镊子。
- 准备90 mm的培养皿用于斑马鱼的分选和培养。
- 获取矿物油。
- 准备一个气动微泵或能够通过玻璃毛细管输送1-5 nL液体体积的系统。
- 对于斑马鱼的分选与制片，使用配备光源的体视显微镜，并装配用于荧光观察的蓝色和红色滤光片组（CFP：激发光波长 420–450 nm，发射光波长 460–490 nm；TRITC：激发光波长 532–554 nm，发射光波长 570–613 nm；或 Texas-Red：激发光波长 540–580 nm，发射光波长 592–667 nm）。对双转基因个体进行分选 Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry) 在体视显微镜下观察幼虫。选择视网膜中因在晶状体蛋白启动子驱动下表达CFP和mCherry而呈现蓝色和红色荧光的胚胎。
- 用于成像 Ca2+ 使用配备10倍（0.8 NA）空气和40倍（1.0 NA）水镜的倒置共聚焦显微镜，以及可容纳35 mm玻璃底培养皿的载物台支架，检测β细胞中的内流。
- 获取一个带毛细管夹持器的手动或电动三维操纵器。将玻璃毛细管插入毛细管夹持器中，并将夹持器安装到三维操纵器上。
注意：三维操纵器可实现玻璃毛细管的精确定位，并将其插入斑马鱼幼鱼体内。
2. 斑马鱼幼鱼的制片
注意：从受精后24小时开始，将双转基因Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP)；Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)胚胎置于含0.03%（20 µM）1-苯基-2-硫脲（PTU）的溶液中处理，以抑制色素形成。在4.5天时，固定前使用终浓度为0.04%的Tricaine麻醉幼鱼。
- 在成像过程中为维持麻醉状态，向1%低熔点琼脂糖中加入终浓度为0.04%的三卡因（Tricaine）和20 µM的PTU。使用前将低熔点琼脂糖（LMA）保持在>37 °C。该溶液需在配制当天使用。
- 挑选处于麻醉状态的双转基因 Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 幼鱼。将3–5条鱼置于玻璃底培养皿中，并吸除大部分液体。
注意：此步骤中切勿让幼鱼干燥，应始终使其浸没于最低量的E2溶液中。 - 向含有幼鱼的玻璃底培养皿中加入500 µL低熔点琼脂糖（LMA），借助显微镊子轻轻移动幼鱼，使其右侧直接接触玻璃底部。去除多余的琼脂糖，并静置1–3分钟使其凝固。此时可观察到琼脂糖略显不透明（图1B）。
注意：若琼脂糖温度过高，可能损伤幼鱼。为避免此情况，可在加入幼鱼前将琼脂糖于室温下冷却30–45秒。 - 待琼脂糖完全凝固后，借助显微镊子小心去除心脏区域周围的琼脂糖，以防止后续注射时针头与琼脂糖接触导致损坏（图1C）。
- 加入500 µL含有终浓度0.04%三卡因（Tricaine）和20 µM PTU的E2溶液。
注意：活体成像过程中应确保幼鱼不干燥。
3. 胰岛β细胞的同时注射与Ca2+成像
注意：由于发育延迟导致胰腺上方存在过多卵黄的幼体不应用于成像，因为卵黄中的脂质会干扰图像质量。此外，应使用较低的激光功率（0.5%–5%），以避免光漂白和光毒性。
- 使用体视显微镜和微型镊子，剪断玻璃毛细管的尖端。
注意：切勿剪断毛细管尖端以外的部位，因为毛细管的直径应小于斑马鱼心脏的流入道。 - 使用上样吸头，将25 mM D-葡萄糖溶液吸入针管中。
注意：毛细管必须均匀填充，需特别注意避免产生任何气泡，因为气泡会干扰准确注射体积的递送。 - 将玻璃毛细管安装至毛细管固定器中，并连接至微泵。将微泵的注射压力维持在500–1,000 hPa，补偿压力设为0 hPa，输送时间设为1 s。
