方法文章

µTongue：一种基于微流控技术的舌部功能成像平台 在体 内

DOI：

10.3791/62361

⸱

2021年4月22日

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1Department of Biomedical Engineering, Sungkyunkwan University, 2Center for Neuroscience Imaging Research, Institute for Basic Science, 3School of Biological Sciences, Seoul National University

本文内容

摘要

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本文介绍了一种用于味觉功能细胞成像的 µTongue（舌上微流控）装置 体内 通过将微流控技术整合到舌部的活体成像窗口中。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

活体荧光显微技术是一种广泛用于研究活体动物中多细胞动态的工具。然而，该技术尚未成功应用于味觉感受器官。通过将微流控技术整合到活体舌部成像窗口中，µTongue 能够提供味觉细胞可靠的生理功能图像 体内 在多种味觉物质受控暴露条件下进行检测。本文详细介绍了使用µTongue系统的分步操作流程，共包含五个部分：味觉物质溶液的制备、微流控模块的设置、样品装载、功能成像数据的采集以及数据分析。同时提供了若干提示与技术方法，以解决使用µTongue系统过程中可能遇到的实际问题。

引言

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活体荧光显微镜被广泛用于研究活体组织中的时空动态。研究人员正在快速开发基因编码的传感器，这些传感器能够将生物过程特异性且灵敏地转化为荧光信号——这些信号可利用广泛可用的荧光显微镜轻松记录1,2。尽管已使用该显微镜对啮齿类动物的大多数内脏器官进行了研究，但其在舌部的成功应用尚未实现3。

先前对味觉细胞进行钙成像的研究是通过将舌组织切成薄片以获取轮廓乳头味蕾4,5,6，或通过剥离味觉上皮以获取菌状乳头味蕾7,8，在体外（ex vivo）条件下完成的。这些样本的制备不可避免地具有侵入性，因而严重干扰了神经支配、通透性屏障和血液循环等天然微环境。2015年，Choi 等人首次报道了活体舌成像窗口技术，但由于液体味觉刺激物引起的运动和光学伪影，尚无法实现可靠的神经功能记录9。

最近，微流控舌片（µTongue）被提出

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方案

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所有外科手术均经成均馆大学和首尔国立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. 溶液制备：人工唾液和味感物质

  1. 通过将 2 mM NaCl、5 mM KCl、3 mM NaHCO3、3 mM KHCO3、0.25 mM CaCl2、0.25 mM MgCl2、0.12 mM K2HPO4、0.12 mM KH2PO4 和 1.8 mM HCl 溶解于蒸馏水（>1 L）中来制备人工唾液，并将溶液 pH 调整至 7（见材料表）12。
  2. 制备味觉刺激物，例如：酸味：10 mM 柠檬酸；咸味：400 mM NaCl，可选添加 50 µM 阿米洛利；甜味：40 mM 安赛蜜钾；苦味：5 mM 奎宁、5 mM 苯甲地那铵和 20 µM 环己酰亚胺的混合物，将上述呈味化学物质溶解于步骤 1.1 制备的人工唾液中。

2. 微流控系统的准备

注意：味觉刺激物通过加压多通道流体递送系统递送至小鼠舌面（参见图1

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结果

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采用 Pirt-GCaMP6f-tdTomato 小鼠获取味蕾图像。小鼠舌表面覆盖有自发荧光的丝状乳头。味蕾在舌表面上稀疏分布（图4A）。通过三种不同的滤光片检测器获取了味蕾及其结构的图像。使用 607/70 nm 滤光片组，获得味觉细胞中 tdTomato 的信号，用于比率分析（图4B）。使用 525/50 nm 滤光片组，获得味觉细胞以及环绕味蕾的血管中的 GCaMP 信号（图4B）。使用 447/60 nm 滤光片组，获得为味蕾提供结构支撑的胶原结缔组织图像（图4B）。

在获取味蕾及相关结构的图像后， 体内 使用该方案进行钙成像。采用 Pirt-GCaMP6f-tdTomato 小鼠对味觉细胞进行筛选（图 5A)16.......

