本文提供了一步一步的操作方案，并附有建立异种移植瘤的技巧，以及肿瘤行为分析、全组织免疫荧光染色和共聚焦成像定量分析的指导原则。
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摘要
摘要
斑马鱼幼体异种移植模型目前被广泛用于癌症研究，以开展针对人类癌症的体内实时研究。该模型能够在单细胞分辨率下快速观察抗肿瘤治疗（化疗、放疗和生物制剂）的响应、血管生成及转移过程，因此成为开展临床前研究的首选模型。
与其它模型相比，斑马鱼幼鱼异种移植实验具有多项实验优势，但最显著的优势可能是尺寸规模的缩小以及随之而来的实验时间缩短。这种规模的缩小使得单细胞成像成为可能，能够使用相对较少的人源细胞（与活检样本量相兼容），适用于中高通量药物筛选，但最重要的是显著缩短了实验周期。上述所有优势使斑马鱼异种移植实验在未来的个体化医学应用中极具吸引力。
目前已开发出多种使用不同人类肿瘤的斑马鱼异种移植方案；然而，仍缺乏一种通用且标准化的方案来高效建立斑马鱼幼鱼异种移植模型。本文提供了一套详细的逐步操作流程，并附有异种移植操作技巧，以及肿瘤行为分析、整体免疫荧光染色和共聚焦成像定量分析的指导规范。
引言
斑马鱼（Danio rerio）正成为研究发育和疾病的强大脊椎动物模型生物。斑马鱼在遗传上与人类高度保守（约70%的基因同源性，约84%的疾病相关基因），并且具有基本相似的器官形态特征1,2。这种保守性使得斑马鱼可用于模拟多种人类疾病，包括癌症3,4。
由于体型小、全年高繁殖力以及体外受精等特点，斑马鱼的饲养和维护比小鼠更容易且成本更低3,5。斑马鱼胚胎在出生后的前5-7天内无需活体喂养，已被广泛用作发育、感染和癌症研究的有效模型1,4,6,7。斑马鱼胚胎在受精后48小时（hpf）孵化，此时已发育为自由游动的个体，所有器官均已形成，包括跳动的心脏、功能性循环系统、肝脏、脑、肾髓等1,3。此外，在此发育阶段，仅有先天免疫系统发挥作用，适应性免疫系统仍在发育中，因此可在无需使用免疫缺陷突变体的情况下实现人类细胞的高效移植7,8。然而需要指出的是，并非所有人源细胞都能以相同效率成功移植9，例如对于白血病细胞，已有研究表明，为了实现高效移植，需要先耗竭吞噬细胞（中性粒细胞和巨噬细胞）10。
斑马鱼具有良好的遗传可操作性，且其早期胚胎具有光学透明性，因此可在单细胞水平上进行高分辨率的活体成像，从而推动了生物学多个领域内先进成像技术的建立。此外，在癌症研究中，这些特性有助于实时研究宿主与肿瘤相互作用的最初阶段，例如分析血管生成和转移潜能，以及与先天免疫系统的相互作用8,9,11,12,13。
尽管在短期异种移植实验中，没有足够时间发生转移 "进化"- 可以分析肿瘤细胞的转移能力（即它们完成转移各步骤的效率，如侵袭、内渗、循环中存活、外渗和定植），从而研究这些过程 体内 并实时8,11,13,14).
