运动模式分析 喇叭虫 使用细胞追踪技术观察口器再生过程中及再生后的变化

摘要

我们介绍了一种利用明场显微镜和细胞追踪技术对数百个微米至毫米级细胞群体的运动性和行为进行表征的实验方案。该检测方法揭示了Stentor coeruleus在再生缺失的口器结构过程中会经历四个行为上截然不同的阶段。

摘要

Stentor coeruleus 是一种研究单细胞再生的著名模式生物。对单个细胞进行转录组分析揭示了数百个基因—许多与口器装置（OA）无关的基因在再生过程的不同阶段受到差异调控。据此推测，这种系统性的重组以及细胞资源向新OA生长的动员，将导致运动和行为发生可观测的变化，且这些变化在时间上与差异基因表达的各个阶段相对应。然而，其形态复杂性 S. coeruleus 需要开发一种检测方法来捕捉其统计特征和时间尺度。使用自定义脚本对短时视频中的细胞进行追踪，并在大样本群体（N ~100）上汇总统计结果。在OA缺失后， S. coeruleus 最初失去定向运动能力；随后从约4小时开始，运动速度显著下降，直至约8小时。该检测方法为运动表型的筛选提供了有用的工具，并可适用于其他生物体的研究。

引言

Stentor coeruleus（Stentor）是一种著名的模式生物，因其体型较大、能够耐受多种显微外科技术操作，并且易于在实验室条件下培养，已被广泛用于单细胞再生研究^1,2,3。早期的再生研究主要聚焦于Stentor中最显著且形态最独特的结构——口器（OA），该结构在化学刺激下会完全脱落^4,5,6。从头再生缺失的口器始于新的膜带结构的出现，即一束纤毛逐渐向前移动，并在经历八个形态学阶段后形成具有功能的口器³。无论温度如何，这些阶段均按顺序依次发生，为几乎所有相关研究提供了通用的参考标准⁵。

机制分析 喇叭虫 再生研究需要具备稳健且简便的工具来测量再生的时间进程，以便将其应用于化学或分子筛选中的多个样本。基于细胞的检测标准方法是成像，在本例中即对再生过程中新口器（OA）形成的成像。然而，这类基于成像的检测方法仅在再生结构包含可作为标记物的独特分子组分时最为有效，从而能够在荧光图像中被清晰识别。对于 喇叭虫 OA中已知的组分（纤毛、基体）也存在于细胞表面的其他区域；因此，仅通过检测某一组分的存在或缺失无法判断OA是否恢复。

相反，检测口器（OA）可能需要某种形式的形态识别，而鉴于Stentor细胞常通过快速收缩过程改变其形状，这可能极具挑战性。本文介绍了一种依赖于体部和口器纤毛运动活性的再生替代检测方法。随着口器的再生，新形成的纤毛在位置和活性上会发生可重复的变化，进而影响细胞的游动能力。通过分析游动行为，可以对"功能性再生"进行定量检测，即通过量化再生结构的功能来评估再生程度。以往对Stentor再生过程中纤毛功能的研究采用粒子图像测速法，并向外部培养基中添加示踪微珠，以观察再生不同阶段的流场变化⁷；然而，该方法需要逐一繁琐地成像单个细胞及其相应的流场。

通过利用细胞自身的运动作为纤毛产生流体的间接指标，即可使用与高通量筛选平台兼容的低分辨率成像系统，同时分析大量细胞。原则上，该检测方法可用于研究其他游动生物在数百微米至毫米尺度范围内的发育过程及功能再生。本方案第1节描述了多孔样品载玻片的构建方法，可实现对细胞群体长达一整天的高通量成像。文中还提供了针对其他细胞类型进行调整使用的具体细节。第2节介绍了本检测所需的视频数据采集方法，可在配备数码单反相机的解剖显微镜上完成。第3节逐步演示了如何使用MATLAB代码（补充信息）进行细胞追踪和细胞速度计算。第4节说明了如何将数值结果转化为易于解读的图表，如图1C-F和图2C所示。

