µTongue：一种基于微流控技术的舌部功能成像平台 在体 内

摘要

本文介绍了一种用于味觉功能细胞成像的 µTongue（舌上微流控）装置 体内 通过将微流控技术整合到舌部的活体成像窗口中。

摘要

活体荧光显微技术是一种广泛用于研究活体动物中多细胞动态的工具。然而，该技术尚未成功应用于味觉感受器官。通过将微流控技术整合到活体舌部成像窗口中，µTongue 能够提供味觉细胞可靠的生理功能图像 体内 在多种味觉物质受控暴露条件下进行检测。本文详细介绍了使用µTongue系统的分步操作流程，共包含五个部分：味觉物质溶液的制备、微流控模块的设置、样品装载、功能成像数据的采集以及数据分析。同时提供了若干提示与技术方法，以解决使用µTongue系统过程中可能遇到的实际问题。

引言

活体荧光显微镜被广泛用于研究活体组织中的时空动态。研究人员正在快速开发基因编码的传感器，这些传感器能够将生物过程特异性且灵敏地转化为荧光信号——这些信号可利用广泛可用的荧光显微镜轻松记录^1,2。尽管已使用该显微镜对啮齿类动物的大多数内脏器官进行了研究，但其在舌部的成功应用尚未实现³。

先前对味觉细胞进行钙成像的研究是通过将舌组织切成薄片以获取轮廓乳头味蕾^4,5,⁶，或通过剥离味觉上皮以获取菌状乳头味蕾^7,8，在体外（ex vivo）条件下完成的。这些样本的制备不可避免地具有侵入性，因而严重干扰了神经支配、通透性屏障和血液循环等天然微环境。2015年，Choi 等人首次报道了活体舌成像窗口技术，但由于液体味觉刺激物引起的运动和光学伪影，尚无法实现可靠的神经功能记录⁹。

最近，微流控舌片（µTongue）被提出¹⁰该装置将微流控系统与小鼠舌头上的成像窗口集成在一起。通过在整个成像期间实现味觉刺激物的准稳态流动，可最大限度地减少流体运动带来的伪影。图1）。输入端由一系列多通道压力控制器供液，输出端连接维持0.3 mL/min流速的注射泵。此外，通过引入钙离子不敏感的荧光指示剂（tdTomato）和钙离子指示剂（GCaMP6）进行比率分析，以最大限度减少因呈味溶液折射率差异所引起的光学伪影¹¹该设计为味觉细胞提供了显微水平的稳定性 体内 即使在流体通道之间快速切换的情况下，µTongue 也能对多种呈味物质作用于小鼠味蕾的功能进行可靠筛选。 体内.

本方案详细阐述了小鼠菌状味蕾钙成像的实验操作步骤 体内 使用µTongue。首先，描述人工唾液和呈味溶液的制备方法；其次，介绍搭建微流控系统以实现准稳态流动的步骤；第三，详述将小鼠舌组织固定于µTongue上以进行成像的操作流程；最后，明确图像分析的各个步骤，包括横向运动伪影校正和比率测量。本方案可便捷地适用于任何具备小鼠饲养设施和双光子显微镜或同等设备的研究实验室。

方案

所有外科手术均经成均馆大学和首尔国立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. 溶液制备：人工唾液和味感物质

1. 通过将 2 mM NaCl、5 mM KCl、3 mM NaHCO₃、3 mM KHCO₃、0.25 mM CaCl₂、0.25 mM MgCl₂、0.12 mM K₂HPO₄、0.12 mM KH₂PO₄ 和 1.8 mM HCl 溶解于蒸馏水（>1 L）中来制备人工唾液，并将溶液 pH 调整至 7（见材料表）¹²。
2. 制备味觉刺激物，例如：酸味：10 mM 柠檬酸；咸味：400 mM NaCl，可选添加 50 µM 阿米洛利；甜味：40 mM 安赛蜜钾；苦味：5 mM 奎宁、5 mM 苯甲地那铵和 20 µM 环己酰亚胺的混合物，将上述呈味化学物质溶解于步骤 1.1 制备的人工唾液中。

