靶向微泡的制备与表征

摘要

本实验方案的目的是制备、纯化并表征充满气体的微泡（用于超声分子成像的靶向对比剂）。文中描述了两种靶向系统：与链霉亲和素结合的生物素化微泡，以及可结合α_vβ₃（一种已知的肿瘤新生血管生物标志物）的环状RGD肽微泡。

摘要

针对微泡（分子成像用超声造影剂）的靶向研究已有二十多年历史。然而，微泡制备及靶向配体连接的方法繁琐、复杂且耗时较长。因此，有必要简化靶向微泡的制备流程，以推动其向临床转化迈进。本文旨在详细描述并解释靶向微泡制备、功能表征与检测所需的各个步骤。本文提供了两种系统的优化且简化的操作流程：一种为生物素-链霉亲和素靶向配对模型，另一种为环状RGD肽靶向肿瘤新生血管内皮过度表达的重组α_vβ₃蛋白系统。

本文展示了以下内容：将靶向配体共价偶联至脂质锚定物，评估试剂质量，以及验证反应成功完成的检测方法；制备含有微泡外壳组分的水相前体介质，随后通过融合形成微泡；评估脂质向微泡稳定外壳转移的效率；通过在常重力下浮选调节微泡粒径分布，以去除可能对体内应用有害的较大微泡；采用电阻区感应法评估微泡粒径分布；在静态结合实验（倒置培养皿中）中评估微泡与受体包被表面的靶向结合；以及在平行板流动腔实验中评估微泡与受体包被表面的靶向结合。

引言

利用靶向微泡进行分子成像的研究与测试已持续二十多年。其基本原理十分明确：将具有特定亲和力、可靶向疾病区域血管内皮分子生物标志物的载气微泡通过静脉注射进入体内。这些微泡在体内循环并富集于目标部位（例如肿瘤新生血管或缺血性炎症损伤区域），随后通过造影增强超声成像检测黏附的微泡。上世纪提出的这一概念性研究^1,2，如今正逐步迈向临床应用：数年前已进入中等规模的临床试验阶段^3,4。本文旨在基于两项已发表的研究实例^1,5，详细阐述此类靶向微泡的制备与表征方法。

制备靶向微泡关键组分——肽-聚乙二醇-磷脂的实验步骤，补充了试剂质量控制的相关说明，这是反应成功完成所必需的。遗憾的是，某些活性酯脂质试剂供应商提供的材料在到达时已发生水解，因而无法参与酰胺键的形成。本文还提供了在微泡制备过程中，有多少脂质材料从水相转移至微泡外壳的相关信息，以及获取该信息的技术方法。

制备粒径分布相对较窄的微泡非常重要：在用于血管内体内检测的注射介质中，若存在较大微泡，可能导致微血管阻塞；绕过肺分流的微泡发生非特异性聚集，可能引起非特异性的假阳性组织增强⁶，而通过去除较大尺寸的微泡可避免这一问题。因此，本文介绍了一种实现粒径筛选的简单操作步骤，并辅以使用颗粒计数器评估颗粒浓度和粒径分布的方法描述。

以下介绍的第一种微泡靶向性评估测试方案描述了一个纯模型系统，其中生物素化的微泡靶向结合到链霉亲和素包被的表面¹。第二种方案基于一篇论文，描述了肽靶向微泡的简化制备方法，该微泡修饰有环状RGD肽，能够特异性结合肿瘤新生血管的分子生物标志物α_vβ₃⁵。采用本方法制备的、修饰有环状[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys]（即c(RGDfK)）肽的微泡，已被证实可靶向肿瘤新生血管，并在小鼠肿瘤模型中实现超声分子成像。