方案

注意：约一百个S. coeruleus细胞按照此前发表的JoVE实验方案⁸进行培养。

1. 样品制备

1. 剪取一块厚度为 250 µm 的硅胶间隔片（材料表），其高度和宽度均略小于载玻片。使用 5/16" 的打孔器制作圆形孔腔。注意相邻孔腔之间应留出足够的空间，以确保良好的密封性。
   注意：相邻孔腔之间留出 3 mm 的间距即可。经过练习后，可在单个样品载玻片上放置十个孔腔。
2. 通过将细胞在 10% 蔗糖或 2% 尿素溶液中孵育 2 分钟来启动口器（OA）的再生（图 1A）。随后用新鲜培养基洗涤三次⁸。轻柔地将约十个 Stentor 移入每个孔腔中。注意尽量使样品体积与孔腔容积相匹配。
   注意：对于本实验所用的孔腔尺寸，每个孔腔中加入 12.5 µL 样品。
3. 从一侧边缘开始，轻轻将一片盖玻片（见 Table of Materials）覆盖在孔腔上方以封闭孔腔。使用窄而略具柔韧性的物体（如 10 µL 移液器吸头）在盖玻片与硅胶片接触处轻轻按压，以确保密封良好。

2. 可见光显微镜延时成像

1. 将样品放置在显微镜载物台上，将放大倍数设置为最低可用倍数，使得一个孔在视野中完整可见。
   注意：本实验方案中使用的显微镜配置为1.6倍相机适配器和物镜1倍放大。
2. 开始延时成像。在每个时间点，以每秒30帧的速度对每个孔采集一段10秒的视频。如果使用配备电动X-Y载物台的显微镜系统，可自动完成整个延时成像过程；否则，需确保在每个时间点有操作人员在场，手动移动样品以记录每个孔的图像。
   注意：在不进行成像时，应避免样品持续受光照，以防加热和蒸发。样品体积较小，蒸发会导致气泡产生。
3. 将视频保存为TIFF、MOV或AVI格式。
   注意：这些是最常见的非专有视频文件格式。根据具体的显微镜软件，视频可能默认保存为专有格式，但之后可导出为上述格式之一。
4. 使用像素到毫米的转换系数以获得物理尺度，并进行校准，或使用相机已知的像素尺寸进行换算。校准时，在与视频相同的放大倍数设置下，获取校准片或清晰刻度尺的图像。使用任意图像查看软件，测量已知物理距离标记之间的像素数量。
   注意：例如，若尺子图像中1 mm和2 mm标记之间相隔100个像素，则转换系数为每100像素对应1 mm。或者，若从相机像素尺寸推导该系数，只需将相机像素尺寸乘以放大倍数。例如，若所用相机的像素尺寸为3.45 µm，使用的放大倍数为1.6倍，则转换系数为3.45 µm × 1.6 = 每1像素对应5.52 µm。

3. 细胞示踪

1. 下载这两个脚本， TrackCells.m 和 CleanTraces.m，保存到计算机上易于记忆的位置。如果数据视频尚未在此计算机上，请将其传输至该计算机。
   注意：数据视频和脚本无需存放在同一文件夹中。
2. 将数据视频按时间点分别整理到不同的文件夹中。使用该脚本 TrackCells.m 首先在数据视频中执行自动细胞追踪。Open TrackCells.m 运行脚本。
3. 选择 添加到路径 如果弹出窗口提示，请进行相应操作，这种情况通常仅在从特定文件夹首次运行脚本时出现。当出现提示时， 选择一个或多个数据视频以启动追踪，导航至数据视频（第2节）。通过使用 按住 Shift 键单击，按住 Ctrl 键单击，或通过按住 鼠标左键 在移动文件以将其高亮时。
4. 一旦对文件列表感到满意后 文件名： 提示窗口底部的方框，单击 打开首先对一个视频进行测试运行，以确认所有参数均已正确设置（详见下文讨论）。
   ​注意：此脚本将为每个选定的视频文件创建一个文件夹。随后，它会将视频的每一帧以 .jpg 文件形式写入该文件夹，并生成一个名为 position_estimates.mat，其中包含视频中发现的所有轨迹。根据视频的大小、数量以及计算机的速度，此脚本可能需要数小时才能运行完成。