- 为校准注射体积，使用配备刻度目镜的体视显微镜。在体视显微镜下将一滴矿物油置于玻璃载片上。将体视显微镜的变倍调至4倍，物镜设为1.5倍。插入玻璃毛细管至矿物油中进行注射。
注意：5 nL 相当于体视显微镜目镜刻度显示的 5 个单位。通过增加或减少微泵的注射压力来调节液滴体积。 - 将毛细管支架安装到三维操纵器上。
注意：三维操纵器应能够对毛细管支架在 x、y 和 z 方向进行精细的运动控制。 - 将载有固定幼虫的培养皿小心放置在共聚焦显微镜的载物台 holder 上。使用10x、0.8 NA的空气物镜，通过明场模式定位幼虫。
- 将斑马鱼的心脏侧朝向毛细管和三维操作器所在的方向。通过观察红色荧光，确保胰岛位于视野中央。
注意：从此时起，应保持载物台固定不动（图2). - 使用三维操纵器将玻璃毛细管移向幼虫心脏，穿透皮肤，对准心包腔。小心地将毛细管插入位于心房约100–200 µm处的总主静脉（CCV）与静脉窦（SV）交界区域中央16, (图1B 和 图 2C）。针头与培养板表面的角度约为20–30°。若培养板边缘过高，可将其移除，以便毛细管更易接近。
注意：此步骤十分关键，需要极为谨慎地进行穿刺；快速移动可能会扰动心脏或导致该区域血液凝结。如果血流受到干扰，应更换另一个样本。由于三维操纵器保持固定位置，应避免移动载物台，以免影响心脏组织。 - 将毛细管放入SV后，切换至40倍、1.2 NA水浸物镜。使用红绿488/561二向色镜，寻找β细胞中细胞核的mCherry信号，并对准胰岛进行聚焦。
注意：单个细胞核应清晰可见，且绿色荧光应较弱（图1D). - 同时采集 GCaMP6s 和 mCherry 荧光信号，设置如下参数： 智能设置菜单：GFP（GCaMP6s），激发波长：488 nm，发射波长：498–555 nm，伪彩色：绿色（选择 GFP）；mCherry，激发：561 nm（mCherry），发射：570–640 nm，伪彩色：红色（选择 mCherry）。透射光，假彩色：灰色。
- 通过调整胰岛 z 轴方向的焦平面来调节成像平面，找到包含大多数 β 细胞的成像平面。
- 调节核mCherry信号的增益，以均匀识别每个单个细胞，并使其覆盖约70%的颜色直方图。
- 调节GCaMP6s信号的增益，使其覆盖颜色直方图至少25%的范围，因为GCaMP6s的亮度最高可增加4倍。
- 调节透射光的增益，使样品信号均匀，覆盖约70%的颜色直方图。
注意：使用灰色通道来可视化并确保胰岛的血流正常。 - 在 采集模式，将图像分辨率设置为 512 x 512 像素，放大倍数设为 5，线步进设为 3，扫描速度设为 13，平均线数设为 2-3。选择该选项 时间序列，并设置 持续时间 至500个循环，采集速率为每帧150毫秒。
注意：时间序列的前50帧对应于葡萄糖注射前的基线荧光。已观察到部分β细胞表现出基础活性。 体内响应性的β细胞在葡萄糖注射后会随时间推移显示出绿色荧光强度的增加。大多数β细胞对25 mM葡萄糖注射有响应 体内. - 开始成像。在前50帧（7.5秒）后，使用微泵注射葡萄糖。
注意：注射可能会引起轻微移动，导致胰岛的焦平面发生偏移。在录像过程中，肠道运动可能会改变胰岛的焦平面。 - 在图像采集过程中密切观察，并手动调整 x、y 和 z 坐标，以在整个视频中保持相同的焦平面。
- 葡萄糖注射后，系统以Ca记录胰岛的反应2+ 通过GCaMP荧光强度的增加来反映内流情况。每次注射后，让幼虫至少静置5分钟，再进行任何进一步的刺激。
