类器官三维成像用于研究初级纤毛发生过程 离体 器官发生

摘要

由干细胞衍生的类器官有助于分析在哺乳动物组织器官发生过程中调控干细胞自我更新和分化的分子与细胞过程。本文介绍了一种用于分析小鼠乳腺类器官中初级纤毛生物学的实验方案。

摘要

类器官是由干细胞衍生的三维结构，能够再现 离体 器官复杂的结构与生理特性，使得类器官成为研究哺乳动物中调控干细胞自我更新与分化的机制的有用模型，包括初级纤毛的形成（primary ciliogenesis）及纤毛信号传导。初级纤毛的形成是指组装初级纤毛的动态过程，初级纤毛作为一种关键的细胞信号中心，在多种组织中调控干细胞的自我更新和/或分化。本文提供了一套完整的方案，用于对小鼠乳腺类器官整体样本进行细胞谱系及初级纤毛标志物的免疫荧光染色，并适用于光片显微镜成像。我们描述了显微成像方法以及图像处理技术，以实现对类器官中初级纤毛组装状态和长度的定量分析。该方案可在单细胞水平上对复杂三维结构中的初级纤毛进行精确分析。本方法适用于对来源于正常或基因修饰干细胞、健康或病变组织的乳腺类器官进行初级纤毛及其纤毛信号传导的免疫荧光染色与成像，从而研究初级纤毛在生理与病理状态下的生物学功能。

引言

多细胞生物的发育以及成体组织中稳态的维持，依赖于干细胞自我更新与分化之间精细调控的平衡，这种平衡在时间和空间上协调了正常组织的发育与再生¹。这一调控机制的失调可导致发育异常和癌症²。因此，阐明协调干细胞自我更新与分化的分子和细胞机制，是发育生物学和癌症生物学研究中的关键问题。

近年来，ex vivo 器官发生技术取得了显著进展，该技术利用组织干细胞生成三维类器官，使我们能够在体外培养体系中研究哺乳动物器官发生过程中干细胞的动态行为以及组织稳态的维持机制³。类器官为研究这些过程提供了良好的替代方案，避免了繁琐的基因修饰动物模型的使用。目前，已建立了多种来源于不同器官组织干细胞的类器官培养方案³，包括小肠和结肠、胃、肝、胰腺、前列腺以及乳腺³。此外，在形成类器官的干细胞中应用体细胞基因组编辑技术，现在能够快速解析调控其生物学行为的分子与细胞机制^4,5。

初级纤毛是一种基于微管的结构，可在多种组织的干细胞和/或分化细胞表面组装⁶。它通常不具有运动性，且每个细胞一般仅组装一个初级纤毛结构⁷。初级纤毛形成是指组装初级纤毛的动态过程⁷。在细胞表面，纤毛充当细胞信号传导平台⁸。因此，初级纤毛被认为在多种组织（包括脑^9,10、乳腺^4,11、脂肪组织¹²以及嗅上皮¹³等）中发挥调控干细胞自我更新和/或分化的关键作用。初级纤毛形成和/或纤毛信号传导在不同的细胞谱系及发育阶段受到动态调控^4,13,14，但其潜在机制在很大程度上仍有待阐明。

离体器官发生技术在研究控制干细胞生物学（包括初级纤毛形成及纤毛信号传导）的分子与细胞机制方面展现出巨大潜力，有助于基础科学知识的发展。然而，该技术依赖于在单细胞水平及亚细胞尺度上对完整器官样结构进行高分辨率成像的能力。我们近期利用小鼠乳腺干细胞来源的类器官模型证明，初级纤毛可正向调控小鼠乳腺干细胞类器官的形成能力⁴。本文提供了一套针对完整小鼠乳腺类器官免疫荧光染色的全面实验方案（图1A、B），该方案可支持在三维条件下通过光片显微镜对离体器官发生过程中的初级纤毛进行分析。近期已有其他研究报道了通过共聚焦显微镜对类器官进行免疫荧光染色与成像的替代方法^15,16。而本方案则专注于类器官的制备及其在光片显微镜下的成像流程。

方案

注意：以下方案适用于在96孔板的5个孔中培养并合并在一起（> 100个类器官）的类器官染色。类器官来源于小鼠乳腺干细胞。供体小鼠的饲养和操作均依照法国雷恩大学动物护理委员会批准的方案进行。

