我们介绍了一种利用明场显微镜和细胞追踪技术对数百个微米至毫米级细胞群体的运动性和行为进行表征的实验方案。该检测方法揭示了Stentor coeruleus在再生缺失的口器结构过程中会经历四个行为上截然不同的阶段。
本文内容
摘要
摘要
Stentor coeruleus 是一种研究单细胞再生的著名模式生物。对单个细胞进行转录组分析揭示了数百个基因—许多与口器装置（OA）无关的基因在再生过程的不同阶段受到差异调控。据此推测，这种系统性的重组以及细胞资源向新OA生长的动员，将导致运动和行为发生可观测的变化，且这些变化在时间上与差异基因表达的各个阶段相对应。然而，其形态复杂性 S. coeruleus 需要开发一种检测方法来捕捉其统计特征和时间尺度。使用自定义脚本对短时视频中的细胞进行追踪，并在大样本群体（N ~100）上汇总统计结果。在OA缺失后， S. coeruleus 最初失去定向运动能力；随后从约4小时开始，运动速度显著下降，直至约8小时。该检测方法为运动表型的筛选提供了有用的工具，并可适用于其他生物体的研究。
引言
Stentor coeruleus（Stentor）是一种著名的模式生物，因其体型较大、能够耐受多种显微外科技术操作，并且易于在实验室条件下培养，已被广泛用于单细胞再生研究1,2,3。早期的再生研究主要聚焦于Stentor中最显著且形态最独特的结构——口器（OA），该结构在化学刺激下会完全脱落4,5,6。从头再生缺失的口器始于新的膜带结构的出现，即一束纤毛逐渐向前移动，并在经历八个形态学阶段后形成具有功能的口器3。无论温度如何，这些阶段均按顺序依次发生，为几乎所有相关研究提供了通用的参考标准5。
机制分析 喇叭虫 再生研究需要具备稳健且简便的工具来测量再生的时间进程，以便将其应用于化学或分子筛选中的多个样本。基于细胞的检测标准方法是成像，在本例中即对再生过程中新口器（OA）形成的成像。然而，这类基于成像的检测方法仅在再生结构包含可作为标记物的独特分子组分时最为有效，从而能够在荧光图像中被清晰识别。对于 喇叭虫 OA中已知的组分（纤毛、基体）也存在于细胞表面的其他区域；因此，仅通过检测某一组分的存在或缺失无法判断OA是否恢复。
相反，检测口器（OA）可能需要某种形式的形态识别，而鉴于Stentor细胞常通过快速收缩过程改变其形状，这可能极具挑战性。本文介绍了一种依赖于体部和口器纤毛运动活性的再生替代检测方法。随着口器的再生，新形成的纤毛在位置和活性上会发生可重复的变化，进而影响细胞的游动能力。通过分析游动行为，可以对"功能性再生"进行定量检测，即通过量化再生结构的功能来评估再生程度。以往对Stentor再生过程中纤毛功能的研究采用粒子图像测速法，并向外部培养基中添加示踪微珠，以观察再生不同阶段的流场变化7；然而，该方法需要逐一繁琐地成像单个细胞及其相应的流场。
通过利用细胞自身的运动作为纤毛产生流体的间接指标，即可使用与高通量筛选平台兼容的低分辨率成像系统，同时分析大量细胞。原则上，该检测方法可用于研究其他游动生物在数百微米至毫米尺度范围内的发育过程及功能再生。本方案第1节描述了多孔样品载玻片的构建方法，可实现对细胞群体长达一整天的高通量成像。文中还提供了针对其他细胞类型进行调整使用的具体细节。第2节介绍了本检测所需的视频数据采集方法，可在配备数码单反相机的解剖显微镜上完成。第3节逐步演示了如何使用MATLAB代码（补充信息）进行细胞追踪和细胞速度计算。第4节说明了如何将数值结果转化为易于解读的图表，如图1C-F和图2C所示。
方案
注意：约一百个S. coeruleus细胞按照此前发表的JoVE实验方案8进行培养。
1. 样品制备
- 剪取一块厚度为 250 µm 的硅胶间隔片（材料表），其高度和宽度均略小于载玻片。使用 5/16" 的打孔器制作圆形孔腔。注意相邻孔腔之间应留出足够的空间，以确保良好的密封性。