其生命周期的特征使斑马鱼成为癌症个体化医学研究的独特模型。相关实验可在较短时间内完成，几周内即可获得结果7,8,9,11,12,15,16。这些实验的快速性和可行性为医生和研究人员提供了获得转化研究成果的机会，这对于时间极为紧迫的癌症患者具有重要意义。
尽管在成功建立斑马鱼胚胎异种移植模型方面已有越来越多的尝试，但仍需对注射操作流程进行标准化，并在注射后对细胞活力及肿瘤行为进行评估。
在本方案中，我们为研究人员提供了在斑马鱼胚胎中注射人源癌细胞系，以及后续固定、免疫染色、成像和肿瘤细胞行为定量分析的清晰且详细的逐步操作指南。
方案
斑马鱼（Danio rerio）模型的饲养与操作均依照欧洲动物福利立法标准规程 Directive 2010/63/EU（欧洲委员会，2016）以及 Champalimaud 鱼类平台的规定进行。所有实验方案均经 Champalimaud 动物伦理委员会以及葡萄牙机构组织 ORBEA（Órgão de Bem-Estar e Ética Animal/动物福利与伦理机构）和 DGAV（Direção Geral de Alimentação e Veterinária/食品与兽医总局）批准。
注意：在开始主要实验之前，先使用人结直肠癌（CRC）细胞系 HCT116 进行练习。该细胞系易于制备（增殖能力强）、易于注射，并且移植效率非常高（约 95-100%）。在熟练掌握技术之前，应准备充足的细胞（约 12×106 个细胞，T-75 培养瓶）和大量斑马鱼（400 条），因为在训练过程中会损失大量细胞和鱼类。当 HCT116 异种移植的移植成功率达到约 95% 时，实验人员即可视为已掌握该技术。完整的实验流程示意图参见图 1。
1. 注射前准备
- 注射前两周，在培养中扩增细胞（参见 表1 有关最佳方案的详细指南 体外 用于多种细胞系注射的融合度
- 在注射前3天，将所需遗传背景的斑马鱼进行杂交。
2. 注射前 24 小时
- 清洁斑马鱼胚胎培养板（弃去所有死亡和未发育的胚胎），并更换E3培养基。
- 在细胞培养室中，弃去计划用于注射的培养瓶中的细胞培养基，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次以去除死细胞，然后加入新鲜培养基。
- 准备注射操作所需的工具，例如：显微注射针、琼脂糖平板和用于固定胚胎以便注射的发夹图 2A- D，如下所述。
- 显微注射针图2A)
- 使用硼硅酸盐玻璃毛细管（4英寸，外径1.0 mm，无 filament），在显微注射针拉制仪中拉制（加热：≈500；fil：10；vel：50；dec：60；pull：100）。
- 培养皿准备（图 2B)
- 制备 2% 琼脂糖凝胶于 H2O，加热后将一层溶解的琼脂糖倒入洁净培养皿的皿盖中。待其凝固后，借助直尺在凝固的琼脂糖上制作3至4条直线，用于胚胎的排列对齐。
- 发夹结构组装（图2C- D)
- 将1根头发放入玻璃毛细管中，使约1厘米的头发留在管外。
- 使用镊子将毛发外端卷曲，送入玻璃毛细管中，形成一个长约0.5 mm的环状结构。
- 用一滴指甲油密封毛细管的管端边缘，这也有助于固定环状结构。待其干燥后，对管子的另一端重复此操作。
- 剪下一段电工胶带（比普通胶带更耐磨损、不透水且质地更硬）。
- 用胶带密封毛细管末端，以防止其断裂。
- 显微注射针图2A)
3. 注射日
- 将已孵化的胚胎与未孵化的卵分离。在此阶段，向胚胎培养基中加入1×蛋白酶（0.6 mg/mL，表3）可促进孵化。将胚胎置于培养箱中（28 °C）直至注射。
注意：胚胎在蛋白酶溶液中放置时间不得超过1小时，因为该酶会作用于已孵化的胚胎，增加其死亡风险。确保胚胎的发育阶段对应于48 hpf（图3A，A'），以避免出现水肿和死亡风险。 - 配制1×三卡因溶液（由25×母液稀释而成）。
注意：详细的配方见表3以及斑马鱼信息网络（Zebrafish Information Network - ZFIN）网站17。
4. 注射用细胞标记
注意：细胞标记可在培养瓶中直接进行，或在酶解脱离后于1.5 mL微量离心管中进行。更多信息请参见讨论部分。
- 移除细胞培养基，并用 1× PBS 洗涤培养瓶两次。
- 可在培养瓶内（每 T75 培养瓶加入 2 mL 溶液）或在酶法消化脱离后转入 1.5 mL 微量离心管中，使用所选的脂溶性染料对细胞进行标记。避免光照，并在 37 °C 下孵育细胞（具体条件和溶液见表 1和表 2）。
- 若在培养瓶中进行标记
- 移除染料，用 1× PBS 洗涤，然后使用 EDTA 和细胞刮刀消化脱离细胞。
- 将细胞转移至 1.5 mL 微量离心管中，以 300 × g 离心 5 分钟，随后进入步骤 4.5。
- 若在 1.5 mL 微量离心管中进行标记：
- 以 300 × g 离心 5 分钟以去除染料，弃去上清液，用 1× PBS 重悬洗涤。
- 再次以 300 × g 离心 5 分钟，随后进入步骤 4.5。
- 弃去上清液，用细胞培养基重悬细胞沉淀（对于 50 µL 的细胞沉淀，加入约 150–200 µL 培养基）。
- 使用台盼蓝染色排除法结合血球计数板或其他合适方法测定细胞活力。
- 以 300 × g 离心 4 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于注射用培养基中。
注意：推荐的细胞浓度（通常为 0.25–0.5×106 个细胞/µL）及所用培养基详见表 1。 - 自此步骤起，始终将细胞置于冰上保存。
5. 注射操作步骤
- 用1x Tricaine将胚胎麻醉5分钟。
- 使用塑料巴斯德移液管，将少量（约50个）麻醉后的胚胎转移至琼脂糖平板上，并借助发夹环小心排列整齐。注意保持胚胎之间的间距，尤其是前一个胚胎的卵黄与后一个胚胎头部之间应留有适当距离。图 4A).