1. 试剂

1. 配制固定液：将125 µL的16%多聚甲醛（PFA）水溶液加入375 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成4% PFA溶液。
   注意：操作有毒物质PFA时，应在化学通风橱中进行。
2. 配制通透缓冲液：将1.5 µL Triton X100加入500 µL PBS中，配制成0.3% Triton X100溶液。
3. 配制封闭缓冲液：将1.5 µL Tween-20和75 µL正常山羊血清加入PBS中，配制成含5%山羊血清和0.1% Tween-20的封闭液。
4. 配制光片显微镜封片介质：将1 g超纯低熔点琼脂糖溶于100 mL dH₂O或PBS中，加热至65 °C。分装为每份1 mL，室温保存。

2. 类器官回收

1. 用经FBS包被且末端被剪切过的移液枪头（末端最小直径为1.5 mm），在培养孔中将类器官轻轻吹打3次后，转移至低吸附性聚合物材质的1.7 mL离心管中。
   注意：包被可防止类器官黏附在枪头表面；低吸附性聚合物材料可在整个染色过程中减少类器官在管壁上的附着。
2. 向离心管中加入PBS至满，以350 × g 离心3分钟，随后弃去上清液。

3. 固定、通透与封闭

1. 将类器官重悬于 500 µL 的 4% 多聚甲醛（PFA）中，在室温下孵育 30 分钟。以 350 × g 离心 30 秒，弃去上清液。
   注意：从本步骤开始，通过直接将不同缓冲液加至类器官沉淀上（不扰动沉淀）来重悬类器官。所有洗涤步骤均在室温下进行。
2. 用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤类器官 3 分钟，以 350 × g 离心 30 秒，弃去上清液。
   暂停：固定后的类器官可在 4 °C 的 PBS 中保存至少一周。
3. 通过将类器官重悬于 500 µL 的含 0.3% Triton X-100 的 PBS（PBS-Triton X-100 0.3%）中进行透化处理，在室温下孵育 30 分钟。以 350 g 离心 30 秒收集类器官。
4. 将类器官用 1 mL PBS 重悬，孵育 3 分钟，以 350 × g 离心 30 秒，弃去上清液。重复一次。
5. 可选：将类器官重悬于 500 µL 冰冷甲醇中，在 -20 °C 孵育 10 分钟。此步骤可能对某些中心体特异性标志物的染色是必需的。
6. 可选（若已执行步骤 5）：用 1 mL PBS 洗涤类器官 3 分钟，以 350 × g 离心 30 秒，弃去上清液。重复一次。
7. 用 500 µL 封闭缓冲液（PBS、5% 山羊血清、0.1% Tween 20）重悬类器官，封闭非特异性抗体结合位点，在室温下孵育 1 小时 30 分钟。以 350 g 离心 30 秒，弃去上清液。
8. 将类器官用 1 mL PBS 重悬，孵育 3 分钟，以 350 × g 离心 30 秒，弃去上清液。

4. 标记

1. 用200 µL含稀释后一抗的封闭缓冲液重悬类器官，在4 °C下以轻微振荡（水平摇床，60 rpm）孵育过夜。将离心管以与水平面成45°角放置，以确保类器官保持在管底的染色缓冲液中。
2. 用1 mL PBS重悬类器官进行洗涤，孵育5分钟，然后在350 × g离心30秒，弃去上清液。重复此步骤两次。
   注意：在最后一步中，部分类器官可能粘附在管壁侧面，导致离心后吸走上清时发生类器官丢失；在洗涤步骤的PBS中加入0.2%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）可减少类器官损失。
3. 用200 µL含二抗的封闭缓冲液重悬类器官，于室温下以轻微振荡（水平摇床，60 rpm）孵育1小时30分钟。将离心管以与水平面成45°角放置，以确保类器官保持在管底的染色缓冲液中。
   注意：可将Hoechst（或其他细胞核染料，如DAPI或DRAQ5）加入含二抗的缓冲液中一同孵育。
4. 用1 mL PBS重悬类器官进行洗涤，孵育5分钟，然后在350 × g离心30秒，弃去上清液。重复此步骤两次。
   ​注意：在最后一步中，部分类器官可能粘附在管壁侧面，导致离心后吸走上清时发生类器官丢失；在洗涤步骤的PBS中加入0.2%（w/v）BSA可减少类器官损失。

5. 成像用琼脂糖样品的制备

1. 将载片介质在 65 °C 条件下孵育使其融化。介质融化后，于 37 °C 孵育 5 分钟。
2. 使用剪去末端的 200 µL 吸头（末端最小尺寸：1.5 mm），通过上下吹打两次，将类器官重悬于 100 µL 载片介质中。
3. 用推杆将含有类器官的载片介质吸入玻璃毛细管（绿色毛细管，内径：1.5 mm）中。在室温下孵育毛细管 5 分钟，使载片介质凝固。
   暂停：毛细管可在成像前于 4 °C 的 PBS 中保存一周。

