细胞铺展过程中细胞边缘动力学的定量分析

摘要

在本实验方案中，我们介绍了基于活细胞显微镜技术的细胞铺展实验的操作步骤。我们提供了一个开源的计算工具，用于对荧光标记的细胞进行无偏分割，并对细胞铺展过程中的片状伪足动态进行定量分析。

摘要

细胞铺展是一个动态过程，指悬浮在培养基中的细胞附着于基质后，从圆球状逐渐变平，形成扁平且伸展的形态。在细胞与基质附着之后，细胞会从胞体向外延伸形成一层薄的片状伪足。在片状伪足中，球状肌动蛋白（G-actin）单体聚合形成致密的丝状肌动蛋白（F-actin）网状结构，该结构对细胞质膜产生推力，从而为细胞铺展提供所需的机械力。值得注意的是，调控片状伪足中肌动蛋白聚合的分子因子在许多其他细胞过程中也发挥关键作用，例如细胞迁移和内吞作用。

由于铺展细胞会形成跨越整个细胞周边并持续向外扩展的片状伪足，细胞铺展实验已成为评估片状伪足突出动力学的有效工具。尽管已有多种细胞铺展实验的技术实现方法被开发出来，但目前仍缺乏对实验流程的详细描述，尤其是包含逐步操作方案及用于数据分析的计算工具的完整流程。本文中，我们详细描述了细胞铺展实验的操作步骤，并提供了一个开源工具，用于对细胞铺展过程中细胞边缘动态进行定量且无偏倚的分析。当该方案与药理学干预和/或基因沉默技术相结合时，适用于大规模筛选调控片状伪足突出的分子因子。

引言

片状伪足是迁移细胞前端形成的显著细胞骨架结构。在片状伪足中，肌动蛋白在Arp2/3复合物和formins 的协助下发生聚合，形成快速生长的分支状肌动蛋白网络，该网络对质膜产生推力^1,2。这种由肌动蛋白网络产生的推力在物理上推动细胞向前移动^1,3,4,5。Arp2/3复合物的缺失或对片状伪足形成至关重要的信号通路的破坏，通常会损害细胞迁移能力^{6, 7}。尽管也有报道显示缺乏片状伪足的细胞仍可迁移^8,9，但片状伪足在细胞迁移中的重要性是明确的，因为缺失这一突出结构会干扰细胞在 复杂的生物微环境中移动的能力^6,10。

研究迁移细胞中片状伪足调控机制的主要障碍在于片状伪足突出动力学、大小和形状存在天然变异性^11,12,13,14。此外，近期研究表明，片状伪足表现出复杂的突出行为，包括波动性、周期性和加速性突出^14,15。与迁移细胞中高度可变的片状伪足相比^6,16，细胞铺展过程中形成的片状伪足更为均一¹²。由于铺展细胞与迁移细胞的突出活动均由相同的大型分子复合物驱动，这些复合物包括分支状肌动蛋白网络、收缩性肌动蛋白-肌球蛋白束以及基于整合素的细胞-基质黏附结构^17,18，因此铺展细胞被广泛用作研究片状伪足动态调控的模型。

细胞铺展是一个动态的力化学过程，悬浮状态的细胞首先通过整合素介导的黏附作用附着于基质表面^17,19,20，随后通过延伸由肌动蛋白驱动的突起而铺展开来^21,22,23。在铺展阶段，从细胞体发出的片状伪足呈各向同性且持续地向外延伸，几乎不发生回缩或停滞现象¹²。目前最常用的细胞铺展实验方案是终点法检测，即在接种后不同时间点固定正在铺展的细胞^19,24。这类方法虽然快速简便，但在检测片状伪足动态特征变化方面的诊断能力有限。为了揭示调控片状伪足动态行为的分子机制，Sheetz 研究组率先采用对活细胞铺展过程进行定量分析的方法，发现了细胞边缘突起的诸多基本特性^11,12,22。这些研究证明，活细胞铺展实验是细胞生物学实验室中一种稳健且强大的技术手段。然而，目前细胞生物学领域尚缺乏详细的活细胞铺展实验操作流程以及开源的计算分析工具。为此，本实验方案详细描述了活细胞铺展过程的成像步骤，并提供了一套自动化的图像分析工具。为验证该方法的有效性，我们采用抑制 Arp2/3 复合物活性作为实验处理，结果表明，抑制 Arp2/3 复合物功能并不会完全阻断细胞铺展，但会显著降低细胞突起的推进速度以及细胞边缘突起的稳定性，导致细胞边缘呈现锯齿状形态。这些数据表明，结合活细胞成像与自动化图像分析，是研究细胞边缘动态行为及鉴定调控片状伪足分子组分的有效手段。

