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方法文章

温度控制下液滴界面双层膜的组装与表征

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DOI：

10.3791/62362

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2021年4月19日

 , 
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee

本文内容

摘要

本方案详细介绍了使用反馈温度控制加热系统促进高熔点脂质单层组装及液滴界面双层形成的实验方法，以及通过电容测量来表征温度驱动下膜结构变化的技术。

摘要

在油相中将脂质包被的水相液滴组装成液滴界面双层膜（DIB）的方法，相较于其他方法具有若干关键优势：DIB结构稳定且通常可长期维持，双层膜面积可逆调节，通过调控液滴组成可方便地控制单层膜的不对称性，并可通过多个液滴的连接构建出类似组织的双层膜网络。DIB的形成依赖于脂质在液滴表面自发组装成高密度的脂质单层膜。尽管常见合成脂质在室温下易于实现这一过程，但对于熔点高于室温的脂质（包括某些细胞脂质提取物）而言，在相似条件下往往难以形成充分的单层膜或稳定的双层膜。这种局限性可能制约了DIB在模型膜研究中的组成多样性及其生物学相关性。为解决此问题，本文提出了一种实验方案，通过对承载DIB液滴的油相储层进行精确加热，并系统表征温度对脂质膜的影响。具体而言，该方案展示了如何利用导热性良好的铝制夹具和由反馈回路控制的电阻加热元件，设定并维持较高的温度，从而促进多种类型脂质的单层膜组装与双层膜形成。通过测量DIB电容的变化，可定量分析膜的结构特征以及构成双层膜的脂质所发生的热致相变行为。综上，该方法有助于在不同温度条件下评估模型膜中的生物物理现象，包括确定多组分脂质混合物的有效相变温度（TM）。这一能力将有助于更真实地模拟天然脂质膜的相变行为，并推动使用更广泛来源的膜组分构建和应用模型膜体系，包括那些更能反映细胞膜组分异质性的脂质体系。

引言

细胞膜是由 数千种脂质类型1、蛋白质、碳水化合物和甾醇组成的具有选择性通透性的屏障，包裹并划分所有活细胞。因此，了解其组成如何影响其功能，以及揭示天然和合成分子如何与细胞膜相互作用、附着、破坏和跨膜转运，是生物学、医学、化学、物理学和材料工程领域具有广泛意义的重要研究方向。

这些发现目标直接受益于已验证的技术，用于组装、操控和研究模型膜——包括由合成或天然脂质组装而成的脂双层——这些模型膜可模拟其细胞对应物的组成、结构和运输特性。近年来，液滴界面双层（DIB）方法2,3,4 在油相中通过脂质包被的水滴之间构建平面脂双层，已受到广泛关注5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23，相较于其他模型膜构建方法展现出实际优势：DIB 方法操作简便，无需对支撑膜的基底进行复杂加工或制备（例如"涂覆"），能够稳定生成寿命更长的膜，支持标准的膜片钳电生理测量，并简化了具有不对称叶层组成的模型膜的构建过程3。由于双层膜在液滴之间可自发形成，且每个液滴的位置和组成均可定制，DIB 技术在开发受细胞启发的材料体系方面也引起了广泛关注，这些体系基于刺激响应性膜18,24,25,26,27,28,29、平衡的区室化与运输14,30,31，以及类组织材料17,23,32,33,34,35,36 的应用而构建。

大多数关于模型膜（包括使用双层脂膜阵列DIBs的研究）的已发表实验均在室温（RT，约20–25 °C）下进行，并仅使用少数几种合成脂质（例如DOPC、DPhPC等）。这种做法限制了可在模型膜中研究的生物物理问题的范围；并且根据观察，它还可能限制可用于构建DIBs的脂质类型。例如，一种合成脂质DPPC，其相变温度为42 °C，在室温下无法形成紧密堆积的单层膜，也无法形成DIBs37。对于含有多种不同类型脂质、且来源于生活在较高温度（37 °C）环境中的细胞的天然脂质提取物而言，在室温下形成DIBs同样困难，例如哺乳动物来源的脑总脂质提取物（BTLE）38或细菌来源的大肠杆菌总脂质提取物（Escherichia coli total lipid extract, ETLE）37。因此，实现对多种脂质组成的研究，有助于在更接近生物学实际条件的情况下理解由膜介导的生物学过程。