2. 微流控系统的准备

注意：味觉刺激物通过加压多通道流体递送系统递送至小鼠舌面（参见图1和材料表）。

1. 向加压流动灌注系统的储液罐中加入人工唾液和味觉刺激物。
2. 将压缩空气管路连接至调压阀入口，并在流体输送系统中将气压设定在 30 至 50 psi 之间。
3. 将调压阀的输出压力设为 0.4 psi，并检查在此压力下是否有液体从管路中流出。
4. 将储液罐的多通管路连接至 µTongue 的输入端口。
5. 将 µTongue 的输出端口连接至注射泵，并以约 300 µL∙min^-1 的速率抽取液体，以建立稳态条件。观察 µTongue 下方悬滴的体积是否恒定。根据样品高度调整设定参数的数值。
6. 断开压缩空气管路并停止注射泵，直至完成操作步骤 3。

3. 小鼠制备用于 体内 成像（图2).

注意：所有动物处理均在白天于实验室工作台上的无菌条件下进行。

1. 小鼠麻醉
   1. 准备一只7周龄或更年长的任一性别的小鼠。使用在味觉细胞中表达钙感应荧光蛋白的转基因小鼠品系。
   2. 对小鼠进行固定以实施麻醉。通过腹腔注射方式向小鼠注射100 mg/kg的氯胺酮和10 mg/kg的赛拉嗪¹³。
2. 通过眶后途径将含有500 kDa TRITC-葡聚糖的2.5% W/V磷酸盐缓冲液静脉注射入小鼠体内，以便在成像过程中观察血液循环情况。
3. 将头部固定器连接至小鼠颅骨，以最大限度减少运动伪影。
   1. 将小鼠置于仰卧位，用70%乙醇喷洒其头部。用镊子轻轻提起头皮，用剪刀剪去约7 mm²的皮肤。
   2. 清理头皮周围的毛发，去除皮下骨膜，在颅骨上涂抹速干胶，并安装定制的头部固定器。
   3. 待速干胶固化后，在头部固定器周围涂抹牙科胶，并用蓝光照射使其固化。
4. 将小鼠舌头放置在µTongue的底座单元上。
   1. 使用速干胶将小鼠下唇固定在µTongue的底座单元上。
   2. 将小鼠放置在实验板上（见图1B中的小鼠准备板），并将µTongue的底座单元套入定位柱（见图1B中的µTongue固定柱）。确保底座单元边缘的孔与定位柱对齐。
   3. 将小鼠头部固定器拧紧至实验板上的固定器支架上，然后调整小鼠头部与设备之间的距离。通过固定器支架平稳地将小鼠头部旋转约45°，以避免小鼠鼻部与显微镜物镜发生物理接触。
   4. 使用塑料镊子轻轻拉出小鼠舌头，并将其腹侧固定在µTongue底座单元的上表面。随后，用湿润的棉签擦拭小鼠舌头表面。
   5. 将一小片纸浸入人工唾液中，并覆盖在暴露的小鼠舌头上，以维持湿润环境。
   6. 将弧形垫片安装在支撑µTongue底座两端的定位柱上。
5. 将准备好的小鼠放置在显微镜载物台上。将暴露的小鼠舌头置于显微镜物镜区域的大致中心位置，确保不超出载物台的动态范围。然后，用螺丝将小鼠实验板牢固固定在载物台上。
6. 在小鼠身体下方放置加热垫，并将温度维持在36.5 °C–37.5 °C之间。使用温度传感器监测小鼠体温，并根据传感器的反馈信号调节加热垫的温度。
7. 将一小条纸卷成细条状，置于小鼠口部，以防止液体进入气管。
8. 从小鼠舌头上移除湿润组织，将准备好的µTongue放置在舌头上。将微流控通道置于舌头表面，并调整其位置，以便通过成像窗口观察舌面。
9. 通过在两端轻轻拧紧螺丝，以最小的压缩压力固定µTongue。