注意：相邻孔腔之间留出 3 mm 的间距即可。经过练习后，可在单个样品载玻片上放置十个孔腔。 - 通过将细胞在 10% 蔗糖或 2% 尿素溶液中孵育 2 分钟来启动口器（OA）的再生（图 1A）。随后用新鲜培养基洗涤三次8。轻柔地将约十个 Stentor 移入每个孔腔中。注意尽量使样品体积与孔腔容积相匹配。
注意：对于本实验所用的孔腔尺寸，每个孔腔中加入 12.5 µL 样品。 - 从一侧边缘开始，轻轻将一片盖玻片（见 Table of Materials）覆盖在孔腔上方以封闭孔腔。使用窄而略具柔韧性的物体（如 10 µL 移液器吸头）在盖玻片与硅胶片接触处轻轻按压，以确保密封良好。
2. 可见光显微镜延时成像
- 将样品放置在显微镜载物台上，将放大倍数设置为最低可用倍数，使得一个孔在视野中完整可见。
注意：本实验方案中使用的显微镜配置为1.6倍相机适配器和物镜1倍放大。 - 开始延时成像。在每个时间点，以每秒30帧的速度对每个孔采集一段10秒的视频。如果使用配备电动X-Y载物台的显微镜系统，可自动完成整个延时成像过程；否则，需确保在每个时间点有操作人员在场，手动移动样品以记录每个孔的图像。
注意：在不进行成像时，应避免样品持续受光照，以防加热和蒸发。样品体积较小，蒸发会导致气泡产生。 - 将视频保存为TIFF、MOV或AVI格式。
注意：这些是最常见的非专有视频文件格式。根据具体的显微镜软件，视频可能默认保存为专有格式，但之后可导出为上述格式之一。 - 使用像素到毫米的转换系数以获得物理尺度，并进行校准，或使用相机已知的像素尺寸进行换算。校准时，在与视频相同的放大倍数设置下，获取校准片或清晰刻度尺的图像。使用任意图像查看软件，测量已知物理距离标记之间的像素数量。
注意：例如，若尺子图像中1 mm和2 mm标记之间相隔100个像素，则转换系数为每100像素对应1 mm。或者，若从相机像素尺寸推导该系数，只需将相机像素尺寸乘以放大倍数。例如，若所用相机的像素尺寸为3.45 µm，使用的放大倍数为1.6倍，则转换系数为3.45 µm × 1.6 = 每1像素对应5.52 µm。
3. 细胞示踪
- 下载这两个脚本， TrackCells.m 和 CleanTraces.m，保存到计算机上易于记忆的位置。如果数据视频尚未在此计算机上，请将其传输至该计算机。
注意：数据视频和脚本无需存放在同一文件夹中。 - 将数据视频按时间点分别整理到不同的文件夹中。使用该脚本 TrackCells.m 首先在数据视频中执行自动细胞追踪。Open TrackCells.m 运行脚本。
- 选择 添加到路径 如果弹出窗口提示，请进行相应操作，这种情况通常仅在从特定文件夹首次运行脚本时出现。当出现提示时， 选择一个或多个数据视频以启动追踪，导航至数据视频（第2节）。通过使用 按住 Shift 键单击，按住 Ctrl 键单击，或通过按住 鼠标左键 在移动文件以将其高亮时。
- 一旦对文件列表感到满意后 文件名： 提示窗口底部的方框，单击 打开首先对一个视频进行测试运行，以确认所有参数均已正确设置（详见下文讨论）。
注意：此脚本将为每个选定的视频文件创建一个文件夹。随后，它会将视频的每一帧以 .jpg 文件形式写入该文件夹，并生成一个名为 position_estimates.mat，其中包含视频中发现的所有轨迹。根据视频的大小、数量以及计算机的速度，此脚本可能需要数小时才能运行完成。
4. 痕迹验证
- 通过检查是否在继续操作前无错误提示，确认第3节中描述的步骤已正确执行。使用 CleanTraces.m 脚本手动剔除异常或错误的轨迹。通过双击文件，在 MATLAB 编辑器 窗口中打开 CleanTraces.m。
- 当提示 选择由 TrackCells.m 输出的数据文件夹。该文件夹将与视频文件同名 时，导航至第3节所述创建的文件夹之一。仅选择一个文件夹。