方案

1. 肽与NHS-PEG-DSPE的共价偶联

1. 将c(RGDfK)肽（赖氨酸的伯ε-氨基未保护且可用于偶联）溶解于二甲基亚砜（DMSO，10 mg/mL）中。配制聚乙二醇-3400-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS-PEG-DSPE，200 mg/mL）的甲醇或氯仿溶液，并加入至1 mg溶于DMSO的肽中。再加入3 μL N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）。
   1. 保持肽与NHS-PEG-DSPE的摩尔比至少为1:1.2，以确保所有伯氨基均可参与反应。保持DIPEA与肽的摩尔比至少为2:1，以保证反应体系呈碱性。
      警告：氯仿、甲醇和DIPEA为危险化学品。操作时应采取适当防护措施，如佩戴手套、实验服、护目镜，并在通风橱内进行。
      备注：可使用其他含有伯氨基的肽或模拟物替代c(RGDfK)，只要其N端未保护或赖氨酸位于结合位点之外即可。为使反应顺利进行，所有组分（即靶向配体和脂质）必须可溶于DMSO-氯仿混合溶剂。也可尝试其他溶剂，如二甲基甲酰胺或其混合物。在水相介质中反应亦可行，但由于活性酯易迅速水解，偶联产率将显著降低。
2. 室温下避光孵育过夜后，通过蒸发去除挥发性有机溶剂（可使用氮气流或旋转蒸发仪，随后在高真空泵下过夜抽干以彻底去除DMSO）。将非挥发性残留物重新溶解于氯仿中，浓度为1 mg/mL，以便精确取样。
3. 通过薄层色谱法（TLC）确认反应是否完成（使用氯仿:甲醇=2:1 v/v的溶剂系统展开TLC板）。将TLC板置于150 °C加热板上加热后，用茚三酮喷雾检测伯氨基的存在与否。
   警告：茚三酮为危险化学品。操作时应采取上述防护措施。TLC板的加热处理必须在通风橱内进行。加热板存在火灾隐患。
4. 在制备微泡前，从氯仿溶液中取出一份肽-PEG-DSPE样品（例如1 mL，1 mg/mL），在氮气流下吹干氯仿，随后在高真空泵下进一步干燥，再加入生理盐水至终浓度为1 mg/mL，得到透明的胶束溶液。
   1. 若需进一步纯化反应产物，可将其重新溶解于生理盐水中，然后将所得胶束溶液进行透析（分子量截留值为6–8 kDa或相近规格），先对生理盐水透析，再多次更换去离子水进行透析。
   2. 通过检测透析液的电导率确认透析是否完成。将透析后的样品从透析袋中取出，置于已知质量的样品瓶中，冷冻干燥至完全干燥。
      备注：存在另一种共价连接配体至PEG-脂质末端的方法（例如，马来酰亚胺-PEG-DSPE与含巯基配体的反应）。该方法的主要优势在于定向偶联，前提是配体分子上仅有一个游离巯基⁷。主要问题是长期稳定性：马来酰亚胺与巯基形成的连接可能因逆迈克尔反应而降解，具体取决于储存条件⁸。
      备注：不同厂家提供的活性酯试剂质量差异较大，其性能可能受运输和储存条件影响（若试剂未妥善保存或运输，活性酯可能发生水解，无法与肽有效偶联）。因此，有必要描述一种用于评估NHS-PEG-DSPE（一种用于将靶向配体共价连接至微泡的试剂）降解程度的实验方法（见下文）。NHS-PEG-DSPE以氩气保护下的冻干粉末形式提供，应储存于超低温冰箱中。使用时将试剂瓶恢复至室温（避免水分冷凝），用分析天平准确称取所需量，并溶于甲醇或DMSO中。大包装试剂瓶在取样后应重新在氩气下密封，并置于含干燥剂的密闭容器中，放回超低温冰箱保存，以备后续使用。
   3. 通过将干燥试剂直接加入水相生理盐水中并孵育，制备肽-PEG-DSPE（步骤1.4）以及生物素-PEG-DSPE的水相胶束溶液。将形成小球形胶束。为加速试剂从固态向胶束形态的转化，可采用超声处理或热水浴辅助溶解。
5. 评估NHS-PEG-DSPE活性酯试剂的质量。
   1. 确认试剂中的NHS以活性酯形式存在，能够与伯氨基发生偶联反应形成酰胺键。
   2. 在分光光度计中，取0.99 mL 0.1 M pH 9.2的四硼酸钠缓冲液，加入石英或紫外透明塑料比色皿（不可使用玻璃比色皿），在260 nm波长处调零。
   3. 向比色皿中加入10 μL新配制的200 mg/mL NHS-PEG-DSPE甲醇溶液，同时启动计时器。迅速剧烈混匀内容物以确保均匀，将比色皿放入分光光度计中，盖上盖子，开始测量。
   4. 在分光光度计开始测量时记录起始时间，并持续每隔10秒测定一次260 nm处的吸光度，持续约10分钟，或直至吸光度值趋于稳定。
   5. 绘制动力学曲线，检查初始A₂₆₀ 时间点数据，并将曲线外推至反应起始时刻（即确定NHS-PEG-DSPE加入水相缓冲液、水解反应开始时的A₂₆₀值）。假设在将NHS-PEG-DSPE加入比色皿缓冲液之前，由于有机溶剂中无水，未发生水解反应。
   6. 计算反应开始时与水解完成时A₂₆₀的比值，该比值代表已降解的活性酯所占比例。利用此信息确定用于完全修饰肽中伯氨基所需的NHS-PEG-DSPE的合适用量。