4. 痕迹验证

1. 通过检查是否在继续操作前无错误提示，确认第3节中描述的步骤已正确执行。使用 CleanTraces.m 脚本手动剔除异常或错误的轨迹。通过双击文件，在 MATLAB 编辑器 窗口中打开 CleanTraces.m。
2. 当提示 选择由 TrackCells.m 输出的数据文件夹。该文件夹将与视频文件同名 时，导航至第3节所述创建的文件夹之一。仅选择一个文件夹。
   注意：此脚本现在将在弹出窗口中逐个显示轨迹。轨迹将叠加在轨迹起始位置的视频帧上（以绿色显示）以及轨迹结束位置的视频帧上（以品红色显示）。因此，有效轨迹应连接一个绿色细胞和一个品红色细胞。
3. 当提示时，输入 1 以保留轨迹，输入 0 以拒绝轨迹。按 Enter 键进入下一个轨迹。
   注意：新轨迹将持续显示，直到无更多轨迹可显示，或已显示前六十个轨迹为止。此过程完成后，脚本将自动创建一个名为 CLEAN TRACES 的文件夹以保存输出结果，并将所有剩余轨迹叠加显示在视频的第一帧上（图1B）。该图像将自动保存为 LabeledTraces.png 以供后续参考。用户选择保留的所有轨迹将保存在文件 clean_traces.mat 中。
4. 在继续下一步之前，需先完成同一时间点下所有视频的此步骤。
   ​注意：本论文中的数据在每个时间点的每个孔中采集了一段视频，每个时间点共十段视频。

5. 数据可视化

注意：为了在不同时间点直观比较整个细胞群体的运动能力，将第4部分中的所有轨迹平移至原点开始，并为每个时间点创建一个径向位移随时间变化的图（图1C-F，所有时间点的完整数据见补充图S1）。

1. 首先下载名为 SpaghettiPlots.m 的脚本。打开并运行该脚本。当弹出文件浏览器窗口，提示 选择包含孔数据（clean_traces.mat）以绘图的时间文件夹 时，导航至其中一个时间点的文件夹。请注意，该文件夹内应包含每个已分析视频对应的子文件夹。
2. 当提示 校准：每毫米对应的像素数是多少？ 时，输入步骤 2.4 中获得的校准值，然后按 Enter 键。
   注意：脚本现在会将该时间点所有已分析视频的轨迹合并为单个图表（图 1C-F）。图中浅色虚线圆圈表示径向位移分别为 1、2、3 和 4 mm。
3. 如有需要，通过修改脚本的第 55 行来调整图表坐标轴范围，该行默认设置为 rr = 4，表示包含最大 4 mm 的半径。保存图表。

结果

本实验的目的是量化大量（N ~100）再生Stentor细胞群体中运动模式的渐进变化以及运动速度的阶段性增加。为了便于结果解读，本方案中包含的自定义代码会生成两类图表：一是视频数据集中所有细胞运动轨迹的叠加图（图1C-F 和 图S1），二是自再生开始后按小时统计的游泳速度图（图2C）。正常进行再生的Stentor群体应表现出从无方向性游动到定向游动的稳定过渡（图1G）。尽管每个细胞在约8小时的OA再生过程中都会完整经历这一转变，但个体之间的差异使得必须综合观察大量细胞群体的运动，才能清晰揭示整体趋势。

图1C-F展示了同一群体的Sten...

讨论

目前存在许多粒子和细胞追踪算法，其中一些完全免费。成本与用户友好性之间往往需要权衡取舍。此外，现有的多数细胞追踪程序主要用于追踪组织培养细胞的缓慢爬行运动，而非Stentor在游动时伴随旋转的快速运动行为，后者还可能发生突然的方向改变。在测试了多种现有方案后，本文所呈现的实验流程旨在提供一种一站式解决方案，仅需低成本设备和单一科学软件包（材料表），即可实现从数据采集到数据可视化的完整过程。对于以教学为主的科研实验室或生物物理学教学实验室而言，该方法尤其具有吸引力，因为在这些实验室中大多数所需设备通常已具备，从而降低了学生自主提出科学问题并在短时间内获得定量结果的门槛。

本文所述方法可被调整用于定量表征尺寸在数百微米至毫米量级的生物群体的运动能力。若应用于更小或更大的生物，则需要改变视频数据的采集方式。本方案应用于此处的蓝喇叭虫（S. coeruleus）再生群体时，获得了细胞群体运动功能恢复的时间线，这补充了目前关于转录时间进程的认知。例如，RNA测序结果表明，编码纤毛运动蛋白的基因合成直到再生过程开始数小时后才...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25 mm厚硅胶片	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 × 50 mm，#1.5 盖玻片	Fisher Scientific	NC1034527	如讨论部分所述，若在一张载玻片上放置较少样品孔，可使用更小的盖玻片。
CCD相机			我们使用了Nikon D750
衣藻137c野生型菌株	衣藻资源中心	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB图像处理工具箱	MATHWORKS		运行TrackCells.m和CleanTraces.m所必需