注意：此脚本现在将在弹出窗口中逐个显示轨迹。轨迹将叠加在轨迹起始位置的视频帧上（以绿色显示）以及轨迹结束位置的视频帧上（以品红色显示）。因此，有效轨迹应连接一个绿色细胞和一个品红色细胞。 - 当提示时，输入 1 以保留轨迹，输入 0 以拒绝轨迹。按 Enter 键进入下一个轨迹。
注意：新轨迹将持续显示，直到无更多轨迹可显示，或已显示前六十个轨迹为止。此过程完成后，脚本将自动创建一个名为 CLEAN TRACES 的文件夹以保存输出结果，并将所有剩余轨迹叠加显示在视频的第一帧上（图1B）。该图像将自动保存为 LabeledTraces.png 以供后续参考。用户选择保留的所有轨迹将保存在文件 clean_traces.mat 中。 - 在继续下一步之前，需先完成同一时间点下所有视频的此步骤。
注意：本论文中的数据在每个时间点的每个孔中采集了一段视频，每个时间点共十段视频。
5. 数据可视化
注意：为了在不同时间点直观比较整个细胞群体的运动能力，将第4部分中的所有轨迹平移至原点开始，并为每个时间点创建一个径向位移随时间变化的图（图1C-F，所有时间点的完整数据见补充图S1）。
- 首先下载名为 SpaghettiPlots.m 的脚本。打开并运行该脚本。当弹出文件浏览器窗口，提示 选择包含孔数据（clean_traces.mat）以绘图的时间文件夹 时，导航至其中一个时间点的文件夹。请注意，该文件夹内应包含每个已分析视频对应的子文件夹。
- 当提示 校准：每毫米对应的像素数是多少？ 时，输入步骤 2.4 中获得的校准值，然后按 Enter 键。
注意：脚本现在会将该时间点所有已分析视频的轨迹合并为单个图表（图 1C-F）。图中浅色虚线圆圈表示径向位移分别为 1、2、3 和 4 mm。 - 如有需要，通过修改脚本的第 55 行来调整图表坐标轴范围，该行默认设置为 rr = 4，表示包含最大 4 mm 的半径。保存图表。
结果
本实验的目的是量化大量（N ~100）再生Stentor细胞群体中运动模式的渐进变化以及运动速度的阶段性增加。为了便于结果解读，本方案中包含的自定义代码会生成两类图表：一是视频数据集中所有细胞运动轨迹的叠加图（图1C-F 和 图S1），二是自再生开始后按小时绘制的游泳速度图（图2C）。正常再生的Stentor群体应表现出从无方向性游动到定向游动的稳定过渡（图1G）。尽管每个细胞在约8小时的OA再生过程中都会完整经历这一转变，但个体间的差异使得必须综合观察大量细胞群体的运动，才能清晰揭示整体趋势。
图1C-F展示了同一群体的Stentor细胞在OA再生过程开始后2、3、7和8小时的集体运动情况。这些图谱显示了运动个体数量（可见轨迹数）的预期增加，以及群体中最活跃细胞的运动范围（径向位移）增加了四倍。需要注意的是，图1C-F中各子图的坐标轴范围不同，分别为1 mm（第2小时）、2 mm（第3和第7小时）和4 mm（第8小时），以最适宜地展示细胞运动情况。在最早的时间点（2小时），没有任何细胞在10秒视频中移动超过1 mm；而在9小时时，许多细胞在相同时间内移动距离超过5 mm。补充图S1提供了整个延时过程的对应图谱，所有图谱采用相同的坐标轴，以便更清晰地展示成功实验中细胞运动能力的预期增强趋势。
对该系列图示的解读存在一个注意事项。游动速度最快的细胞能够在视频记录期间游过整个孔洞，特别是当它们（偶然）起始位置靠近边缘时；因此，这些细胞无法完全沿直线游动，其运动范围以这种方式可视化时会显得较小。尽管这会使对细胞移动距离的定量分析变得复杂，但并不改变一个定性趋势，即运动范围在至少8小时内逐渐增大。这与已知的形态学再生时间线一致（图2A）3。
为了汇总群体统计信息，将被追踪的细胞分为三类：无运动性且无可见附着器的细胞、无运动性但有可见附着器的细胞，以及具有运动性的细胞。这些行为类别先前由Tartar定义，但其随时间推移的出现频率从未被量化3。图2B展示了一个堆叠直方图，总结了再生过程中各时间点（以小时计）不同类别细胞的相对数量。在所有时间点，超过一半的细胞群体均未表现出可观察到的运动性。此外，在后期时间点，大量细胞出现在具有可见附着器的群体中，这强烈表明它们曾探索过周围环境，并优先选择靠近同类的位置进行附着。这一点可在图2C最后一个插图中看到实例。