注意：需要排列的胚胎数量取决于进行显微注射的研究人员的操作熟练程度。初学者可从少量胚胎开始（约10–20枚）。有关胚胎在琼脂/琼脂糖平板中正确摆放位置的示意图，请参见 图 4A. - 确保对齐的胚胎在琼脂糖平板上不会干燥，以防止死亡，可小心地向平板中加入1-3滴1x三卡因溶液。
- 轻轻敲击微量离心管以重悬细胞。使用微量加样吸头通过反向加样法将细胞悬液吸入注射针头，避免产生气泡，因为气泡可能破坏胚胎的完整性。
- 打开气压阀（40 psi），设置显微注射仪，并将显微注射针小心插入持针器中。
注意：建议使用以下显微注射仪参数设置：持针压力（Hold pressure）— 通气（3 psi）；喷射压力（Eject pressure）— 通气；作用时间（Range）— 100 ms。 - 在体视显微镜下，使用Dumont #5或类似型号的镊子将显微注射针在靠近尖端处剪断。
注意：针尖必须足够钝且足够细，以允许细胞顺利通过而不发生堵塞，同时避免损伤胚胎和细胞丢失。过粗的显微注射针尖会伤害胚胎，导致水肿形成或斑马鱼死亡。校准针尖时不使用刻度目镜。参见 讨论 有关详细说明。 - 在注射胚胎之前，测试显微注射仪的压力，从最低的喷射压力开始，逐步调整，直至大约1-3次脉冲即可排出与斑马鱼胚胎眼睛大小相似的液滴体积。
注意：建议在训练初期尽可能使用荧光体视显微镜。这将有助于更便捷地识别荧光标记的细胞。 - 小心地在胚胎卵黄的中部穿刺，降低针头的角度，谨慎推进直至针尖到达卵周隙（PVS）图 4B- D).
- 踩下显微注射仪踏板，将细胞注入PVS。以胚胎的眼睛为参照，注射的细胞体积应尽量与胚胎眼睛大小相近，并尽可能远离心脏，以防止心包水肿。
- 小心取出针头，然后移至下一个胚胎。
- 必要时调整显微注射仪的压力。
注意：细胞容易发生堵塞，因此可能需要增加压力。如有必要，可在降低压力的同时剪断毛细管以增大其直径。 - 将已注射的胚胎转移至洁净的培养皿中（表4用1x Tricaine溶液处理，并静置5-10分钟，以使伤口闭合。
注意：将胚胎从琼脂平板转移到培养皿时，需在胚胎上方加入几滴1x Tricaine溶液，然后用塑料巴斯德吸管小心吸取胚胎，再将其滴入盛有1x Tricaine溶液的新培养皿中。 - 移除1x Tricaine溶液，加入新鲜的E3培养基。
- 将异种移植瘤置于培养环境中孵育 34 °C （介于人类细胞系存活与斑马鱼发育之间的一个折衷温度）8).