方案

1. 细胞接种

注意：所述的细胞铺展实验方案使用表达 PH-Akt-GFP（PIP₃/PI(3,4)P₂ 的荧光标记物）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）进行。该细胞系通过 CRISPR 介导的基因编辑技术，将 PH-Akt-GFP 表达载体（Addgene #21218）在基因组中稳定整合而获得。然而，本实验也可使用其他瞬时表达或基因组整合的荧光标记物。为了获得最佳的图像分割效果，我们推荐使用在细胞质中均匀分布的荧光标记物，例如，胞质 GFP。

1. 将细胞培养至10 cm培养皿中达到90%融合度。
2. 当细胞达到合适的融合度后，将一个22 mm × 22 mm的盖玻片（#1.5；厚度0.17 mm）放入35 mm细胞培养皿中。用400 µL已用PBS稀释至终浓度为2.5 µg/mL的纤连蛋白溶液包被盖玻片。
   注意：实验所需盖玻片的数量由实验条件数量及技术重复次数决定。
3. 将含有纤连蛋白包被盖玻片的35 mm培养皿置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育1小时。
4. 从培养箱中取出含盖玻片的培养皿，吸除纤连蛋白溶液，并通过轻轻吹打PBS洗涤盖玻片2至3次。
5. 从10 cm培养皿中吸除细胞培养基，并用PBS洗涤培养皿。
6. 向90%融合的细胞培养皿中加入650 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，倾斜培养皿使酶液均匀分布。将加有胰蛋白酶的培养皿放入培养箱中孵育1分钟。
7. 从培养箱中取出含细胞的培养皿。向一个15 mL离心管中加入10 mL细胞培养基，然后迅速向培养皿中再加入10 mL培养基以终止胰蛋白酶消化。
8. 用移液器将1 mL经胰蛋白酶处理的细胞悬液转移至15 mL离心管中以稀释细胞。上下吹打管内液体，确保细胞在培养基中均匀分布。对于易发生聚集的细胞类型，建议通过细胞滤网（孔径100 µm）过滤，以减少细胞团块的形成。
9. 从离心管中取500–1000 µL稀释后的细胞悬液，加入含有盖玻片的35 mm培养皿中。
10. 轻轻摇动培养皿使细胞均匀分布。确保盖玻片上的细胞密度约为10%融合度（约50,000 cells/mL），并根据需要调整加入的细胞悬液体积。
    注意：将细胞接种在如此低的密度是为了确保在后续细胞铺展成像过程中，每个视野中存在1–2个极化良好的单个细胞，以便对焦物镜并追踪细胞铺展过程。
11. 将10 cm培养皿中剩余细胞的1/5传代至每个处理条件对应的6 cm培养皿中。将传代后的培养皿以及含盖玻片的35 mm培养皿一同放入培养箱中过夜培养。
    注意：这些细胞将用于分析细胞铺展动态。