升高油相温度具有两个作用：一是加快单分子层组装的动力学过程，二是可诱导脂质发生熔融相变，从而进入液态无序相。这两种效应均有助于双层油包水液滴界面（DIB）形成前的单分子层组装39。除了加热促进双层膜形成外，在膜形成后进行降温还可用于识别单个脂质双层中的热致相变38，包括那些使用量热法难以检测的天然脂质混合物（如 BTLE）中的相变。除了评估脂质的热致相变行为外，精确调控 DIB 的温度还可用于研究温度诱导的膜结构变化38，并探究脂质组成和膜流动性如何影响膜活性物质（如成孔肽和跨膜蛋白37）的动力学行为，包括在生理相关温度 (37 °C) 下对哺乳动物和细菌模型膜的研究。

本文将介绍如何组装一种改良的DIB油相储液池，并操作反馈式温度控制器，以实现高于室温条件下的单层膜组装和双层膜形成。与先前的方案40不同，本文详细说明了在油相储液池中进行DIB组装与表征的同时，集成用于测量和控制温度所需仪器的具体方法。该操作流程使研究人员能够在多种科学背景下，在不同温度范围内应用此方法来构建和研究DIB。此外，代表性结果展示了当温度变化时，膜结构和离子传输特性可能发生的具体可测变化实例。这些技术是对DIB中可设计和有效实施的众多生物物理研究的重要补充，包括研究不同膜组成中膜活性物质的动力学行为。

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方案

1. 加热装置的准备

  1. 准备2片厚度为1 mm、尺寸分别为25 mm（宽）× 40 mm（长）的绝缘橡胶，以及2片同样为25 mm × 40 mm的6 mm厚橡胶，一个已制备好的铝基底固定装置组件，以及一个可嵌入铝基底固定装置观察窗的丙烯酸油储液池（有关制造细节及组件爆炸图，参见图S1、S2和S3）。首先准备铝制固定装置：使用紫外光固化胶将玻璃盖玻片观察窗粘附于装置底部，并将1个电阻加热元件粘接在固定装置每个25 mm × 25 mm侧边法兰的顶部。
  2. 将较薄的橡胶片放置在显微镜载物台上，使每片的长边与载物台开孔边缘相切，如（图1）所示。
  3. 将铝基底固定装置置于绝缘垫片上方，使装置的观察窗位于物镜正上方中心位置。正确对齐对于成像连接的液滴至关重要。
  4. 在每个电阻加热元件上方放置一块较厚的橡胶，并使用显微镜载物台夹固定。这些橡胶片可保护加热元件免受载物台夹造成的机械损伤，并防止加热元件与铝制固定装置及显微镜载物台之间发生意外电短路。
  5. 小心弯曲热电偶的测量端，使其在距离末端约4 mm处形成90°角。
  6. 将弯曲后的热电偶尖端插入铝制固定装置的左下角，并用锁紧螺钉轻轻固定。
  7. 将丙烯酸储液池放入铝制固定装置的凹槽中。此操作应在向铝制固定装置的凹槽中添加十六烷油之前完成（步骤1.8），以尽量减少空气气泡被困在观察窗与丙烯酸储液池底部之间的风险，此类气泡可能阻碍对液滴的观察。
    注：添加至铝制固定装置观察腔室中的油用于匹配丙烯酸材料与玻璃的折射率，从而更清晰地成像丙烯酸储液池内的液滴。因此需注意，铝制固定装置凹槽中的油不会接触丙烯酸储液池内的内容物，故对铝制固定装置无需进行严格清洗。
  8. 向铝制固定装置的凹槽（即丙烯酸储液池壁与铝制固定装置之间的空间）中加入约1,000 µL十六烷油，注意避免过量填充。铝制固定装置凹槽中的油位应尽可能高，以最大化传热表面积，同时防止油溢出装置边缘，污染显微镜载物台或物镜。
  9. 向丙烯酸储液池中加入约1,000 µL十六烷油，注意避免过量填充。
    ​注：每次实验之间必须彻底清洁丙烯酸储液池。使用者应采用严格的清洗流程，依次用乙醇和去离子水反复冲洗，随后在干燥器皿中干燥超过12小时。