2. 通过融合法制备微泡

1. 生物素化微泡的制备
   1. 将二硬脂酰基磷脂酰胆碱（DSPC）和聚乙二醇硬脂酸酯在丙二醇（PG）中共同溶解（每种物质在纯溶剂中的浓度为 10 mg/mL）。使用热水浴使材料溶解。
   2. 取 0.1 mL 上述热 PG 溶液加入含有 0.85 mL 热生理盐水的西林瓶中，迅速混合，并按与 DSPC 质量比 1:20 的比例加入胶束状生物素-PEG-DSPE 溶液（50 μL，1 mg/mL 生理盐水溶液）。
      注意：脂质组分在 PG 中的溶解度具有温度依赖性，因此必须使用热水浴。在加入脂质前，将盛有生理盐水的玻璃西林瓶预先在热水浴中加热，有助于形成均匀体系，避免可见颗粒出现。
   3. 将西林瓶冷却至室温，将橡胶塞半插入瓶口，并将聚四氟乙烯（PTFE）毛细管插入瓶内。通入十氟丁烷气体以填充瓶内空间，随后拔出毛细管并完全封闭橡胶塞。
      注意：在融合过程中，西林瓶的温度可能显著影响最终微泡的粒径分布 ⁹。
   4. 在室温下对加塞的西林瓶进行压封，并将其放入融合仪中。启动融合仪。所用临床设备预设为 4300 rpm 运行 45 秒。
   5. 融合完成后，从融合仪中取出含有微泡的西林瓶。建议对微泡的粒径分布和组成进行表征，并在制备后数小时内尽快使用。
2. 肽修饰微泡的制备
   1. 将 DSPC 和聚乙二醇硬脂酸酯在纯 PG 中共同溶解（每种物质浓度为 10 mg/mL），使用热水浴助溶。取 0.1 mL 上述热 PG 溶液加入含有 0.85 mL 热生理盐水的西林瓶中，迅速混合，并按与 DSPC 质量比 1:20 的比例加入胶束状肽-PEG-DSPE 溶液（50 µL，1 mg/mL 生理盐水溶液）。
   2. 将西林瓶冷却至室温，在瓶口放置橡胶塞（半插入），并将聚四氟乙烯（PTFE）毛细管插入瓶内。通入十氟丁烷气体填充瓶内空间，随后拔出毛细管并封闭橡胶塞。
   3. 对加塞的西林瓶进行压封，并放入融合仪中混合。微泡分散液在 45 秒内即可制备完成。
3. 用于评估脂质向微泡壳层转移的染料标记脂质微泡的制备
   1. 按照上述方法，在纯 PG 中共溶 DSPC 和聚乙二醇硬脂酸酯（使用热水浴），每种物质浓度为 10 mg/mL。
   2. 取 0.1 mL 上述热 PG 溶液加入含有 0.89 mL 热生理盐水的西林瓶中，迅速混合，加入 10 μL DiI 染料溶液（1 mg/mL，溶于纯 PG），混匀，然后将西林瓶冷却至室温。
   3. 如上所述，用十氟丁烷气体填充西林瓶顶部空间，加塞、压封并进行融合处理。

3. 检测DiI脂质从胶束水相介质向气泡壳的转移

1. 为通过显微镜确认荧光脂质材料已从水相转移至微泡外壳，使用胰岛素注射器穿过瓶塞吸取一份微泡样品。
   1. 然后将一滴样品滴加到载玻片上，并用标准盖玻片覆盖。首先用一滴脱气生理盐水稀释样品。
   2. 使用配备荧光落射照明装置、100倍油镜和高灵敏度视频相机的视频显微镜进行观察。
2. 为测定在融合过程中脂质材料从水相生理盐水/丙二醇（PG）介质向气泡外壳转移的效率，取一支密封的微泡小瓶，将其倒置并放入一个50 mL锥形管中。
   1. 在水平转子离心机中离心（10分钟，200 × g）。离心结束后将小瓶从离心机中取出，并保持倒置状态。
   2. 将胰岛素注射器的针头插入倒置小瓶的瓶塞中，缓慢吸取少量澄清的下层液体（约50 μL）。
      NOTE：离心后从倒置小瓶中吸取下层液体时，针头斜面必须尽可能靠近瓶塞，以最大限度减少吸入微泡的可能性。
3. 将下层液体样品（2 μL）以及用于生成微泡的原始脂质-丙二醇-生理盐水介质样品（2 μL）分别加入96孔板中，每孔加入0.1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）与乙醇1:1混合液，并含1% Triton X-100。
4. 使用荧光酶标仪检测DiI染料的红色荧光（激发波长555 nm，发射波长620 nm）。
   1. 荧光光谱检测应使用底部不透光的黑色酶标板，因其背景信号较低，且可避免透明板可能出现的孔间信号串扰问题。
   2. 确保荧光信号处于线性校准范围内：孔中染料浓度过高可能导致光衰减，从而低估实际信号强度。
      ​NOTE：有时可能需要去除融合后残留在水相中的外壳材料。为此，在微泡上浮离心后，将倒置小瓶中的全部下层液体缓慢吸出，并用脱气的生理盐水替代。为避免因液体移除或添加导致小瓶内环境压力剧烈变化，可在瓶塞中插入另一根较长的针头，使其达到小瓶内的气相部分。为维持小瓶内的气相环境，应先将该针头连接至装有氟碳气体的注射器，以防止空气接触微泡制剂。

4. 微气泡尺寸分布的调节

1. 使用正常重力浮选法，在静止倒置的小瓶中调节微泡的尺寸分布，即快速高效地去除最大的微泡 ^5,10。
2. 按照第2节所述方法制备微泡后，立即取一支微泡小瓶，将其倒置并垂直放置在稳定且无振动的表面上，静置15–20分钟。
3. 孵育结束后，在小瓶仍处于倒置状态时，将胰岛素注射器针头插入小瓶隔膜，从下层轻柔吸取300–500 μL微泡。
   注意：注射器针头必须紧贴隔膜内表面，以避免吸入位于液体上层附近较大的气泡。
   1. 缓慢回拉注射器活塞，以避免在注射器内部产生湍流和静水压导致气泡膨胀。当将采集的样品从注射器中取出时，应避免施加过高压力，以防气泡破裂。
4. 将注射器中的微泡分散液转移至小体积小瓶中，随后充入全氟化气体，加塞并压盖，用于短期储存、颗粒计数（见下文）及后续使用。
   1. 若直接从注射器中取样，应将注射器水平持握并轻轻旋转，以避免气泡上浮，确保样品均匀性。