2. 药物孵育与细胞回收

1. 向两个15 mL离心管中各加入5 mL细胞培养基，向两个50 mL离心管中各加入20 mL酚红-free DMEM。
   注意：离心管对（15 mL + 50 mL）的数量应与实验条件的数量相对应。
2. 为检测Arp2/3在细胞铺展中的重要性，将Arp2/3的药理学抑制剂CK-666或对照处理物（如DMSO）用移液器加入每对离心管中，直至达到所需浓度。
3. 从培养箱中取出传代的6 cm培养皿（见步骤1.11），吸除培养基，并用预热的PBS洗涤培养皿。
4. 将含有CK-666或DMSO的15 mL离心管中的内容物分别加入各传代培养皿中。根据相应的药物处理标记每个培养皿，并将培养皿放入培养箱中孵育1小时。
5. 从培养箱中取出培养皿，吸除培养基，并用预热的PBS洗涤培养皿，以彻底清除残留的含酚红培养基。
6. 向每个6 cm培养皿中加入230 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，细胞孵育1分钟。
   注意：如适用，可用非蛋白水解性细胞黏附阻断剂替代胰蛋白酶。
7. 从培养箱中取出培养皿。对于每种处理，将来自含药物的15 mL离心管的内容物加入标记为“Tube B”的15 mL离心管中。再向相应培养皿中加入5 mL相同的培养基以终止胰蛋白酶反应。将培养皿中的内容物转移至标记为“Tube A”的15 mL离心管中。
8. 从Tube A中转移1 mL细胞悬液至Tube B中。每种处理均重复此操作。
9. 将Tube A和Tube B放入培养箱中孵育45分钟，使细胞从胰蛋白酶消化中恢复。在将离心管放入培养箱前，略微松开管盖，以允许CO₂进入。
   注意：不同细胞类型的恢复时间可能有所不同。尽管在我们的实验中，45分钟的恢复时间对细胞活力影响可忽略不计，但某些细胞类型在悬浮状态下维持过久可能发生失巢凋亡。因此，建议通过实验确定最佳恢复时间。最佳恢复时间应能实现快速且同步的细胞铺展，且样品中无死亡或凋亡细胞。

3. 磁室制备

1. 使用前，请确保可容纳 22 mm × 22 mm 方形盖玻片的 1 孔 Chamlide 细胞磁力腔室的所有部件均已清洁。
2. 从培养箱中取出带有盖玻片的 35 mm 培养皿（见步骤 1.11）。吸除细胞培养基，并用预热的 PBS 清洗盖玻片。
3. 用镊子将盖玻片从 35 mm 培养皿中取出，轻轻将其放置在磁力腔室的底板上。
4. 将硅胶垫圈置于盖玻片上方。
   注意：垫圈放置不当是导致磁力腔室泄漏的最常见原因。请确保垫圈完全嵌入底板的凹槽内，不得高于凹槽边缘。
5. 将主体部分安装到底板上。
   注意：此步骤应缓慢进行。建议用一只手按住底板，同时用另一只手将主体部分放上。这样可防止主体部分的磁铁吸起底板，从而避免盖玻片发生位移或破裂。
6. 向磁力腔室内加入 1 mL 含药物且不含酚红的 DMEM 培养基。取一块无尘纸巾，仔细擦拭主体与底板之间的接缝处，检查是否存在泄漏。
   ​注意：若发现泄漏，请立即吸除培养基，并从步骤 3.4 重新开始操作。
7. 将透明盖子缓缓盖在主体部分上，封闭磁力腔室。
8. 先用清水喷湿一张实验室用纸巾，擦拭磁力腔室底部（仅限盖玻片区域，避免接触金属部分）。随后，用另一张实验室用纸巾喷少量 70% 乙醇，再次擦拭，注意避免划破或压裂盖玻片。

4. 图像采集

1. 将载物台培养箱和物镜加热器预热至 37 °C，并将 CO₂ 将台式培养箱中的水平调节至5%。
   注意：如果载物台培养箱未连接至 CO₂ 应向细胞培养基中添加25 mM HEPES，以维持恒定的pH 7.4。
2. 在预热的60倍、1.4数值孔径的油镜物镜上滴加足量的镜油。
   注意：本方案中使用60倍、数值孔径1.4的油浸物镜，因其具有相对较大的视野和优异的光收集效率。若需要更大的视野，可选用较低放大倍数的物镜（例如，20倍）只要图像的信噪比大于2.5即可使用。
3. 将组装好的磁力腔和B管（步骤2.9）转移至共聚焦显微镜处，将磁力腔放置于载物台顶部培养箱上。
   注意：将磁力腔室轻柔地放置在载物台上，以避免浸油中产生气泡。
4. 使用GFP通道将焦点对准荧光细胞，确保细胞边缘清晰且轮廓分明。
5. 移除磁力架的透明盖，用移液器将500 µL液体从B管转移至磁力架中。将透明盖重新盖回磁力架顶部。
6. 为确定适合进行细胞铺展分析的细胞，应寻找尚未贴附到盖玻片上但已停止滚动的细胞“晕环”状区域。处于盖玻片贴附最初阶段的细胞也是理想的候选对象，但必须迅速进行图像采集，以捕捉铺展过程。
7. 为绿色通道设置延时图像采集，包含四个视野，以6秒间隔成像。
   注意：由于不同细胞类型的片状伪足 protrusion 速度存在高度变异性，最佳帧率应通过实验经验确定。我们实验中采用的6秒成像间隔对于分析许多间充质细胞和上皮细胞而言是一个良好的起点。然而，对于铺展速度非常快的细胞（例如，免疫细胞）可能需要更高的帧率（更短的成像间隔）。用于记录细胞铺展过程的视频，其最佳帧率应确保细胞边缘在连续帧之间的位移达到2-5像素。考虑到用于识别细胞铺展平台期的曲线拟合的准确性，最佳帧率还应保证在细胞快速扩展阶段对细胞边缘位移进行50-100次测量。视野数量应根据曝光时间、采集点之间的距离以及载物台移动速度进行调整。建议用户确定在所需帧率下可采集的最大视野数。
8. 在找到合适的视野后，保存显微镜载物台的X和Y坐标。继续在盖玻片上寻找另外三个彼此相对靠近的视野。为每个目标视野保存显微镜载物台的坐标。
   注意：强烈建议优化视野之间的载物台移动路径，以尽量减少不必要的样本移动。此类优化可手动或自动进行。过度的样本移动会减缓图像采集速度，并可能导致细胞在沉降过程中滚出视野。
9. 以每6秒一帧的速率采集图像15分钟，并保存文件。如需进一步采集，请从步骤4.6开始重复。