该实验可对运动恢复各阶段的游动速度进行统计学比较。图2C所示数据的均值与标准差总结如下（表1）。一旦通过细胞追踪获取这些统计量，即可利用非配对t检验严格比较不同阶段细胞群体所表现出的运动特征。以所示数据为例，Phase 1与Phase 2游动速度比较的t统计量计算公式如下：
其中 x1 和 x2 分别表示第1阶段和第2阶段的平均速度； s1 和 s2 分别表示第1阶段和第2阶段速度的标准差； n1 和 n2 分别表示在第1阶段和第2阶段中提取的轨迹数量。最终得到的 t统计量 t12 随后可转换为用于假设检验的 p 值。对于图中所示数据 图 2C，从1期到2期的转变（p < 0.1%）以及从第2阶段到第3阶段（p < 0.1%）具有统计学意义，而从第3阶段到第4阶段的转变（p > 20%)则不是。需要注意的是，在第4阶段细胞倾向于聚集成小菌落的现象图2B，如原始视频中所示，仅通过游泳速度的测量难以充分反映此类行为差异。这解释了在第4阶段测得的较大标准差（0.26 mm/s），进而导致了较低的结果 t-统计量，用于与第3阶段进行比较。
图1：细胞追踪显示定向游动能力的逐步恢复。（A）蔗糖冲击诱导Stentor coeruleus脱落膜带结构。（B）在10秒视频中对再生细胞进行追踪的示例结果，带条纹的圆圈表示孔中的气泡。（C–F）分别在2小时、3小时、7小时和8小时所有轨迹的叠加图。数据整理时时间已四舍五入至最接近的整点。虚线圆圈表示一毫米的径向位移。（G）细胞运动性从以短环形轨迹为特征的无方向性游动，逐渐演变为以长正弦形轨迹为特征的定向游动。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：运动亚群在口器再生过程中表现出四种不同的行为阶段。 （A）Stentor 再生的形态学特征。（B）各时间点细胞的归一化计数：（蓝色）不运动且无可见固着器；（橙色）不运动但有可见固着器；（绿色）运动细胞。本图整合了覆盖不同小时子集的多个数据集，因此每小时的总细胞数从57到超过376不等。图例展示了在伪彩成像下（品红和绿色）每类别的代表性细胞。（C）游动速度的箱线图；每个时间点的箱体范围从第一四分位数（Q1）到第三四分位数（Q3），中位数以绿色表示。散点覆盖图显示每个运动细胞的平均速度。插图展示了四个阶段中每个阶段的代表性群体行为。缩写：OA = 口器；Q1 = 第一四分位数；Q3 = 第三四分位数。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：运动性分析作为一种表型筛选工具需要大量细胞。（A, B）来自两个孔在12小时的追踪结果。（C, D）相同两个孔在18小时的追踪结果。Stentor 细胞倾向于成簇附着，某些孔比其他孔早数小时形成集落。条纹区域表示孔中的气泡。请点击此处查看该图的放大版本。
| 平均值（mm/s） | 标准差（mm/s） | |
| 第1阶段 | 0.14 | 0.24 |
| 第2阶段 | 0.06 | 0.13 |
| 第3阶段 | 0.16 | 0.16 |
| 第4阶段 | 0.15 | 0.26 |
表1：运动性恢复各阶段游泳速度的比较。
补充图 S1：种群在再生过程中及之后的游动模式。 (A-M运动 Stentor coeruleus 分别在口器再生启动后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、16和18小时 请点击此处下载此文件。