5. 微泡尺寸分布评估

1. 使用颗粒计数器（基于电阻感应原理或光遮蔽原理）评估颗粒的粒径分布和浓度。或者，使用血细胞计数板和显微镜进行检测。
   1. 简而言之，将微泡样品等分试样加入含正常生理盐水或等渗液的计数室（通常体积为60–100 mL）中并进行计数。比较浮选纯化前后微泡的粒径分布。
      注意：取样前应立即对小瓶进行轻柔混匀（切勿涡旋振荡），以获得具有代表性且可重复的测量结果。应从测试体积的中心位置取样。
   2. 将至少60 mL的0.9%生理盐水稀释液加入100 mL烧杯中，并将其置于电阻力感应仪器的载物台上。升起载物台，使管道、外电极板和搅拌器完全浸入稀释液中，且搅拌器能够自由旋转。
      注意：烧杯中稀释液体积可通过称重法使用天平精确测定（生理盐水密度接近1）；也可使用计量泵。在电学区带感应研究过程中，电极应完全浸入溶液中。
   3. 在仪器控制软件中记录稀释电解质的体积。电感应区计数器配备有50 µm孔径，可用于测量直径在1至30 µm范围内的颗粒。首先进行空白运行，0.5 mL稀释液作为空白样，计数应少于5000个；最佳空白水平可低于100个计数。
   4. 在仪器控制软件中设置样品体积，以计入稀释因子。向烧杯中加入10–20 µL微泡混合物，然后进行第二次运行。
   5. 利用背景尺寸分布数据进行校正 "减去背景运行" 使用软件中的功能，获取原始微泡样品中颗粒的浓度，单位为颗粒数/毫升（particle number/mL），结果需包含稀释因子。
      1. 移液器吸头的外表面在取样过程中也可能附着气泡；在将吸头插入计数培养基之前，务必将其擦拭干净。切勿用擦拭纸接触移液器吸头的开口处。
      2. 在计数过程中应避免样本颗粒稀释不足，以尽量减少重合校正问题；当多个颗粒同时进入传感器小孔时，系统可能会低估颗粒浓度。
         注意：用于颗粒计数的孔径直径可能有所不同。选择50 μm孔径可检测直径低至1 μm的微泡，且相较于更小直径的孔径，不易发生堵塞。
      3. 使用与实际检测相同的稀释液测试介质（例如，经无菌过滤的生理盐水灌洗液）校准电阻脉冲计数仪。激光遮蔽法作为电阻脉冲计数的替代方法，其优势在于无需使用盐浓度和电导率受控的过滤生理盐水。

6. 在体外黏附/滞留实验中检测微泡的靶向性

1. 准备用于微泡靶向培养皿的生物标志物受体表面。
   1. 取直径为35 mm的聚苯乙烯培养皿作为靶向表面。利用蛋白质在正常生理盐水中对聚苯乙烯培养皿表面的非特异性吸附特性。使用链霉亲和素作为模型蛋白，用于测试含有生物素-PEG-DSPE壳成分的生物素化微泡的靶向性。
   2. 在每个培养皿中央滴加一滴链霉亲和素溶液（0.2 mL，10 μg/mL PBS溶液），并用22 mm × 22 mm的塑料盖玻片覆盖，以实现培养皿表面的均匀包被。在4 °C下于密闭湿润环境中过夜孵育，防止培养皿干燥，随后移除盖玻片。
   3. 立即并彻底用水和PBS洗涤培养皿，并在PBS中加入1.5%牛血清白蛋白（BSA）孵育至少4小时，以最大限度减少微泡在未包被区域的非特异性吸附。使用经1.5% BSA封闭的洁净培养皿作为对照。
   4. 或者，使用重组α_Vβ₃受体溶液（例如，PBS中4 µg/mL）⁵替代链霉亲和素。通过连接在微泡壳上的环状RGD肽配体，将微泡靶向至该生物标志物。
   5. 保持沉积有靶向受体的培养皿湿润：若受体蛋白干燥，可能失活。
      注意：必须使用无载体蛋白的受体蛋白，即不含任何载体蛋白或表面活性剂的介质——这些成分的存在会抑制吸附。
2. 微泡在小液滴中的黏附：在静态条件下快速检测靶向黏附。
   1. 将微泡悬液（5–20 μL）从下方滴加至倒置的培养皿中的靶向表面（或仅含BSA的对照表面），使微泡通过浮力上浮至受体包被的表面。
   2. 将倒置的培养皿在湿润环境中孵育5–10分钟后，将其恢复至正常位置，加入PBS并轻轻冲洗以去除未结合的微泡。通过明场显微镜观察评估靶向黏附情况。
3. 微泡在培养皿表面的黏附：在完整培养皿中进行靶向实验¹。
   1. 取已包被受体表面的培养皿，完全填充脱气的PBS-BSA缓冲液（35 mm培养皿需超过10 mL），使液面略高于培养皿边缘，并依靠毛细作用力维持液面。将微泡（50 μL）注入缓冲液主体中，并迅速混合以达到均匀分布。混合过程中避免产生气泡。
   2. 迅速在培养皿上覆盖一段透明包装胶带或细胞培养板封板膜，并在其背面贴附一块平整的塑料片。将薄膜压紧密封，将"组装体"倒置，静置30分钟，使微泡上浮并与靶向表面接触并黏附。
   3. 将密封的培养皿"组装体"恢复至"倒置状态"，移除密封膜，并用脱气缓冲液冲洗以去除未黏附的微泡。通过显微镜或超声成像观察靶向黏附的微泡。
      ​注意：当完全充满微泡分散液的倒置密封培养皿进行孵育时，可将其略微倾斜放置，以便任何较大的气泡浮至培养皿边缘，远离中心感兴趣区域。在显微镜观察期间，可通过微量移液器尖端施加快速流体冲洗，以评估微泡在靶向表面的黏附牢固程度（在缓慢流动下，对照表面的微泡即会完全脱落）¹¹。优先使用脱气缓冲液稀释微泡，因为溶解气体过量会导致微泡不受控地生长。