5. 细胞铺展过程中细胞面积、圆度及突起动态的分析

1. 准备用于数据处理和分析的图像
   注意：该软件需要输入 .tiff 格式的图像以及像素尺寸作为参数。这两个要求均可通过采集软件或 Fiji（本方案中使用）实现。若已满足上述条件，请继续执行步骤 5.2。
   1. 安装最新版本的 Fiji 软件（https://imagej.net/Fiji/Downloads）。
   2. 使用 Fiji 打开一个延时成像图像。
   3. 通过选择 图像 > 属性 获取图像的像素尺寸。将像素尺寸（单位为 µm）复制并粘贴到记事本或 Word 文档中。
   4. 为分析细胞铺展面积和圆形度，需将延时图像保存为 tiff 图像堆栈。自定义构建的分析软件不支持专有文件格式。通过选择 文件 > 另存为 > Tiff 保存单个细胞的 tiff 图像堆栈。
2. 安装用于数据处理和分析的 Python 集成开发环境（Spyder）及必要包（PySimpleGUI 和 tifffile）。
   注意：Python 及相关包的安装仅在初始设置时需要。
   1. 延时图像序列将在 Spyder 集成开发环境中使用自定义构建的 Python 脚本进行分析。要下载 Spyder IDE，请下载 Anaconda 发行版（https://www.anaconda.com/products/individual），其中包含 Spyder IDE 以及本分析所需的大多数库和包。
   2. 安装 Anaconda，并通过 Anaconda Navigator 启动 Spyder。
   3. 在 IPython 控制台标签页（位于 Spyder 右下角区域）中，复制并粘贴以下命令：pip install PySimpleGUI，然后按回车键。执行此命令将安装用于启动图形用户界面（GUI）所需的包。
   4. 在同一控制台中，复制并粘贴以下命令：pip install tifffile，然后按 Enter 键。执行此命令将安装用于将图像保存为 tiff 文件所需的包。
   5. 从补充文件或 GitHub 上获取所有 Python 脚本，最新版本地址为：https://github.com/ernestiu/Cell-spreading-analysis.git
3. 定量分析细胞铺展过程中的细胞面积和细胞形态参数
   1. 在 Spyder 顶部面板中选择“打开文件”选项，或使用快捷键 Ctrl + O，打开主分析脚本“cell_spreading_GUI.py”。
   2. 在顶部面板中选择“运行文件”，或使用快捷键 F5，启动细胞铺展分析 GUI 界面。
   3. 点击 细胞铺展面积 标签页（图 3A）。
   4. 使用浏览按钮选择待分析的 tiff 图像。
      注意：所选文件必须为 tiff 格式。
   5. 指定数据输出的保存目录（例如细胞掩膜、数值结果等）。
   6. 设置数据输出选项：
      1. 保存掩膜：保存分割过程中生成的细胞掩膜。
      2. 导出数据：将包含所有分析数据的 Excel 表格（.xlsx）导出至目标文件夹。
         所有铺展细胞的细胞面积、圆形度和长宽比将被保存为 Excel 表格并存储在目标文件夹中。细胞面积的计算公式为：
          