4. 成像采集

1. 提前开启920 nm双光子激光器和显微镜。
2. 将水浸物镜（16倍，数值孔径0.80 或 25倍，数值孔径1.1）安装到显微镜上。在µTongue的成像窗口滴加蒸馏水，并将物镜浸入其中。
3. 在相机模式下，打开汞灯光源并照射舌面。
4. 通过调节Z轴，寻找丝状乳头的自发荧光信号，以确定大致的焦平面。然后，使用X轴和Y轴调节旋钮定位一个味蕾。
5. 切换至多光子模式。设置图像采集条件如下：激发波长：920 nm；发射滤光片设置：447/60 nm、525/50 nm 和 607/70 nm；双向光栅扫描模式，帧尺寸：512 × 512。
6. 调整 X 和 Y 位置，使味蕾位于图像窗口的中心。
7. 在味蕾约三分之二高度处搜寻环绕味蕾的血管。通过第3.2步中TRITC-葡聚糖（500 kDa）注射观察血流循环。若血流受阻，可轻微松开固定螺丝以恢复血流。
8. 调节Z轴，找到含有足够数量味觉细胞的味蕾所在的Z平面。
9. 以2-6 Hz的频率进行80秒的钙成像。在成像开始后，通过打开流体系统的储液器提供20秒的味觉刺激溶液。味觉刺激20秒后，将储液器切换回人工唾液。
10. 完成连续成像后，提前等待约3-4分钟，以准备下一次成像。持续向小鼠舌面灌注人工唾液，以清除前次成像中残留的味觉刺激物。根据实验设计需要，重复进行成像操作。
11. 当 体内 钙成像完成后，按照IACUC规程对小鼠实施安乐死。在麻醉状态下，将小鼠置于CO₂ 腔室
    ​注意：使用脚趾夹捏反射检查麻醉深度。在成像过程中，应持续从储液器提供人工唾液。若在 µTongue 的成像窗口出现气泡，可通过施加较强的液体压力，将气泡从 µTongue 的输入端或输出端推出以清除。

5. 图像分析（图3）

1. 图像转换
   1. 使用 Fiji¹⁴ 或类似的图像分析软件打开原始图像文件。
   2. 将图像文件转换为 RGB 堆栈文件，以使用 NPL Bud Analyzer 代码。
      1. 图像 > 颜色 > 拆分通道
      2. 图像 > 颜色 > 合并通道，并选择步骤 5.2.1 中的图像。
      3. 图像 > 颜色 > 堆栈转 RGB
2. 图像配准
   注意：使用自定义编写的数据分析代码。请参考 https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer。
   1. 运行名为 Taste_GUI.m 的代码；将弹出一个名为 NPL Bud Analyzer 的图形用户界面（GUI）窗口。点击右上角的 新建分析 按钮，然后加载步骤 5.1 中转换后的图像。在加载的图像上方设置帧率。
   2. 在加载的图像上绘制感兴趣区域（ROI）以进行配准。双击选定的 ROI，系统将自动开始计算配准。
3. 获取相对荧光强度变化（ΔF/F）
   1. 返回到 NPL Bud Analyzer 窗口，系统将自动显示步骤 5.2 中配准后的图像。如果用户已有 reg 文件，请点击“加载数据”按钮，并选择 _reg.tif 文件。
   2. 点击 圆形 或 多边形 按钮，并在味蕾图像上定位味觉细胞的感兴趣区域（ROI）。
   3. 系统将自动在味蕾图像下方显示所选味觉细胞的原始荧光强度和钙信号轨迹（ΔF/F）。
   4. 点击 保存轨迹 按钮，将在 GUI 右侧显示钙信号轨迹（ΔF/F），同时在味蕾图像上显示 ROI。重复步骤 5.3.2–5.3.4，直至完成所有 ROI 的选择。
      注意：如果 ROI 选择错误，可点击 删除轨迹 按钮，以移除最近一次选择的 ROI 和对应的钙信号轨迹。
   5. 完成 ROI 选择后，在右下角输入文件名，然后点击 完成 按钮，导出 ΔF/F 钙信号轨迹为 .xls 格式，同时导出带有 ROI 的味蕾图像为 .bmp 格式。
4. 钙信号轨迹分析
   1. 分析步骤 5.3 所获得的钙信号轨迹。当施加味觉刺激物后，若荧光强度上升超过基线标准差的两倍以上⁴，且使用配对或非配对 t 检验得到的 p 值小于 0.01，则认为该味觉细胞对味觉刺激物产生了反应¹⁰。
   2. 若某味觉细胞在三次试验中对特定味觉刺激物产生反应超过两次（约 60%）¹⁵，则将其视为响应细胞。
   3. 通过平均步骤 5.4.1 中获得的单个钙信号轨迹，得到代表性钙信号轨迹。

结果

采用 Pirt-GCaMP6f-tdTomato 小鼠获取味蕾图像。小鼠舌表面覆盖有自发荧光的丝状乳头。味蕾在舌表面上稀疏分布（图4A）。通过三种不同的滤光片检测器获取了味蕾及其结构的图像。使用 607/70 nm 滤光片组，获得味觉细胞中 tdTomato 的信号，用于比率分析（图4B）。使用 525/50 nm 滤光片组，获得味觉细胞以及环绕味蕾的血管中的 GCaMP 信号（图4B）。使用 447/60 nm 滤光片组，获得为味蕾提供结构支撑的胶原结缔组织图像（图4B）。

在获取味蕾及相关结构的图像后， 体内 使用该方案进行钙成像。采用 Pirt-GCaMP6f-tdTomato 小鼠对味觉细胞进行筛选（图 5A)¹⁶...

