方法文章

一种基于磁珠的蚊虫DNA提取方案及其在下一代测序中的应用

DOI：

10.3791/62354

⸱

2021年4月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Florida Medical Entomology Laboratory, Department of Entomology and Nematology, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, 2U. S. Fish and Wildlife Service, Pacific Islands Fish and Wildlife Office, 3Department of Entomology and Nematology, University of California Davis

本文内容

摘要

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本文介绍了一种利用磁珠提取蚊虫DNA的方案，可获得高质量的DNA提取物。这些提取物适用于后续的高通量测序分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

最近发表的一种使用磁珠和自动化DNA提取仪器的DNA提取方案表明，可以从保存良好的单只蚊虫中提取出高质量和高产量的DNA，足以用于后续的全基因组测序。然而，依赖昂贵的自动化DNA提取仪器对于许多实验室而言可能难以承受。本研究提供了一种经济实惠的基于磁珠的DNA提取方案，适用于低至中等通量的样本处理。该方案已使用单只埃及伊蚊（Aedes aegypti）蚊虫样本成功验证。降低高质量DNA提取的成本将有助于在资源有限的实验室和研究中更广泛地应用高通量测序技术。

引言

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近期改进的DNA提取方案1的发展使得许多高影响力的下游研究成为可能，这些研究涉及全基因组测序2,3,4,5,6。这种基于磁珠的DNA提取方案可从单个蚊虫样本中稳定获得DNA，从而减少了从野外采集样本中获取足够数量样本所需的成本和时间。

群体基因组学和景观基因组学的最新进展与全基因组测序成本的降低直接相关。尽管先前的DNA提取方案1提高了高通量测序的效率，但缺乏资金的小型实验室或研究项目可能因实施该方案的成本（例如，专用仪器的费用）而无法使用这些强大的景观和群体基因组学工具。

本文介绍了一种改良的DNA提取方案，该方案采用与Neiman等人1相似的磁珠提取步骤以获得高纯度DNA，但无需依赖高成本仪器进行组织裂解和DNA提取。本方案适用于需要>10 ng高质量DNA的实验。

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方案

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1. DNA 提取前的样品常规储存与制备

  1. 如果样本保存在 >70% 酒精中，需在 4 °C 条件下用 100 µL PCR 级水水化 1 小时（或过夜），以软化组织。

2. 样品破碎

  1. 将培养箱或振荡加热块设置为 56 °C。
  2. 配制蛋白酶 K（PK）缓冲液/酶混合液。每个蚊虫样本提取需使用 2 µL 蛋白酶 K（100 mg/mL）和 98 µL 蛋白酶 K 缓冲液（共 100 µL）。若为多个样本配制总混合液，应将总体积（所有样本合计）增加约 15%，以确保足量供应。
  3. 若样本在提取前已进行水化处理，需弃去各样本管中的水分。
  4. 在含有蚊虫组织的 1.5 mL 微量离心管中，加入 100 µL PK 缓冲液/酶混合液。
  5. 使用微量离心管研杵匀浆组织。
  6. 在室温下以 9,600 × g 离心样品 1 分钟。
  7. 在 56 °C 下孵育样品 2–3 小时。
  8. 孵育期间，使用 DNA 提取步骤（步骤 3）准备其他试剂。