         细胞圆形度用于衡量细胞接近完美圆形的程度，其计算公式为：
          
         其中 A 和 P 分别表示细胞面积和细胞周长。细胞的长宽比反映了细胞的伸长程度。一个正常铺展的细胞其长宽比应接近 1。长宽比的计算公式为：
          
      3. 保存轮廓：将细胞边界轮廓叠加图像保存至目标文件夹。
   7. 设置分割参数
      1. 显示分割结果：在分析过程中于 Spyder 控制台中显示分割结果。
      2. 最小细胞面积（µm²）：输入细胞面积的最小值，包括细胞初始贴壁阶段的面积值。面积小于此阈值的对象将不被视为铺展细胞。该数值会影响分割过程。
   8. 设置图像参数。
      1. 采集时间间隔（s）：以秒为单位输入图像采集频率。
      2. 像素尺寸（µm）：输入在准备分析图像时记录的像素尺寸。
      3. 图像位深：输入相机/探测器的位深。
   9. 点击 运行。若出现错误，Spyder 控制台将显示错误信息；否则，图像分析过程将在控制台中显示。
      ​注意：在控制台或“绘图”区域（取决于 Spyder 设置）中出现的第一幅图像显示了视野中所有被识别的细胞。细胞周围的绿色框表示适合进行分割和分析的铺展细胞，灰色框表示不适合分析的细胞。已识别的铺展细胞总数也将在控制台标签页中显示。软件会绘制细胞面积（蓝色）和细胞圆形度（红色）随时间变化的曲线图。这些图表可用于评估细胞分割的准确性。成功的分割应产生一条单调递增的细胞面积曲线。为获得具有代表性的细胞铺展面积曲线，需手动去除曲线中的延迟期。延迟期指细胞开始铺展前的细胞面积测量阶段，其特征为快速波动，如细胞面积图中所示（图 3C 右图）。

6. 利用显微轨迹图量化细胞铺展过程中的细胞边缘动态

1. 在运行分析之前，裁剪扩散细胞的原始视频，以创建单个扩散细胞的时间序列。
   1. 使用 Fiji 工具栏中的 矩形 工具手动选择一个感兴趣区域（ROI），该区域应包含单个细胞。（为确保 ROI 完全包含扩散细胞，使用滚动功能检查所有时间点的 ROI。）
   2. 右键单击 ROI 并选择 复制。
   3. 勾选 复制堆栈，然后点击 确定。
2. 通过在 Spyder 工具栏中选择 打开文件 按钮或使用快捷键 Ctrl + O，打开主分析脚本 "cell_spreading_GUI.py"。如果 GUI 已经打开，请直接进入第 6.3 步。
3. 在顶部面板中选择 运行文件 或使用快捷键 F5，以打开细胞扩散分析 GUI（图 3B）。
4. 点击 动态图生成与分析 选项卡。
5. 使用浏览按钮选择用于分析的 tiff 图像。
   注意：专有文件格式（例如 nd2、lif、zen）不受该脚本支持。
6. 指定保存输出数据（细胞掩膜和数值）的目标文件夹。
7. 设置输出参数。
   1. 导出数据：将包含动态图中细胞边缘相对位置和回缩事件的 Excel 表格（.xlsx）导出至目标文件夹。
8. 设置图像参数：
   1. 采集间隔（s）：以秒为单位输入图像采集频率。
   2. 像素大小（µm）：输入在第 5.1.3 步准备图像时记录的像素大小。
   3. 最小细胞面积（µm²）：输入细胞面积的最小值，包括处于附着初期阶段的细胞面积。面积小于此阈值的对象将不被视为扩散细胞。该数值会影响分割过程。
   4. 图像位深度：输入相机/探测器的位深度。
9. 点击 运行。如果出现错误，Spyder 控制台将显示错误信息；否则，控制台将显示突出动态量化结果的摘要。将得到四组回缩频率和突出速度的测量值，这些值分别从细胞顶部、底部、左侧和右侧四个区域生成的动态图中提取。回缩频率的计算公式为：
    
   ​注意：该数值表示在细胞扩散过程中伪足回缩的频繁程度。平均突出速度通过动态图上突出起始点与平台期之间的斜率来测量。分割完成后，控制台将显示一张汇总的动态图。如需保存该汇总图，请右键单击图像并保存。