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讨论

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本文介绍了一种应用µTongue技术研究味觉细胞功能活性的详细实验方案 体内本方案中，使用基因编码的钙指示剂对味觉细胞进行功能成像。除使用转基因小鼠外，还可通过电穿孔法将钙染料（或电压感应染料）导入味觉细胞，作为替代方案。

本实验中使用的所有味觉溶液的折射率均低于1.336。尽管µTongue能够提供稳定的流体输送，且比率分析可改善成像伪影，但研究人员若使用更高浓度的呈味物质（例如，折射率为1.338的>100 mM蔗糖溶液）仍会面临挑战。人工唾液与味觉溶液之间较大的折射率差异会导致图像焦平面偏移超出后期图像处理的补偿范围。根据经验，已确定允许实时稳定细胞成像的味觉溶液折射率范围（低于1.336）。

对于具有荧光成像和动物操作经验的研究人员而言，通过反复练习可较快掌握本方案。然而，其中包含若干关键步骤，若处理不当常会影响数据的成功获取。首先，舌体一旦暴露于口腔外，应使用人工唾液保持其湿润，以维持天然的黏膜微环境。其次，味蕾周围的血液循环必须保持完整，以确保氧气、营养物质及血液携带因子的生理供应。

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披露

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作者声明存在竞争性财务利益：J. Han 和 M. Choi 是本文所述专利技术 µTongue 的发明人，且 µTongue 系统通过 SciTech Korea 公司进行商业化销售。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由基础科学研究所（IBS-R015-D1）、韩国国家研究基金会（NRF）在韩国政府（MSIT）资助下提供的项目（编号：2019M3A9E2061789）以及韩国国家研究基金会（NRF）在韩国政府（MSIT）资助下提供的项目（编号：2019M3E5D2A01058329）支持。我们感谢Eunsoo Kim和Eugene Lee提供的技术协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
安赛蜜钾Sigma Aldrich04054-25G人工唾液 / 味觉刺激物
氯化钙溶液Sigma Aldrich21115-100ML人工唾液 / 味觉刺激物
柠檬酸Sigma AldrichC0759-100G人工唾液 / 味觉刺激物
环己酰亚胺Sigma Aldrich01810-5G人工唾液 / 味觉刺激物
苯甲地那铵Sigma AldrichD5765-5G人工唾液 / 味觉刺激物
牙科胶DenkistP0000CJT-A2动物准备
Image JNIHImageJ数据分析
肌苷酸（IMP）Sigma Aldrich57510-5G人工唾液 / 味觉刺激物
瞬干胶LoctiteLoctite 4161, Henkel动物准备
K2HPO4Sigma AldrichP3786-100G人工唾液 / 味觉刺激物
KClSigma AldrichP9541-500G人工唾液 / 味觉刺激物
氯胺酮YuhanKetamine 50动物准备
KH2PO4Sigma AldrichP0662-25G人工唾液 / 味觉刺激物
KHCO3Sigma Aldrich237205-500G人工唾液 / 味觉刺激物
MATLABMathworkMATLAB数据分析
MgCl2Sigma AldrichM8266-100G人工唾液 / 味觉刺激物
甲基吡咯烷酮（MPG）Sigma Aldrich49601-100G人工唾液 / 味觉刺激物
多光子显微镜Thorlab Bergamo II显微镜
NaClSigma AldrichS3014-500G人工唾液 / 味觉刺激物
NaHCO3Sigma Aldrich792519-500G人工唾液 / 味觉刺激物
物镜NikonN16XLWD-PF显微镜
OctaflowALA Scientific InstrumentsOCTAFLOW II流体控制
PCLGLg15N54流体控制
pH计ThermoscientificORION STAR AZ11人工唾液 / 味觉刺激物
磷酸盐缓冲液Sigma Aldrich806562人工唾液 / 味觉刺激物
奎宁Sigma AldrichQ1125-5G人工唾液 / 味觉刺激物
注射泵Havard ApparatusPHD ULTRA 4400流体控制
TRITC-葡聚糖Sigma Aldrich52194-1G动物准备
超快光纤激光器TopticaFFultra920 01042显微镜
赛拉嗪Bayer KoreaRompun动物准备

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
  2. Shih, A. Y., et al.

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