光谱学实验装置；光学激发；步骤顺序；器件制备。
图1：加热台组件。 图像展示了用于DIB形成的导热夹具和油储液池的组装过程；每幅图像下方的数字对应实验方案中的相应步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 用于DIB同时反馈温度控制与电学表征的仪器设备

注意：本方案整合了以下仪器，以实现对 DIB 的反馈温度控制及同步电学表征：一台具有两个可用 USB 接口的个人计算机（PC）、一台与专用数据采集系统（DAQ-1）配对的膜片钳放大器、一个波形发生器、第二个具有电压输出和温度输入模块的可编程数据采集系统（DAQ-2），以及一个电源/放大器。以下步骤描述了这些仪器之间的必要连接方式（如图 2a所示），以实现将温度的测量与控制从 DIB 的同步电生理记录中分离。可根据需要替换为功能相当的仪器。

  1. 建立与 DAQ-2 模块的输出和输入连接。
    1. 在电压输出模块上选择两对用于差分电压连接的螺丝接线端，并将导线连接至这些位置。奇数编号的接线端为共用接地连接，偶数编号的接线端为非接地输出，如（图 2c）所示。将这两对导线分别连接至独立的螺丝接线端-BNC 适配器，然后将每个适配器连接至独立的 BNC 电缆，用于将电压信号传输至其他仪器。
      注意：在此设置中，接线端 0 和 1 的差分连接用于向功率放大器输出温度控制信号，而接线端 6 和 7 的另一对连接则用于通过膜片钳放大器向液滴发送电压输出。
    2. 参考（图 2c），在热电偶输入模块上选择一组热电偶接线端（例如，接线端 2 和 3 被指定为 TC1 对），并将热电偶导线连接至该接线端。

用于数据采集和分析的加热台实验示意图，包含放大器和热电偶装置。
图 2：系统接线连接。 （a）展示了系统所需设备及接线的示意图，（b）提供了DAQ-2连接的详细视图。（c）示意图显示了浸没在油中用于形成DIB的水凝胶包被电极上的水相液滴。两个电极分别连接至膜片钳放大器头级单元的接地（GND）和非接地（V+）接口。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 完成 DAQ-2 模块的电气连接后，通过 USB 连接将 DAQ-2 机箱连接至计算机，并接入电源。随后，在使用商用软件前，确认驱动程序和软件已成功安装。
  2. 在 DAQ-2 与电阻加热元件之间配置并连接一个功率放大器。
    1. 将放大器配置为固定增益放大模式，增益为 10X。
    2. 使用香蕉插头转 BNC 适配器，将来自电压输出模块端子 0 和 1 的 BNC 电缆（图 2b）连接至功率放大器的输入端。
    3. 使用额外的 BNC 适配器和电缆，将功率放大器的输出端连接至两组加热元件，这些加热元件彼此并联连接，并与放大器并联，以确保两个元件在使用过程中保持相同的电压降。
  3. 建立电生理设备所需的连接。
    1. 将来自电压输出模块端子 6 和 7 的 BNC 电缆（图 2b）连接至膜片钳放大器背面的后置切换外部指令 BNC 接口。
    2. 将第二根 BNC 电缆连接在波形发生器输出端与膜片钳放大器背面的前置切换外部指令接口之间。
      注：这两条连接提供了通过膜片钳放大器向液滴电极施加电压波形的替代方法。波形发生器特别适用于生成用于测量膜电容的三角波电压。用户可根据自身应用需求决定是否使用其中任一连接。
    3. 使用第三根 BNC 电缆，将膜片钳放大器前面板上的测量电流输出端连接至 DAQ-1 前面板上的一个可用模拟输入 BNC 接口。
    4. 使用第四根 BNC 电缆，将膜片钳放大器背面的测量膜电压输出端连接至 DAQ-1 上另一个独立的模拟输入接口。这使得施加在电极间的电压能够被数字化。
    5. 按照参考文献40中步骤 7–9 所述，准备好两个由微操纵器支撑的液滴电极后，将电极引线连接至膜片钳头级（headstage），该头级通过电缆与膜片钳放大器相连。
      注：头级的作用是控制电极间的电压并测量产生的电流，该电流被转换为成比例的电压信号，由膜片钳放大器输出至 DAQ-1。
    6. 通过 USB 连接将 DAQ-1 连接到计算机，并将相应的电源线连接至膜片钳放大器和 DAQ-1。
  4. 开启所有测量设备的电源。
    ​注：在此装置中，最关键的细节之一是确保功率放大器的输出（mA-A）连接与膜片钳放大器的头级单元在电气上相互隔离，因为后者使用敏感电路来测量 DIB 中的 pA 至 nA 级电流。