注意：确保细胞核在整个过程中保持稳定。如果胰岛在图像采集期间发生明显移动，或已移出焦平面，则该样本无法用于后续分析。 - 重复注射三次。将视频保存为 TIF、CZI 或 LSM 格式（推荐）。记录完 Ca2+ 反应完成后，缓慢地将毛细管从心脏移开。进入下一个样本。
注意：可将斑马鱼幼鱼转移至含有PTU的新鲜E2培养基的培养皿中进行恢复。
4. 单个β细胞GCaMP荧光信号的定量分析
注意：如果动物运动过多，可使用 FIJI 插件基于描述符的序列配准（2d/3d + t）17对视频进行稳定化处理。
- 通过将图像拖放到 FIJI 中来加载待分析的图像。在 Bio-format Import Options 窗口中，点击 OK 。
注意：对于 FIJI 不支持的格式，请将视频转换为 tiff 格式以进行分析。 - 为提取 GCaMP 荧光强度，点击菜单 Analyze > Set Measurements ，勾选 Integrated density 选项，然后点击 OK 。
- 打开 ROI Manager 。
- 在 FIJI 菜单中，选择工具栏中的 Polygon selections 。
- 手动绘制一个多边形，覆盖略大于细胞核的区域，并包含部分细胞质区域，以确保对 Ca2+ 反应进行准确的单细胞定量。
- 确保 ROI 在各帧中的位置保持一致；如有必要，调整 ROI。
- 通过点击 Add [t] 按钮，将选定的 ROI 添加到 ROI Manager 中。
- 为量化 GCaMP 信号，需将图像的通道分离。点击 FIJI 菜单 Image > Colors > Split Channels ，并选择 Green Channel 。
- 在 ROI Manager 中，选择所有区域，然后点击菜单 More > Multi Measure ，并保存结果。
注意：若因葡萄糖注射或动物移动导致细胞移出多边形区域，可通过手动调整多边形区域，分别提取移动前后的细胞荧光信号。 - 为进行单细胞分析，请执行以下步骤。
- 去除背景荧光。为此，将每个细胞在整个视频中记录到的最小荧光值（FMIN）视为背景荧光，并从每个细胞的整个时间序列中减去该最小值（FT - FMIN）。
- 对视频中的荧光值进行归一化处理。为此，将每个数值除以该细胞在整个记录中的最大强度值。具体方法为：计算 FMIN 与 FMAX 之间的差值，即 (FMAX - FMIN)，然后计算 (FT - FMIN) / (FMAX - FMIN)。
注意：此步骤可实现不同细胞之间以及来自不同动物的胰岛之间 Ca2+ 反应的比较，因为荧光强度水平会因焦平面位置以及细胞或胰岛在成像时的可及性而有所不同。
- 在获取单细胞荧光值后，使用某一程序（如 Excel 或 R）处理第 4 步测得的荧光值，并自动绘制荧光轨迹图。本实验方案中（第 6 步）使用了 Supplemental Table 1 （Singlecelltrace.xlsx）进行数据分析。
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结果
使用本方案，可表征天然微环境中单个β细胞的葡萄糖反应。为此，将斑马鱼幼体固定于玻璃底培养皿中。利用三维操纵器将玻璃毛细管插入循环系统，靶向SV（静脉窦）图1 和 图2）。这使得能够注入具有确定浓度的特定体积溶液。同时，葡萄糖诱导的Ca²⁺内流2+ 记录了成像平面上所有β细胞的荧光强度值，并使用FIJI提取荧光强度数值。17最后，评估了每个β细胞的反应时间 体内 (图3 和 补充影片 1）。为此，可绘制每个单独的 β 细胞中 GCaMP6s 信号的变化，如图所示 图3A,3B 和 补充影片 1荧光归一化可用来比较细胞的反应时间（图3B反应时间 T2...