补充视频 1-3：用于脚本调试的 S. coeruleus 显微成像示例视频。 可使用这三个数据视频进行方案第5节的操作，以快速确认脚本是否正确运行。此外，这些视频为数据视频的对比度和分辨率要求提供了具体示例。请点击此处下载该文件。
补充文件： 请点击此处下载此文件。
讨论
目前存在许多粒子和细胞追踪算法，其中一些完全免费。成本与用户友好性之间往往需要权衡取舍。此外，现有的多数细胞追踪程序主要用于追踪组织培养细胞的缓慢爬行运动，而非Stentor在游动时伴随旋转的快速运动行为，后者还可能发生突然的方向改变。在测试了多种现有方案后，本文所呈现的实验流程旨在提供一种一站式解决方案，仅需低成本设备和单一科学软件包（材料表），即可实现从数据采集到数据可视化的完整过程。对于以教学为主的科研实验室或生物物理学教学实验室而言，该方法尤其具有吸引力，因为在这些实验室中大多数所需设备通常已具备，从而降低了学生自主提出科学问题并在短时间内获得定量结果的门槛。
本文所述方法可被调整用于定量表征尺寸在数百微米至毫米量级的生物群体的运动能力。若应用于更小或更大的生物，则需要改变视频数据的采集方式。本方案应用于此处的蓝喇叭虫（S. coeruleus）再生群体时，获得了细胞群体运动功能恢复的时间线，这补充了目前关于转录时间进程的认知。例如，RNA测序结果表明，编码纤毛运动蛋白的基因合成直到再生过程开始数小时后才启动，远晚于纤毛结构本身的形成9, 10。本研究中观察到的0–3小时（第一阶段）到第4小时（第二阶段）运动能力的显著下降，与纤毛运动相关因子的表达滞后于纤毛组装相关基因的表达这一现象一致。迄今为止，尚无转录组学研究对喇叭虫（Stentor）再生过程超过9小时后的基因组活动进行报道，因此对该阶段的基因组活性了解甚少。第8–10小时（第三阶段）与第11小时及以上（第四阶段）之间无统计学显著差异，表明此时细胞已完成完全再生，且9小时后应极少有与细胞运动相关的基因发生差异调控。
该方法的两个主要局限性在于其无法追踪成簇和/或相互接触的细胞，以及无法量化比游动速度或轨迹更复杂的运动特征。所有粒子/细胞追踪算法在追踪被另一个细胞暂时遮挡的细胞时均存在困难，当多个细胞在多个连续帧中处于紧密相邻状态时尤其如此；此处提供的脚本也不例外。幸运的是，通过限制单个孔中放置的细胞数量（如下一段所述），可有效降低前一种情况的发生频率。针对本研究中所考察的 S. coeruleus 种群，其倾向于在菌落中定居（图3），导致部分细胞未能被脚本识别。然而，由于这些细胞几乎不运动或完全静止，因此对运动细胞群体的统计结果不受影响。此外，包含多个细胞难以追踪的视频易于识别，并可手动排除在后续分析之外。关于复杂运动特征的量化问题，补充图S1 中所示的从无方向性游动向定向游动的转变，提示方向的时间相关性、平均加速度以及其他潜在可测量参数可能发生了定量变化。而本方案中仅分析了速度和运动范围这两个参数，它们仅代表运动特征的一小部分。
最后，该实验方案中有几个部分在实际应用中尤为重要或具有关键影响。按照方案第1节所述，使用薄硅胶片组装多孔样品载玻片需要一定的练习。在用盖玻片密封样品时，很容易导致至少一个孔中出现泄漏或气泡。可以将样品分装到多个样品载玻片上，从而使用更小的盖玻片，使操作更简便（并降低出错成本）。尽管本实验方案可用于表征细胞群体在单一时间点的运动模式，但本文中将其作为工具，用于比较同一细胞群体在长时间延时成像（超过10小时）过程中的运动模式。与所有长时间延时成像实验一样，湿样品的蒸发不可避免。通过确保硅胶间隔层在成像室中与载玻片和盖玻片之间形成严密密封，可尽量减少蒸发。若未做到这一点，会导致孔之间发生泄漏或孔内产生气泡。对于不熟悉使用硅胶间隔层的研究人员，建议在使用前向每个孔中加入巴氏灭菌的泉水或其他洁净培养基，以检测是否存在泄漏。样品孔的各项尺寸均针对大小约为1 mm的S. coeruleus优化设计，包括硅胶间隔层厚度（用于将待研究的S. coeruleus细胞限制在二维平面内）、5/16"直径以及每孔10个细胞。在将本方案用于其他细胞类型时，这些参数应相应调整。