3. 液滴界面双层膜的反馈温度控制

注意：操作反馈温度控制系统以下步骤基于为实现比例-积分（PI）反馈温度控制而定制开发的图形用户界面（GUI）40,41（参见补充代码文件）。也可使用其他软件和控制算法。本文的补充信息中已向读者提供该程序的副本，但用户需自行根据其设备和需求进行配置。

  1. 在计算机上启动 DAQ-2 软件并打开温度控制程序文件。GUI 界面打开后，通过点击 GUI 左下角的文件夹图标并选择温度控制程序，再次打开该程序图3).
  2. 输入比例控制增益（proportional control gain）的适当数值KP）和积分控制增益（KI).
    注意： KP 和 KI 分别为 0.598 和 0.00445 的数值在该装置中表现良好。这些数值是通过系统模型进行仿真迭代确定的，该模型结合了从实测开环加热响应中获得的参数（参见 图4）。在 开环加热规定的加热功率与测得的温度无关。相比之下， 闭环加热 通过持续调节施加到加热器上的功率，使实测温度趋近于目标温度。本文采用PI控制方案实现该过程。
  3. 为测试温度控制方案，在图形用户界面（GUI）中输入期望的目标温度（高于室温），然后启动反馈温度控制。在接下来的几分钟内，观察图形用户界面中显示的反馈（闭环）控制下的实测温度信号。若实测油温显著超过目标温度、对变化响应过慢，或无法收敛至设定的目标温度，则用户需调整控制增益，以达到理想的闭环控制性能。
    注意：该程序对供给电阻加热元件的功率（以及相应的电压）设定了饱和限值。例如，本文所述的两个加热元件各自最大功耗为 5 W。将它们并联连接时，总功耗不应超过 10 W。建议用户考虑供给设备的最大功率，并了解该限值可能影响闭环系统响应目标温度变化的速度。更高功率的加热元件可实现更快的加热速率和更高的设定温度，但需要提供更大的加热电流。
  4. 系统调至可接受的闭环性能后，在图形用户界面（GUI）中输入期望的油温作为DIB形成的设定值。
    注意：例如，设定温度为 60 °C 在水相液滴中进行的BTLE脂质体实验取得了良好的结果37用户被指引至其他地方2,40 有关解释悬挂于线型电极上的液滴之间DIB组装，以及使用膜片钳放大器DAQ-1和电生理测量软件配置电生理设备的方案。具体指Najem等人的方案。40 可严格按照步骤1至13进行操作。在此之后，当使用需要加热以促进单层膜或双层膜形成的脂质时，需采用略有不同的方法以实现成功的单层膜和双层膜制备。
  5. 将银/氯化银（Ag/AgCl）电极的尖端缓慢浸入油中，直至接近亚克力储液池的底部。电极尖端的这一位置对于使液滴保持在加热油中的电极上至关重要，因为在油中观察到的对流流动可能导致液滴从水凝胶涂层电极上脱落图2c).
  6. 在每个电极尖端移取一滴250 nL含有2 mg/mL BTLE、100 mM氯化钾（KCl）和10 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）的水相脂质溶液，并将其在加热的油中孵育至少10分钟，以促进单层膜的形成。
  7. 用接地的法拉第笼罩住前置放大器和加热载物台装置。
  8. 轻柔地缓慢使液滴相互接触
    通过调整电极的水平位置，直至观察到液滴因接触而发生形变或开始相互位移，随后等待数分钟，直至双层膜开始形成。若数分钟后仍未形成双层膜，可进一步将液滴更紧密地推近，以促进双层膜的形成。界面双层膜变薄的形成可通过肉眼观察予以确认（图 5a）或通过测量由波形发生器输出的10 mV、10 Hz三角电压所诱导的方波电容性电流幅值的增加22初始形成后，在进行后续初始设定点表征之前，让双分子层至少平衡10分钟，以达到稳定的界面面积。
    注意：油的类型会对双层变薄、膜厚度以及液滴间接触角产生显著影响。通常情况下，油分子越小，越容易保留在由脂质酰基链占据的双层疏水核心中。油的滞留会增加单层膜和双层膜的表面张力与厚度，同时减小液滴之间的接触面积和接触角。这些指标表明黏附状态较弱。较大、更庞大的分子则产生相反效应。例如，角鲨烯比十六烷等烷烃分子更庞大，因此在双层变薄过程中更容易被排除在单层膜之间。因此，在角鲨烯中形成的双水相界面液滴（DIBs）更薄，表现出更大的接触面积和更高的接触角，并具有更高的形成自由能。22,42 （液滴间黏附性的度量）