6. 成像

1. 使用光片显微镜（例如 ZEISS Lightsheet Z.1），采用20倍或40倍水浸物镜对类器官进行成像。
   1. 将玻璃毛细管放入观察室中。使用前摄像头定位毛细管，并将玻璃毛细管尖端置于检测物镜的上限位置。
   2. 选择样品，并在明场照明下利用玻璃毛细管的尖端设置最佳焦距。缓慢将琼脂糖样品从毛细管中推出，并在凝固的琼脂糖中定位类器官。
   3. 使待成像的类器官靠近毛细管尖端，以减少样品在PBS中的移动。旋转毛细管以设定最佳样品方向，并定义所需的缩放倍数。
   4. 选择采集模式。定义需成像的通道，设置光片的合适方向，为每个通道设置激光功率（为减少光漂白，请使用较低的激光功率），设置图像尺寸及所需的照明侧。成像参数示例：图像尺寸1920 × 1920，照明方式：双侧照明。
   5. 使用Z-stack模块设置Z-stack的Z轴范围，并将Z步长设为最优值。
2. 使用显微镜软件中的图像处理模块处理输出文件，以实现对样品的浏览、Z轴投影及三维重建。
3. 旋转样品，并从不同角度获取新图像，或对其他类器官进行成像。
4. 使用支持以下功能的交互式显微图像分析软件（例如 Imaris）分析图像：(i) 样品的三维可视化；(ii) 目标物体的分割；(iii) 目标物体的识别与定量分析。

结果

ex vivo 器官发生方法正在改变我们研究哺乳动物组织发育以及在培养皿中维持组织稳态的能力。对调控这些过程的分子和细胞机制（包括初级纤毛形成及纤毛信号传导）的分析，依赖于对类器官进行三维成像的能力。

上述方案可实现对完整乳腺类器官的染色。这些类器官来源于经流式细胞分选（FACS）从成年雌性小鼠中纯化的富含乳腺干细胞的基底细胞（图1A）⁴。该染色程序可在不到24小时内实现对类器官中细胞谱系、中心体和初级纤毛标志物的可视化（图1B）。我们所描述的免疫荧光染色与成像方法在揭示类器官三维结构方面的优势，可通过整合素α6（亦称为CD49f）的染色与可视化加以展示（图1C）。此外，对初级纤毛（通过初级纤毛标志物Arl13b染色）、中心体（通过γ微管蛋白染色）以及富含乳腺干细胞的基底细胞（通过上皮-间质转化标志物Slug染色）的染色，进一步展示了在细胞...

讨论

本文所展示的详细方案可用于在半固体培养基中生长的小鼠乳腺类器官的染色与成像。该方案可能同样适用于在半固体及固体培养基中生长、模拟多种组织结构的类器官的染色。对于在100% Matrigel上覆盖培养基生长的类器官，其回收与固定步骤略有不同：需先从培养孔中移除培养基，经快速PBS洗涤后，可直接将固定液（4% PFA）加入含有Matrigel类器官的培养孔中。Matrigel中的类器官可在室温下用固定液孵育30–60分钟。固定完成后，将类器官重新悬浮于固定液中，并转移至染色管中。在离心后、进行通透处理前，必须彻底去除固定液及残留的Matrigel。类器官的通透处理是本方案中的关键步骤。初级纤毛与中心体标志物的共染色通常需要Triton X-100和甲醇孵育步骤。然而，这些通透处理步骤可能会影响其他标志物（如细胞间连接标志物或其他细胞骨架蛋白）的共染色效果，因此可能需要采用其他通透策略。

在染色过程的整个阶段，类器官丢失是一个常见问题。为减少类器官丢失，关键步骤是在将类器官从培养孔转移至染色管时，对所用移液枪头进行包被处理。同时，必须使用低吸附性聚合物管作为染色管。这些措施可分别防止类器...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 IgG1 647	Thermo-Fisher	A21240
抗小鼠 IgG2A 488	Thermo-Fisher	A21131
抗兔 546	Thermo-Fisher	A11035
Arl13b	NeuroMab	73-287
EMS 16% 多聚甲醛水溶液，电镜级	Electron Microscopy Sciences	15710
FBS	Thermo-Fisher	10270106
gtubulin	Sigma-Aldrich	T5326
Hoechst 33342	Thermo-Fisher	62249
整合素 α6	Biolegend	313616
光片显微成像毛细管	Zeiss	701908
光片显微成像推杆	Zeiss	701998
低吸附微量离心管	BioScience	27210
正常山羊血清封闭液	Vector labs	S-1000
PBS	Sigma-Aldrich	p3587
Slug	Cell Signaling Technology	9585
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T9284
Tween-20	Euromedex	9005-64-5
UltraPure 低熔点琼脂糖	Thermo-Fisher	16520050