结果

上述方案描述了活细胞成像观察细胞铺展的实验步骤，以及用于定量分析细胞铺展动态的计算工具。该计算工具可用于低通量或高通量模式，以鉴定调控细胞前缘肌动蛋白聚合机制的分子参与者。

实验流程的示意图如图1所示。细胞铺展实验在稳定表达Akt蛋白激酶pleckstrin同源（PH）结构域（与eGFP标记融合）的永生化小鼠胚胎成纤维细胞上进行²⁵。细胞用胰蛋白酶-EDTA消化后，于悬浮状态下恢复45分钟。在恢复期间，细胞在质膜上重新补充了整合素受体，这由恢复后的细胞快速且同步地附着于纤连蛋白包被的盖玻片所证实（图2）。若无恢复期，铺展细胞表现出广泛的细胞大小分布，表明细胞铺展起始存在高度变异性（图2A 和B）。随后，将细胞接种于带有定位标记的盖玻片上，并通过转盘共聚焦显微镜观察其铺展动态（示意图见

讨论

本研究所述的细胞铺展实验能够持续追踪细胞形态变化（例如，细胞大小和形状）以及细胞边缘运动（即，突出速度和回缩频率），而这些特征在大多数细胞铺展实验方案中均未被涵盖^19,24。尽管常用的终点法细胞铺展实验可用于测定细胞铺展速度，但这类实验无法解析细胞边缘运动的时间动态过程。缺乏时间分辨信息限制了对片状伪足突出-回缩周期中变化的检测与定量分析能力。

我们的图像处理与分析软件可对铺展细胞进行高效分析，从细胞分割到数据量化均可完成。传统的细胞铺展手动图像分析通常需要人为设定阈值或应用自动分割算法，这种方法在需要分析大量图像的高通量实验中存在选择偏差，难以适用。因此，本软件被设计用于以自动化 方式检测和分割铺展细胞，并可同时量化细胞突起的动态行为及形态学参数。上述功能使得本方案适用于对调控片状伪足的信号通路及分子因子进行高通量筛选。

为确保对铺展细胞的分析具有稳健性和准确性，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶 (0.05%)，0.53 mM EDTA	Wisent Bioproducts	325-042-CL
10.0 cm 培养皿，聚苯乙烯，组织培养处理，带通气孔	Starstedt	83.3902
15 mL 高透明度聚丙烯离心管，锥底，带圆顶密封螺帽，无菌	Falcon	352097
适用于 22 mm × 22 mm 盖玻片的 1 孔 Chamlide CMS	Quorum Technologies	CM-S22-1
35 mm 组织培养处理易握式细胞培养皿	Falcon	353001
50 mL 离心管，透明，插塞密封	Nest	602002
6.0 cm 细胞培养皿，经处理以增强细胞贴附，无菌	VWR	10861-658
Arp2/3 复合物抑制剂 I，CK-666	Millipore Sigma	182515
相机，Prime 95B-25MM	Photometrics
二甲基亚砜，无菌	BioShop	DMS666
DMEM，1×，4.5 g/L 葡萄糖，含 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和酚红	Wisent Bioproducts	319-005 CL
DMEM/F-12，含 HEPES，无酚红	Gibco	11039021
D-PBS，1×	Wisent Bioproducts	311-425 CL
胎牛血清	Wisent Bioproducts	080-110
Fiji 软件	ImageJ
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
人血浆纤维连接蛋白纯化蛋白，1 mg	Millipore Sigma	FC010
浸油	Cargille	16241
L-谷氨酰胺溶液 (200 mM)	Wisent Bioproducts	609-065-EL
MEM 非必需氨基酸溶液 (100×)	Gibco	11140050
显微盖玻片，方形，No. 11/2，22 × 22 mm	VWR	CA48366-227-1
显微镜主体，Eclipse Ti2-E	Nikon
物镜，CFI Plan Apo Lambda 60X 油	Nikon	MRD01605
青霉素-链霉素	Sigma	P4333
转盘装置，Crest Light V2	CrestOptics
Spyder	Anaconda
载物台培养箱	Tokai Hit
统计分析软件，Prism	GraphPad
镊子，Style 2	Electron Microscopy Sciences	78326-42