4. DIB 中温度依赖性行为的表征

注意：可在基于DIB的模型膜中研究多种物理过程，包括温度变化对膜结构和传输特性的影响。以下步骤应在目标温度下成功形成双层膜后进行。

  1. 通过降低油浴温度至允许双层膜形成的设定点，测量膜的标称电容，以鉴定膜中脂质的热致相变38.
    1. 右键单击 温度图 在图形用户界面（GUI）上清除显示的数据，以确保缓冲区有足够的空间用于后续记录。
    2. 使用连接至膜片钳放大器的波形发生器，在DIB电极两端施加三角波电压信号（例如，10 mV，10 Hz），并记录通过双层膜产生的诱导电流响应。
    3. 通过降低设定温度来冷却双层膜 5 °C 逐步调节温度，并在每次温度变化后，于新的稳态温度下至少等待 5 分钟，直至达到目标温度。或者，可通过关闭反馈控制系统，尝试对双层膜进行被动冷却。但需注意，采用被动冷却方式从 50-60 °C 导致更高的融合率。
    4. 待油浴和双层膜冷却至所需的最低温度后，再次在图形用户界面（GUI）的温度图上单击右键，将温度随时间变化的数据导出至电子表格软件。停止当前记录。
    5. 根据测得的电流，计算冷却期间方波电流响应随时间变化的标称电容。
    6. 绘制标称电容C）与温度（T) 以观察膜电容的变化情况。定位非单调变化 C 与 T 用于识别 TM.
      注意：标称电容可根据方波电流的幅值计算得出43 (|I|) 利用以下关系式 |I| = C dv/dt，其中 dv/dt 等于电压振幅的乘积的四倍（|V|）和频率（f所施加三角电压的函数。根据这些方程， C = |I|/(4|V|f).
  2. 类似地，评估准静态比电容（Cm通过逐步升高油浴温度和双层膜面积，在固定温度下测量双层膜的电导率。
    1. 更改设定温度 10 °C 使用图形用户界面逐步升高温度，并让系统在新温度下达到平衡。
      1. 执行步骤 4.1.2 以启动电容电流的测量与记录。
      2. 通过使用显微操作器小心调节电极的位置来改变双层膜面积（例如，分离电极可减小双层膜面积）。待方波电流达到稳态幅值后，利用安装在显微镜上的相机拍摄DIB图像，以记录显微镜载物台孔径视野中的双层膜形态，从而实现膜面积随时间变化的计算。同时，在电流记录软件中添加数字标记，以标注图像采集对应的时间点。
        注意：显微操作仪可实现对电极的精确控制，从而确保液滴之间轻柔接触。对液滴进行粗略操作可能导致液滴合并或液滴从电极脱落，从而造成实验失败。相关内容在其他部分已有讨论22双层面积通过液滴之间的接触长度计算，这些液滴在底部视角图像中呈现为重叠的圆形。可使用图像处理软件或其他科学编程工具计算液滴的位置、尺寸以及接触线的长度。
      3. 重复步骤 4.2.1.2 至少 4 次，以获得共 5 张 DIB 图像及双层电流的稳态区域。
    2. 在每个设定的温度下重复步骤 4.2.1。