3. DNA 提取

  1. 配制磁珠主混合液。每个样本加入100 µL裂解缓冲液、100 µL异丙醇和15 µL磁珠（总计215 µL）。若需为多个反应配制主混合液，总量应增加约20%（所有样本总量之和），以确保体积充足。
  2. 孵育时间结束后（步骤2.7），用移液器将每个裂解液转移至洁净的微量离心管或微孔板孔中。
  3. 向每个样本中加入100 µL裂解液和215 µL磁珠主混合液。
  4. 用移液器充分混匀10–20秒，室温静置10分钟。期间可轻轻振荡管子，以最大限度促进磁珠与DNA的结合。
  5. 将管子或微孔板置于磁珠分离器上，静置至溶液澄清。
  6. 用移液器弃去管或板中的液体。去除上清液时，尽量避免接触或扰动吸附有DNA的磁珠。
  7. 将管或板从磁珠分离器上取下，向每个孔中加入325 µL洗涤缓冲液1。
  8. 通过移液充分混匀，并在室温下孵育1分钟。
  9. 重复步骤3.5–3.6。
  10. 将管或板从磁珠分离器上取下，向每个孔中加入250 µL洗涤缓冲液1。
  11. 通过移液充分混匀，并在室温下孵育1分钟。
  12. 重复步骤3.5–3.6。
  13. 将管或板从磁珠分离器上取下，向每个样本中加入250 µL洗涤缓冲液2。
  14. 充分混匀，并在室温下孵育1分钟。
  15. 重复步骤3.5–3.6。
  16. 将管或板从磁珠分离器上取下，向每个孔中加入250 µL洗涤缓冲液2。
  17. 充分混匀，并在室温下孵育1分钟。
  18. 重复步骤3.5–3.6。
  19. 将管或板从磁珠分离器上取下，向每个孔中加入100 µL洗脱缓冲液。
  20. 充分混匀，并在室温下孵育2分钟。
  21. 将管或板放回磁珠分离器上，静置至溶液澄清。
  22. 用移液器将上清液转移至新的洁净0.5 mL微量离心管或微孔板孔中。
  23. 将DNA样本储存于4 °C（最多1周）或-80 °C。 若使用微孔板，需用封口膜密封。
  24. 采用合适的方法测定DNA得率。
    注：本研究中使用了DNA荧光计读数及260/280 nm处的吸光度检测。

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结果

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使用荧光计测量，每只蚊虫头胸部组织的平均DNA产量为4.121 ng/µL（N = 92，标准差3.513），洗脱体积为100 µL洗脱缓冲液。该产量足以满足全基因组文库构建所需的10–30 ng基因组DNA投入量1,7。DNA产量可能因蚊虫体型大小和保存条件不同而在0.3–29.7 ng/µL之间变化。部分高变异性源于本研究中所用磁珠的特性。如先前报道所述1，不同品牌的磁珠可能产生更一致的浓度。还应注意，不同蚊种在体型上存在差异，DNA产量与个体及物种的体型范围相关。若DNA浓度低于正常范围，可调整蛋白酶K反应的孵育时间（步骤2.7），但延长后总孵育时间不应超过16小时。此外，更换蛋白酶K和/或裂解缓冲液的品牌可能对DNA产量产生显著影响1。

最终DNA在含有0.5 mM EDTA的洗脱缓冲液中的典型微量荧光仪读数如图1

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讨论

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本文所述方案可适用于其他昆虫物种。Nieman 等人1首次提出的原始方案已在多个物种中进行过测试，包括 Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta 和 Keiferia lycopersicella2,8,9,

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢以下机构提供的经费支持：美国疾病控制与预防中心（CDC）资助的太平洋西南区域媒介传播疾病卓越中心（合作协议编号 1U01CK000516）、CDC 拨款 NU50CK000420-04-04、美国农业部国家食品与农业研究所（Hatch 项目 1025565）、佛罗里达大学/IFAS 佛罗里达医学昆虫学实验室授予陈哲宇（Tse-Yu Chen）的奖学金、美国国家科学基金会 CAMTech IUCRC 第二阶段拨款（AWD05009_MOD0030），以及佛罗里达州卫生部（合同编号 CODQJ）。本文作者的观点和结论并不代表美国鱼类及野生动物管理局的观点或立场。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AE 缓冲液Qiagen19077洗脱缓冲液
AL 缓冲液Qiagen19075裂解缓冲液
AW1 缓冲液Qiagen19081洗涤缓冲液 1
AW2 缓冲液Qiagen19072洗涤缓冲液 2
MagAttract Suspension GQiagen1026901磁珠
磁珠分离器EpigentekQ10002-1
NanodropThermoFisherND-2000微量分光光度计
PK 缓冲液ThermoFisher4489111蛋白酶 K 缓冲液
蛋白酶 KThermoFisherA25561
QubitInvitrogenQ33238荧光计

参考文献

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  1. Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314(2015).
  2. Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204(2019).
  3. Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425(2020).
  4. Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473(2019).
  5. Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
  6. Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303(2016).
  7. Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211(2016).
  8. Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
  9. Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
  10. Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
  11. Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).

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DNA K

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