讨论

本文介绍了一种应用µTongue技术研究味觉细胞功能活性的详细实验方案 体内本方案中，使用基因编码的钙指示剂对味觉细胞进行功能成像。除使用转基因小鼠外，还可通过电穿孔法将钙染料（或电压感应染料）导入味觉细胞，作为替代方案。

本实验中使用的所有味觉溶液的折射率均低于1.336。尽管µTongue能够提供稳定的流体输送，且比率分析可改善成像伪影，但研究人员若使用更高浓度的呈味物质（例如，折射率为1.338的>100 mM蔗糖溶液）仍会面临挑战。人工唾液与味觉溶液之间较大的折射率差异会导致图像焦平面偏移超出后期图像处理的补偿范围。根据经验，已确定允许实时稳定细胞成像的味觉溶液折射率范围（低于1.336）。

对于具有荧光成像和动物操作经验的研究人员而言，通过反复练习可较快掌握本方案。然而，其中包含若干关键步骤，若处理不当常会影响数据的成功获取。首先，舌体一旦暴露于口腔外，应使用人工唾液保持其湿润，以维持天然的黏膜微环境。其次，味蕾周围的血液循环必须保持完整，以确保氧气、营养物质及血液携带因子的生理供应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
安赛蜜钾	Sigma Aldrich	04054-25G	人工唾液 / 味觉刺激物
氯化钙溶液	Sigma Aldrich	21115-100ML	人工唾液 / 味觉刺激物
柠檬酸	Sigma Aldrich	C0759-100G	人工唾液 / 味觉刺激物
环己酰亚胺	Sigma Aldrich	01810-5G	人工唾液 / 味觉刺激物
苯甲地那铵	Sigma Aldrich	D5765-5G	人工唾液 / 味觉刺激物
牙科胶	Denkist	P0000CJT-A2	动物准备
Image J	NIH	ImageJ	数据分析
肌苷酸（IMP）	Sigma Aldrich	57510-5G	人工唾液 / 味觉刺激物
瞬干胶	Loctite	Loctite 4161, Henkel	动物准备
K2HPO4	Sigma Aldrich	P3786-100G	人工唾液 / 味觉刺激物
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G	人工唾液 / 味觉刺激物
氯胺酮	Yuhan	Ketamine 50	动物准备
KH2PO4	Sigma Aldrich	P0662-25G	人工唾液 / 味觉刺激物
KHCO3	Sigma Aldrich	237205-500G	人工唾液 / 味觉刺激物
MATLAB	Mathwork	MATLAB	数据分析
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266-100G	人工唾液 / 味觉刺激物
甲基吡咯烷酮（MPG）	Sigma Aldrich	49601-100G	人工唾液 / 味觉刺激物
多光子显微镜	Thorlab	Bergamo II	显微镜
NaCl	Sigma Aldrich	S3014-500G	人工唾液 / 味觉刺激物
NaHCO3	Sigma Aldrich	792519-500G	人工唾液 / 味觉刺激物
物镜	Nikon	N16XLWD-PF	显微镜
Octaflow	ALA Scientific Instruments	OCTAFLOW II	流体控制
PC	LG	Lg15N54	流体控制
pH计	Thermoscientific	ORION STAR AZ11	人工唾液 / 味觉刺激物
磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	806562	人工唾液 / 味觉刺激物
奎宁	Sigma Aldrich	Q1125-5G	人工唾液 / 味觉刺激物
注射泵	Havard Apparatus	PHD ULTRA 4400	流体控制
TRITC-葡聚糖	Sigma Aldrich	52194-1G	动物准备
超快光纤激光器	Toptica	FFultra920 01042	显微镜
赛拉嗪	Bayer Korea	Rompun	动物准备