实验中的多个参数 TrackCells.m 脚本可进行调整以优化自动细胞识别和轨迹验证。相关参数 最小细胞面积 和 最大细胞面积 （脚本第15和16行）允许用户设定细胞大小的可接受范围，单位为平方像素。最佳取值取决于实验的多个细节，包括细胞大小、相机像素尺寸、放大倍数，以及是否存在可能被误识别为细胞的物体（例如气泡）。默认值300和1500针对本方案中提供的精确设备和设置进行了优化。此后 最小细胞面积 和 最大细胞面积 已优化，调整参数 阈值 （第17行）调整图像对比度。若设置不当，细胞轮廓将无法被准确识别或完全遗漏，从而影响正确的追踪。如果未设置任何数值 阈值 适用于准确追踪时效果良好，可尝试使用对比度更高或更清晰对焦的视频。脚本第218行 bad_trks = find(strk_trks > 20); 负责丢弃那些多次偏离预测运动（通过卡尔曼滤波器）的轨迹。当前脚本中，该阈值设定为 太多 设定为 20. 将此整数值尽可能减小至1，以更激进地剔除轨迹；增大该值则可降低剔除的强度。大部分 TrackCells.m 改编自可在 http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html 免费获取的多目标跟踪教程，读者可参考该教程以获得更详细的说明。 补充视频 1-3 是用于脚本试运行的示例数据视频。
S. coeruleus 完全再生丢失的口器（OA）的能力早在一个多世纪前就已被观察到，但关于运动能力及行为状态恢复的许多问题仍未解决。本文介绍的方案旨在阐明作者所采用的明场成像、自动细胞识别与追踪以及数据可视化方法的组合，以对一群正在再生的Stentor的运动性进行定量表征。该工作流程可广泛适用于运动性研究，所附脚本和方案可轻松应用于其他大小和运动速度相似的生物系统，例如其他纤毛虫如Paramecium和Blepharisma。此外，通过更换成像腔（例如，使用干燥小室或不同尺寸的小室并结合不同的成像放大倍数），可显著拓展该工作流程的适用范围。目前针对Stentor的工具包包括手术解剖、渗透冲击、RNA干扰（RNAi）、DNA/RNA分析以及小分子抑制剂6。本文所呈现的高通量运动性量化方法提供了一种互补的表征手段，将在未来的研究中用于探究运动表型。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了海洋生物学实验室惠特曼早期职业奖学金（JYS）的支持。我们感谢Evan Burns、Mit Patel、Melanie Melo和Skylar Widman在部分初步分析和代码测试中提供的帮助。我们感谢Mark Slabodnick提出的讨论和建议。WFM感谢美国国立卫生研究院（NIH）资助R35 GM130327提供的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25 mm厚硅胶片 | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 × 50 mm，#1.5 盖玻片 | Fisher Scientific | NC1034527 | 如讨论部分所述，若在一张载玻片上放置较少样品孔，可使用更小的盖玻片。 |
| CCD相机 | 我们使用了Nikon D750 | ||
| 衣藻137c野生型菌株 | 衣藻资源中心 | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB图像处理工具箱 | MATHWORKS | 运行TrackCells.m和CleanTraces.m所必需 |
参考文献
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重印与许可