6. 转移实验
- 注射后约1小时（hpi），在荧光体视显微镜下观察注射后的胚胎，并根据循环中是否出现细胞，将移植体分为两组：无循环细胞组（图5A）和有循环细胞组（图5B）。
注意：即使仅在心脏或循环系统中检测到一个癌细胞，也应将该移植体归入有循环细胞的移植体组。或者，可直接将细胞注入循环系统，以增加该组中移植体的数量。
7. 注射后第1天
- 在荧光体视显微镜下仔细分析每个胚胎，并挑选出肿瘤注射位置正确的胚胎（图6）。
注意：如需进行筛选，可在观察前使用1X浓度的Tricaine溶液对注射后的胚胎进行麻醉。 - 弃去以下胚胎/异种移植样本（图6A-A''）：
• 无肿瘤、形态异常或已死亡的胚胎，
• 出现心脏和/或卵黄囊水肿的胚胎，
• 肿瘤细胞仅存在于卵黄囊内的胚胎，
• 癌细胞数量极少的胚胎。 - 根据肿瘤大小对筛选出的异种移植样本进行分类。可参照眼睛的大小作为比较标准（图6B-B''、6C）。
• 肿瘤小于眼径大小的记为 (+)，
• 肿瘤与眼径大小相当的记为 (++)，
• 肿瘤大于眼径大小的记为 (+++)。 - 根据实验设计的分组方案分配异种移植样本，并开始药物处理实验（对照组 vs 药物组等）。每日更换药物及E3培养基（表4）。
- 将异种移植样本在34°C恒温条件下孵育，直至实验结束。
8. 注射后第4天
- 在实验的最后一天，使用1× Tricaine溶液麻醉异种移植体，并将其小心地排列在琼脂平板上。
注意：丢弃任何已死亡或肿胀的异种移植体。药物处理及某些肿瘤细胞可能引起毒性，最终导致异种移植体死亡。这些移植体不纳入移植率的定量分析。 - 确定移植率：在荧光体视显微镜下逐一分析每个存活的异种移植体，评估其血管生成区（PVS）中肿瘤的缺失（图6D）或存在（图6E）情况。
- 确定转移率：在荧光体视显微镜下分析每个异种移植体，评估先前定义的两组（CIRC组和NO CIRC组，图6F）尾部造血组织（CHT）中是否存在微转移灶。
- 根据实验设计，选择目标异种移植体，并使用25× Tricaine实施安乐死（表3）。
- 在室温下用4%甲醛（FA）固定至少4小时，或在4 °C下过夜固定。
注意：使用无甲醇的甲醛（16% FA），以PBS/0.1% Triton稀释至4%。将固定液加至管子顶部，确保完全浸没样本。将管子水平放置，以保证所有异种移植体均匀固定，提高通透性，并防止斑马鱼聚集于管底。 - 也可使用PIPES固定液进行固定（每1 mL含：100 µL 1 M PIPES钠盐（4 °C）；1 µL 1 M MgSO4 （室温）；4 µL 0.5 M EGTA（室温）；93.7 µL 16% FA（室温）；801.3 µL ddH2O）。
注意：与4% FA相比，PIPES能更好地保留RFP和mCherry转基因品系的荧光信号。 - 若免疫染色将在另一天进行，可用100%甲醇（MetOH）替换甲醛。在100%甲醇中固定的异种移植体可于-20 °C长期保存。
注意：甲醇可能影响某些染色（如鬼笔环肽）的效率，并淬灭部分荧光标记。请预先确认抗体在甲醇固定的样本中的染色效率。
9. 共聚焦成像用全 mount 免疫染色
注意：整体免疫荧光技术共需3天，具体安排如下：第1天进行异种移植组织的通透化处理及一抗孵育；第2天进行洗涤和二抗孵育；第3天进行洗涤、异种移植组织的固定，并将其保存于封片剂中。
- 第1天
- 如果异种移植组织保存在100%甲醇（MetOH）中，则通过一系列浓度递减的甲醇溶液（75%、50%、25% MetOH，用PBS/0.1% Triton稀释）进行再水化。若组织用甲醛（FA）固定，则将其替换为PBS/0.1% Triton。
- 用PBS/0.1% Triton洗涤4次，每次5分钟。
- 用H2O洗涤1次，每次5分钟。