7. 体外检测微泡靶向性：在平行板流动腔中评估动态黏附/滞留实验

注意：我们通过超声成像检测生物素化微泡与链霉亲和素层之间的黏附性。

1. 使用市售的平行板流动腔和定制的倒置支架，观察流动介质中微泡对35 mm培养皿的靶向黏附。在目标蛋白吸附到培养皿后（见6.1.1），将预装密封垫的腔体插入培养皿中，并在支架内密封。使用通道高度（即密封垫厚度）为0.127 mm、通道宽度为2.5 mm的密封垫。
   注意：在组装平行板流动腔时，密封垫上使用的硅脂应尽量少。切勿让硅脂进入通道区域，避免覆盖生物标志物蛋白包被的表面。为实现良好的密封效果，应仔细选择35 mm培养皿（参见材料表中关于流动腔和培养皿的信息）。
2. 在组装流动腔时，不要将固定培养皿-流动腔组合的盖子和框架拧得过紧，以防止泄漏。
3. 将流动管路连接至以抽吸模式运行的注射泵，在供液端通过磁力搅拌器持续搅拌的情况下，将细聚乙烯管（PE50）连接至含有稀释微泡分散液的小瓶¹²。通过调节泵的体积流速，根据公式 6Q/bh² 控制腔体的壁面剪切率（WSR），其中 Q 为流速，'b' 为通道宽度，'h' 为通道高度。
   注意：在灌注含微泡的介质或PBS前，必须清除整个系统中的气泡，因为任何通过通道的气泡都会使黏附在靶表面的微泡脱落，导致实验无效。流动腔管路与注射器之间的连接必须密封良好。
4. 通过将计算体积的浓缩微泡加入微泡储液器（20 mL闪烁瓶）中，制备微泡分散液，使PBS缓冲液（含0.1% BSA）中微泡浓度达到10⁶ 个/mL。将供液储液器置于磁力搅拌板上，放入一根1 cm × 2 cm的磁力搅拌子，以约400 RPM的速度搅拌，以在整个实验过程中维持分散均匀性。
5. 在水槽中对流动腔进行超声成像¹³。
   1. 将流动腔组件浸入脱气水中，并用重物固定，防止实验过程中发生移动。
   2. 将成像探头夹持在通道正上方，并向后倾斜15°角，同时顺时针旋转5°角，以最小化培养皿表面的镜面反射。将流动腔通道置于成像平面内。
   3. 采用以下成像参数：15L8换能器，特异性对比成像模式，动态范围50 dB，频率7 MHz，机械指数（MI）= 0.18，CPS增益 = 0。在整个图像范围内保持时间增益补偿一致。
   4. 将换能器表面接触水面，不要深度浸入。或者，可使用充满超声耦合凝胶的橡胶保护套。
      注意：为确保流动腔系统在成像时位置可重复，应在水槽上或超声系统屏幕上标记定位标记。
6. 将微泡分散液从储液器经流动腔吸入泵中，持续2分钟。
   1. 切换为PBS流动，以清除通道中未黏附的微泡，并评估剩余黏附（靶向）微泡的声学背向散射。为获得背景图像，将MI提高至1.9，以在超声成像视野中破坏黏附的微泡。
      注意：重复实验时应更换微泡分散液：在高稀释状态下，微泡会随时间逐渐降解。
7. 从屏幕录制的视频流中导出单独图像：PBS冲洗前、冲洗后及破坏后的图像，用于导入ImageJ进行离线分析。选择感兴趣区域（ROI），排除流动腔的入口和出口部分。在扣除背景ROI信号后，以ROI内的平均像素强度量化回波强度。
   注意：除超声成像外，还可通过视频显微镜观察微泡在靶表面的黏附情况，即将倒置支架中的平行板流动腔组件置于复合显微镜载物台上进行录像^5,11,12,14。该方法特别适用于成像微泡对细胞表面生物标志物受体的靶向黏附，当受体表达细胞在组织培养皿上生长时，可直接计数结合到每个靶细胞上的微泡数量。