    3. 在与获取图像时双层膜稳定状态面积相对应的标记时间点，分析电流记录和DIB图像以提取数据 C 和 A 每个温度的数据。
    4. 图示 C 与 A 每个温度下的数据，并计算一阶回归的斜率，该斜率代表 Cm 每种温度下双层膜的状态22.
    5. 绘制 C 的数值图m 来自步骤 4.2.4 与 T.
    6. 检查 Cm 与 T 用于识别熔解温度的非单调变化数据， TM.
  3. 通过在双分子层上施加直流电压阶跃输入，评估电压依赖性离子通道形成的动力学特性。
    1. 设置 初始电压 至所需的 mV 步长值（例如，100 mV）。
    2. 设置 最终电压 和 步长 高于目标步长的值（例如，最终电压为 110 mV，步长为 110 mV）。
    3. 设置阶跃输入的持续时间（单位：秒，例如 90 s）。
    4. 选择阶跃输入的所需极性（例如，正极性）。
    5. 将膜片钳放大器切换至接收来自图形用户界面/电压输出模块的指令电压并传送至前端放大器。
    6. 开始记录电流。
    7. 打开电压并记录诱导的电流响应，该响应应表现为对临界电压的S形响应（例如，约70 mV时 1 µg/mL 2 mg/mL BTLE 中的 Mz
  4. 此外，可在设定温度下分别获取膜的动态电流-电压关系，以揭示电压依赖性关系，例如离子通道行为。
    1. 将膜片钳放大器切换至接收来自波形发生器的指令电压，并开始记录电流。
    2. 在波形发生器上输出具有设定振幅、偏移量和频率的连续正弦波形。
    3. 记录一个或多个周期内的诱导电流响应。
    4. 根据需要，重复上述步骤以测试不同的正弦波振幅、频率和温度。

用于直流阶跃分析的 LabView 控制面板，带有波形图；包含温度控制设置。
图 3：温度控制图形用户界面（GUI）。本图突出标注了使用该程序的图形用户界面控制油浴温度所需的关键步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

图1 展示了如何在显微镜载物台上准备铝制夹具和丙烯酸油储液池以形成DIB。步骤1.2-1.4用于将夹具与载物台进行热隔离，以实现更高效的加热。步骤1.5-1.7展示了如何正确地将热电偶连接到夹具上并定位油储液池，步骤1.8-1.9展示了向这些部件中添加油的推荐位置。

图2 概述了用于在双层脂膜（DIB）上建立反馈温度控制并进行电学测量的组件：一台计算机（PC）、一个固定增益功率放大器、一个膜片钳放大器和一个数据采集系统（DAQ系统，或用于施加电压并测量皮安至纳安级电流的等效仪器）、第二个具备适当模拟输入和输出功能的DAQ系统、一个波形发生器，以及装配好的带有连接电阻加热器的铝制装置。DAQ-2 使用了两个模块（图2b）。其中一个为4通道、±10 V、16位模拟电压输出模块，用于向功率放大器的输入端（图2a中的蓝色连接）和膜片钳放大器的外部指令输入...