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讨论
在本实验方案中，研究了β细胞在其天然微环境中单细胞分辨率下的Ca2+动态变化。该研究通过向斑马鱼血液循环中注射葡萄糖以刺激β细胞，同时利用GCaMP6s记录其Ca2+动态变化来实现。
该方案具有三个主要优势。首先，研究人员已证实，斑马鱼β细胞对葡萄糖刺激表现出协调性反应 体内7,13,18相比之下，在细胞培养中观察到β细胞的反应通常不协调19因此， 体内 成像对于维持β细胞的生理性和协调性反应至关重要。其次，该方案保留了胰岛所处的天然微环境，其中胰岛受到密集的神经支配并由血液充分灌注。特别是，血液灌注可使β细胞对葡萄糖产生快速反应。 平均值 体内 反应时间平均发生在葡萄糖注射后4秒（标准差 = ±4.40秒，n = 40），比此前报道的更快 <...
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
Nikolay Ninov 获得了德累斯顿工业大学再生治疗研究中心（CRTD）和德国糖尿病研究中心（DZD）的资助，以及德国研究基金会（DFG）和国际研究培训组（IRTG 2251）“代谢性疾病中的免疫与细胞策略”的研究基金。我们感谢CRTD光镜设施在所有成像技术方面提供的支持。我们感谢CRTD鱼类设施提供的全部鱼类技术协助与支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35 mm 直径玻璃底培养皿 | Mattek | P35G-1.5-14-C | 我们使用这种玻璃底培养皿固定斑马鱼幼鱼，并进行共聚焦显微镜观察 |
| 蓝绿色滤光片组 | ZEISS | 489038-9901-000 | 滤光片组 38 HE |
| 共聚焦显微镜 | ZEISS | LSM 980 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Excel (2016) | https://www.office.com/ | ||
| Femtojet | Eppendorf | 5252000013 | 该设备为气动微注射泵，可实现精确的体积输送，并配有毛细管固定装置。我们使用 Femtojet 微注射泵（注射压力为 500–1000 hPa；补偿压力 = 0 hPa；注射时间为 1 秒）。 |
| Femtotips，即预装玻璃毛细管 | Eppendorf | 5242952008 | 这些是可直接使用的玻璃毛细管，可替代自行拉制的毛细管 |
| FIJI，使用 ImageJ 版本：1.51c | https://fiji.sc/ | ||
| 荧光灯 | ZEISS | 423013-9010-000 | HXP 120 V 照明器 |
| 玻璃毛细管 3.5" | Drummonds Scientific Company | 3-000-203-G/X | 我们使用这些玻璃毛细管，通过毛细管拉制仪拉制注射用毛细管 |
| Injectman | Eppendorf | 5192000019 | 该设备可实现对毛细管固定装置的三维操控 |
| 低熔点琼脂糖 | Biozym | 货号：840101 | 我们使用该琼脂糖将斑马鱼固定在玻璃底培养皿上 |
| 用于玻璃微量毛细管的 Microloader 吸头，0.5 – 20 µL，100 mm | Eppendorf | 5242956003 | 用于向玻璃毛细管中加样溶液的长吸头 |
| 显微镊子 | Dumont 瑞士制造 | 0102-4-PO | 我们使用显微镊子在固定过程中移动斑马鱼幼鱼，并剪断玻璃毛细管的尖端（例如 Dumont，4 号规格）。 |
| 矿物油 | Sigma-Aldrich | M5904 | 我们使用矿物油校准待注射液滴的大小 |
| P-1000 Next Generation 毛细管拉制仪 | Science Products | P-1000 | 我们使用该毛细管拉制仪，以 Drummond 毛细管制备玻璃毛细管。使用 P-1000 毛细管拉制仪的参数如下：加热温度：650，拉力：20，速度：160，时间：200，气压：500。 |
| PTU（1-苯基-2-硫脲） | Sigma-Aldrich | P7629 | 我们使用该化合物抑制斑马鱼发育过程中的色素形成 |
| 红色滤光片组 | ZEISS | 000000-1114-462 | 滤光片组 45 HQ TexasRed |
| 体视显微镜 | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
| 无菌注射器滤器，孔径 0.2 µm | Pall Corporation | 4612 | 我们使用这些滤器过滤所有溶液，防止毛细管针头堵塞 |
| 转基因斑马鱼品系：Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP)；Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry) | |||
| 三卡因甲磺酸盐（MS222） | Sigma-Aldrich | E10521 | 我们使用该化合物麻醉鱼苗 |
参考文献
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