结果

多肽与脂质的共价偶联
通过薄层色谱（TLC）确认反应完成及目标产物的生成。单独设置的未反应多肽对照在TLC中未发生迁移：其停留在起始位置，并且经茚三酮喷雾加热后显示为氨基阳性斑点。在反应完成后，对反应混合物样品进行TLC分析，除去DIPEA、DMSO并重新溶解于氯仿后，该茚三酮阳性的游离多肽斑点不再出现。关于NHS酯试剂质量这一关键问题，图1展示了水解动力学的分光光度追踪曲线，其中零时间点为反应开始时刻，即有机溶剂中的NHS酯加入比色皿的时刻。该结果证实了羧基-PEG-DSPE的NHS活性酯具有功能活性（见方法部分第1节）。在零时间点，外推得到的A₂₆₀=0.33代表在测试前已发生水解的物质。在水解反应完成时（超过10-15分钟），A₂₆₀=1.54（此时吸光度不再显著上升），进一步证实了活性酯的存在。同时提供了定量数据：超过78%的材料未发生预水解，仍为有效的NHS酯，因此可在适当调整试剂用量的前提下成功用于多肽偶联。

脂质材料从水相介质制备并转移至气泡壳层：荧光脂质
本研究所用微泡含有微量（低于1%）荧光染料DiI，该染料具有特征性红色荧光，以丙二醇（PG）溶液形式加入DSPC和聚乙二醇硬脂酸酯的生理盐水-PG溶液中。所得微泡在显微镜下使用绿光激发和红光发射滤光片时，可清晰显示壳层荧光（见 图2，左图）。可将微泡气相的明场显微图像（图2，右图）与微泡壳层荧光图像进行对比。为定量评估脂质材料从水相向气泡壳层的转移情况，采用离心法使微泡上浮，并将上清液相的荧光信号与微泡融合前初始溶液的荧光信号进行比较。结果观察到荧光信号下降近一个数量级（图3），即通过融合过程，超过85%的脂质材料已转移至微泡壳层。

微泡的制备及粒径分布校正
通过融合生成的微泡表现出典型的粒径分布特征，浓度较高（例如，生物素化微泡约为 ~4.8 × 10⁹ 个粒子/mL）。粒径分布较宽，粒子分布在可测范围内（1 至 30 µm）；约 6.3% 的微泡直径超过 5 µm（图4，绿色曲线）。较大的微泡经血管内给药后可能在毛细血管中非特异性积聚，应避免使用。将倒置的小瓶在常重力条件下进行短暂浮选（15–17 分钟），随后收集靠近隔膜表面的 0.3 mL 液体，可完全去除较大微泡，同时总粒子浓度仅轻微下降，降至约 ~4.6 × 10⁹；浮选后，纯化样品中仅有 0.01% 的粒子直径超过 5 μm（图4，红色曲线）。

微泡与受体包被表面的黏附：静态实验
该方法最早于上个世纪被首次描述¹，现已被用作快速验证靶向微泡功能性的检测手段。实验中使微泡接触携带受体的培养皿表面。若发生配体-受体相互作用，即使经过剧烈冲洗，微泡仍可保留在表面。本文展示了一个典型示例：c(RGDfK)-微泡在重组α_vβ₃包被表面的功能性黏附快速检测。 图5 展示了在PBS冲洗去除未结合微泡后，培养皿受体表面黏附微泡的代表性明场显微图像。在此类显微观察中，微泡呈现为深色圆形结构。在相同条件下，若表面仅包被白蛋白（用于阻断非特异性黏附），则微泡不会发生黏附，即使轻柔冲洗也极易被完全洗脱。

流动介质中微泡的结合：平行板流动腔
该方法最初被提出作为在可控流动条件下研究细胞黏附的工具¹⁵，数十年后被改进用于微泡靶向性的研究¹¹。与静态实验相比，在流动系统中进行测试更接近临床成像的实际场景，因为在血流中循环的微泡会短暂接触血管壁，若存在靶向受体，则可能发生黏附。本文展示了两项此类研究的示例。第一个示例为较为传统的方法，通过视频显微镜监测肽修饰微泡在受体包被表面的黏附情况。显微镜可区分黏附的微泡与流动中的微泡，并可在显微成像视野中对黏附微泡进行定量：与对照组（使用错序肽c(RADfK)或仅以BSA包被表面）相比，c(RGDfK)微泡（左列）在表面的黏附数量显著更多（图6）。

第二个例子是使用超声造影成像检测涂有链霉亲和素的培养皿（图7，右侧），生物素化的微泡可从流动介质中成功吸附到该培养皿表面，并在用PBS冲洗后仍可通过超声造影成像检测到。对照组培养皿表面未保留任何黏附的微泡，因此在PBS冲洗后，几乎所有超声造影信号均被清除。超声造影信号的定量分析显示，两组间差异具有高度统计学显著性；靶向信号与对照信号的比值超过一个数量级。

图1．通过分光光度法在260 nm波长下检测碱性环境中NHS的释放，观察NHS-PEG-DSPE活性酯的水解动力学。 零时间点是指将溶于有机溶剂的NHS-PEG-DSPE加入0.1 M硼酸盐缓冲液（pH 9.2）的时刻。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2．气体微泡融合后的显微观察。 左图：荧光显微镜图像（绿色激发，红色发射，DiI 脂质壳染料）；右图：明场显微镜图像（观察气相），放大倍数相同。图像帧宽度为 85 μm（每幅图像右下角嵌入 10 μm 阶梯测微尺）。 请点击此处查看该图的高清版本。