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讨论

本文所述方案提供了组装和操作实验系统的说明，用于控制形成DIBs所用油相和液滴的温度。该方法对于使用熔点高于室温的脂质形成DIBs尤为有利。此外，通过精确调节油相储液池的温度，可调控双分子层的温度，从而研究升高温度对多种膜特性与性质的影响，包括电容、面积、厚度、诱导的热致相变、膜活性物质的动力学行为，以及双分子层界面黏附能学37,38。

在用于DIB研究之前，该方案包含三个部分：1）加热平台装置的准备与组装；2）连接各种仪器；3）通过选定的比例和积分控制增益，确认适宜的温度控制性能。在第二部分中，最重要的是，用户必须确保避免功率放大器输出（>mA级电流）与膜片钳头级放大器（pA至nA级电流）之间形成共用的导电通路。意外的短路可能导致头级放大器永久性损坏。此外，确保PC机及所有仪器均连接至共用的交流电源地线，并在头级放大器和液滴电极附近使用接地的法拉第笼，有助于最小化双层电流测量中的噪声。在完成第二部分的设置后，用户必须首先通过向加热元件施加固定电压并记录温度的相应上...

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致谢

本研究得到美国国家科学基金会资助项目 CBET-1752197 和美国空军科学研究办公室资助项目 FA9550-19-1-0213 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
25 mm × 40 mm × 1 mm 绝缘橡胶（x2）任意使铝制底座的底部与显微镜载物台绝缘
25 mm × 40 mm × 6 mm 绝缘橡胶（x2）任意保护加热元件免受显微镜载物台夹具损坏，并对加热元件顶部进行绝缘
3-(N-吗啉代)丙磺酸 Sigma AldrichM3183脂质溶液的缓冲剂
丙烯酸基底自制HTD_STG_2约 1000 µL 丙烯酸储液池，外轮廓具有防错设计以固定方向
铝制底座自制HTD_STG_1带有油腔的基座装置，用于容纳丙烯酸装置，并在油腔两侧设有两个平面垫片以安装加热元件 
脑组织总脂质提取物Avanti131101C-100mg25 mg/mL 猪源性脂质提取物 
紧凑型数据采集机箱（cDAQ）National Instruments cDAQ-9174 用于容纳多种类型传感器测量或输出模块的机箱
数据采集系统（DAQ）Molecular Devices Digidata 1440A 高分辨率模拟-数字转换器
固定增益放大器/电源Hewlitt PackardHP 6826A放大来自电压输出模块的直流电压输出
玻璃盖玻片CorningCLS284525密封铝制底座底部，并允许对双层膜进行光学表征
加热元件（x2）OmegaKHLV-101/525 mm × 25 mm 聚酰亚胺薄膜 Kapton 加热元件，最大功率为 5 瓦 
M3 不锈钢螺钉McMaster Carr90116A150将热电偶固定在铝制底座上
膜片钳放大器Molecular Devices AxoPatch 200B 测量电流并向探头输出电压
个人计算机任意配备多个高速 USB 接口且至少具有 6 GB 内存的计算机
氯化钾Sigma AldrichP3911解离离子的电解质溶液
温度输入模块National Instruments NI 9211支持 cDAQ 机箱的开路和冷端热电偶测量
热电偶OmegaJMTSS-020U-6 U 型热电偶，直径为 0.02 英寸，长度为 6 英寸
紫外光固化胶粘剂Loctite19739将玻璃盖玻片固定在铝制底座上
电压输出模块National Instruments NI 9263用于 cDAQ 机箱的模拟电压输出模块
波形发生器Agilent33210A 用于输出 10 mV、10 Hz 的正弦波形

参考文献

  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
  5. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  6. Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
  7. Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
  8. Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
  9. Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
  10. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
  11. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  12. Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
  13. Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
  14. Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
  15. Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
  16. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  17. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-like printed material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  18. Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
  19. Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
  20. Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
  21. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , Cambridge University Press. 1755(2015).
  22. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  23. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 615-622 (2019).
  24. Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
  25. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
  26. Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726(2015).
  27. Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
  28. Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008(2016).
  29. Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585(2017).
  30. Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
  31. Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
  32. Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
  33. Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
  34. Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , Springer. (2019).
  35. Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142(2019).
  36. Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
  37. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
  38. Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  39. Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
  40. Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998(2019).
  41. Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
  42. Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
  43. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  44. Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
  45. Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
  46. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
  47. Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
  48. Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).

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