图3。微泡制备介质中DiI脂质染料样品在融合前（右）和融合后通过离心浮选去除微泡（左）的荧光光谱分析。 荧光激发波长：555 nm，发射波长：620 nm。数据以均值±标准差表示。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4。汞齐化制备后微泡数量浓度的粒径分布（绿色），经后续常规重力浮选去除大微泡后的结果（红色），以及仅稀释剂的背景计数（蓝色）。 采用正常生理盐水进行电区感应颗粒计数，使用50 µm孔径。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5. 在涂有α的培养皿上，通过明场显微镜观察c(RGDfK)-微泡_vβ₃. 图像帧宽度为106 μ米 比例尺为10 μm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 6. 体外平行板流动腔实验中，肽修饰微泡靶向结合至包被重组α_vβ₃的表面。经 cRGDfK 修饰的微泡在培养皿表面高效黏附（左）；对照非靶向性 cRADfK（错序序列，中）微泡的黏附量极少（p<0.00005），仅包被白蛋白的对照表面微泡滞留量亦极低（右，p<0.0025）。腔室流动壁面剪切应力为 1 dyn/cm²。通过视频显微镜监测微泡黏附情况，图中显示视野内的颗粒数量。累积时间为 4 分钟。数据以均值 ± 标准差表示。经美国化学会许可转载⁵。版权，2018 年。 请点击此处查看此图的放大版本。

图7。链霉亲和素包被培养皿上生物素化微泡靶向黏附并经缓冲液冲洗后，平行板流动腔的对比超声成像（中图：黏附的靶向微泡；右图：同一培养皿经高机械指数超声爆破后）；仅包被白蛋白的对照培养皿（左图）。在450 s^-1剪切速率下，灌注微泡分散液（PBS/BSA，10⁶ 粒子/mL）2分钟，随后进行缓冲液冲洗。通过视频帧中感兴趣区域在扣除背景后的超声信号进行定量分析。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

配体修饰微泡制备的简便技术的重要性显而易见。采用Unger等人首创的汞齐化技术（amalgamation technique）制备微泡¹⁶，由于多种原因，可能实现这一目的。使用汞齐化仪制造微泡操作简便，可获得体积小、台式、单相120 V的设备，价格低廉。该过程快速（45秒）且高效：可一次性制备1 mL水相介质中的微泡分散液，每毫升含有数十亿个微粒，完全满足科研需求。微泡在密封小瓶中制备，瓶内顶部空间为全氟化气体。如有需要，自无菌灌装开始，经制造（汞齐化）过程直至使用前，瓶内内容物均可保持无菌状态。这使得该方法适用于临床应用，因其无需在临床环境中专门的无菌条件下进行复杂的准备工作。

该过程基于自组装原理：在混合过程中，当对移动小瓶内的气-水界面施加高剪切力时，会形成微小的气体碎片，这些碎片由于表面张力的作用而呈现球形。PG作为助表面活性剂，以高浓度存在于介质中，可降低表面张力以及在剪切过程中形成气-水界面所需的能量。随后，其他更“经典”的表面活性剂（如PEG化脂质和磷脂）到达界面，这些表面活性剂浓度较低，可能取代PG并在气泡表面形成单分子层。该外壳具有一定的稳定性，这可能归因于“固态”脂质（DSPC的相变温度为56 °C，因此不易发生膜间融合）以及包裹微泡的伸展型PEG刷状层共同作用的结果，后者可抑制相邻气泡单层膜之间的直接接触。可以推测，介质中高浓度PG的存在可能会降低微泡外壳的稳定性。在不含PG的情况下，微泡在密封小瓶内的氟碳气氛中可稳定保存数月，仅发生适度的融合现象。对于临床应用，可在床旁使用小型 amalgamator 装置，使微泡制备与使用之间的时间间隔缩短至数分钟或数小时。当介质中含有PG时，微泡浓度在冷藏储存数小时内未见显著下降。

所述方法的一个额外优势在于脂质向外壳转移的效率较高（通过在气泡制备介质中使用PG助表面活性剂实现），转移效率超过85%（>85%），而传统的超声处理仅能达到约20%的效率⁵，现代微流控方法的效率甚至更低¹⁷。高转移效率的重要性不仅在于减少了脂质材料和昂贵配体的浪费，还在于最大限度地降低了介质中游离、无气泡的配体含量。这样，游离配体可能就不会占据微泡本应通过其表面配体结合的生物标志物靶标受体。靶血管上生物标志物受体的总量通常较高，因此这一点可能并非至关重要。根据现有的专利文献¹⁸推测，在临床测试中的微泡制剂中，至少有50%的脂质外壳材料和靶向配体可能与气泡外壳相关联。这一点可大致与核医学受体成像研究中广泛使用的放射性标记抗体或肽类进行比较：即使在报道的最高比活性情况下，大多数靶向配体分子实际上并不携带“放射性”同位素¹⁹；而靶向微泡在此研究中的外壳材料（包括配体-脂质）则主要附着在微泡上。

通过该技术制备的靶向微泡在体外两种靶向模型中均表现出选择性黏附能力：静态黏附实验和平行板流动腔靶向实验。在静态实验中，靶向微泡紧密黏附于靶受体层，经缓冲液冲洗后仍牢固附着，而在对照条件下，微泡即使经过轻微冲洗即从表面脱落。同样，在平行板流动腔中进行的流动实验显示，与仅包被白蛋白的对照表面相比，生物素化的微泡在聚苯乙烯培养皿的链霉亲和素层上表现出统计学显著且优异的黏附能力。在静态黏附实验和平行板流动腔实验中，肽段c(RGDfK)修饰的微泡均能选择性地黏附于α_vβ₃包被的表面。

以下问题可被视为本方案的局限性。首先，该方法未考虑亚微米级颗粒。本研究中使用的仪器未设置为检测纳米气泡（即直径小于1 μm的颗粒）。这些颗粒可能存在于制剂中。尽管已知纳米气泡的声学背向散射信号通常较弱，且本研究中通过显微镜未观察到此类颗粒，但仍应考虑其存在的可能性。第二个重要问题是微泡的尺寸异质性。尽管已去除较大颗粒，但所得微泡的尺寸仍远未达到均一。这一点应作为微泡制剂领域进一步研究的考虑因素和依据。

综上所述，本文所述的方法应能提供足够的技术细节，以便快速、简便地制备靶向微泡。文中给出了进行额外纯化（如需要）、调节微泡尺寸和/或评估残留在水相中少量壳材料的步骤。同时详细描述了用于评估微泡参数（如粒径分布和浓度）以及配体修饰微泡在体外与靶标受体结合能力的分析工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
混悬器	Lantheus，马萨诸塞州比勒里卡	Vialmix	ESPE Capmix、Wig-L-Bug 或其他可达到 4300 rpm 的混悬器均可使用
生物素-PEG3400-DSPE	Laysan Bio，阿拉巴马州阿拉伯	Biotin-PEG-DSPE-3400
牛血清白蛋白（BSA）	Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆	BP1600-100 或类似产品
无钙镁磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆	14190-144
带吊篮转子的离心机	IEC/Thermo，Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆	NH-SII	任何带有吊篮转子的离心机均可
氯仿	Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆	C297-4
环状（RGDfK）肽	AnaSpec，加利福尼亚州弗里蒙特	AS-61111
十氟丁烷	F2 Chemicals，英国普雷斯顿	CAS 355-25-9
DiI	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	468495-100MG
DIPEA	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	387649
一次性紫外比色皿，1.5 ml	BrandTech，康涅狄格州埃塞克斯	759150
DMSO	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	276855
高温干式恒温器	Techne Cole Palmer，英国斯塔福德郡	DB-3A
DSPC	Lipoid，德国路德维希港	LIPOID PC 18:0/18:0
荧光微孔板读板仪	Molecular Devices，加利福尼亚州圣何塞	Spectramax Gemini XS	已停产，由 Gemini XPS 取代；任何具备红色染料检测能力的荧光板读板仪均可使用
配备落射荧光照明的显微镜	Leica	Laborlux 11	已停产；任何荧光显微镜均可满足要求；图像流采集需配备高灵敏度摄像机
NHS-PEG3400-DSPE	NOF-America，纽约州怀特普莱恩斯	SUNBRIGHT DSPE-034GS	部分替代厂商提供的产品在到货时可能已大部分或完全水解
用于薄层色谱板的茚三酮喷雾剂	BVDA，荷兰哈勒姆	AS-72177
生理盐水灌注液（0.9% NaCl）	Baxter，伊利诺伊州迪尔菲尔德	2F7124
适用于 35 mm Corning 培养皿的平行板流动腔	Glycotech，马里兰州盖瑟斯堡	31-001	可能仅适用于 Corning 培养皿，由于尺寸差异，可能不适用于其他厂商产品
粒径分析系统	Beckman Coulter，佛罗里达州海厄利亚	Multisizer 3	已停产，由 Multisizer 4 取代，采用类似的电阻脉冲传感原理。也可选用光学方法，例如 Accusizer
PEG 6000 单硬脂酸酯	Kessco Stepan，伊利诺伊州乔利埃特	CAS 9004-99-3
培养皿，直径 35 mm，高 10 mm	Corning，纽约州康宁	430165
塑料盖玻片，22×22 mm	Cardinal Health，伊利诺伊州麦高公园	M6100
丙二醇	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	P4347
无载体重组小鼠 alphavbeta3	R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯	7889-AV-050
橡胶塞，13 mm	Kimble-Chase，新泽西州维尼兰	W017900
血清小瓶，2 ml，13 mm	Kimble-Chase，新泽西州维尼兰	223683
硅胶薄层色谱板，F254	Analtech，特拉华州纽瓦克	P02521
四硼酸钠	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	S9640
链霉亲和素	AnaSpec，加利福尼亚州弗里蒙特	AS-72177
注射泵，  具备推注/回吸功能	Harvard Apparatus，马萨诸塞州霍利斯顿	PHD2000，70-2001
具备造影特异性模式的超声成像系统	Siemens/Acuson，加利福尼亚州山景城	Sequoia c512，15L8 探头	上一代 Sequoia 已停产十余年，仅可作为二手设备获得。15L8 探头需解锁 CPS 模式
紫外分光光度计	Beckman，加利福尼亚州布雷亚	DU640	已停产，可用任何具备 260 nm 紫外检测功能的仪器替代