注意：在固定、通透和洗涤步骤中，试管必须始终保持水平放置，除非另有说明。 - 将H2O替换为预冷的丙酮，并在-20 °C孵育7分钟。
注意：提前将一个装有丙酮的50 mL离心管置于-20 °C冰箱中，以便随时使用。微量离心管必须垂直放置在管架上，以防止丙酮泄漏。 - 用PBS/0.1% Triton洗涤2次，每次10分钟。
- 加入PBDX_GS封闭液，在室温下孵育1小时（PBDX_GS封闭缓冲液：50 mL 1x PBS；0.5 g牛血清白蛋白 - BSA；0.5 mL DMSO；250 µL 10% Triton；750 µL山羊血清 - GS（15 µL/1 mL））。
- 移除PBDX_GS封闭液，加入约40 µL的一抗稀释液（通常为1:100稀释）。
注意：一抗稀释液的体积根据微量离心管中异种移植组织的数量而定。确保所有组织均被完全浸没。 - 室温孵育1小时，随后在4 °C过夜孵育。试管保持垂直放置。
- 第2天
- 移除一抗溶液，用PBS/0.1% Triton洗涤2次，每次10分钟。
- 用PBS/0.05% Tween洗涤4次，每次30分钟。
注意：以下所有步骤均需避光操作（可用铝箔包裹试管以避免光照）。 - 移除PBS/0.05% Tween，向每管中加入约50–100 µL的二抗稀释液（通常为1:200–1:400稀释）以及DAPI（50 µg/mL），均用PBDX_GS缓冲液稀释。
- 室温孵育1小时，随后在4 °C过夜孵育。试管保持垂直放置，并避光。
- 第3天（使用铝箔包裹试管以避光）
- 移除二抗稀释液，用PBS/0.05% Tween洗涤4次，每次15分钟。
- 在4% FA中室温固定20分钟。
- 用PBS/0.05% Tween洗涤1次，每次5分钟。
- 移除PBS/0.05% Tween，向每个微量离心管中加入一滴水性封片剂。试管保持垂直放置。
- 可立即封片，或于4 °C避光保存至封片。试管保持垂直放置。
10. 异种移植瘤的制备
注意：整个操作过程中需避免微离心管暴露于光线下。斑马鱼异种移植样本置于两片盖玻片（24 × 60 mm，#1.5）之间进行封片。此方法可在共聚焦成像过程中翻转封片后的异种移植样本，从而可观察肿瘤的两侧（顶部和底部）。请勿使用塑料吸头接触封片介质——异种移植样本可能卡在吸头内。以下步骤的示意图参见图7。
- 标记盖玻片 Y，并用凡士林或硅脂密封盖玻片 X 的边缘，以防止封片介质泄漏。
- 用玻璃巴斯德吸管将异种移植样本转移至盖玻片 X 上。
- 用发夹小心调整其位置，并去除多余的水性封片介质。
- 向盖玻片 Y 上添加水性封片介质。
- 小心将盖玻片 Y 放置在盖玻片 X 的上方。切勿按压盖玻片，以免可能破坏异种移植样本。
- 将组装好的盖玻片置于显微镜载玻片上，并用透明胶带固定。这有助于共聚焦成像和储存时更方便地操作。
11. 共聚焦成像
注意：使用水校正的消色差 25 倍浸入式物镜对 PVS 肿瘤进行成像，可实现单细胞分辨率（示例见图 8C-C" 和 图 9A）。
- 使用 z 轴堆叠功能采集样本，每层切片之间的间隔为 5µm。对于旨在进行三维重建的图像（尤其是血管），切片之间的间隔应使用 1-3µm（图 8A）。
12. 分析与定量
- 使用 FIJI/ImageJ 软件或类似软件进行共聚焦图像的处理与分析。
- 在 FIJI 软件中打开原始数据（如 .czi、.lsm 等格式）。
- 若要在复合模式下选择所有通道或仅单个通道，请点击：图像 > 颜色 > 通道工具。
- 若要调整亮度和对比度，请点击：图像 > 调整 > 色彩平衡。
- 定量肿瘤大小
- 每例异种移植瘤的每个 z 轴层叠图像中，选取肿瘤顶部、中部和底部三个具有代表性的切片（图8 A）。
注意：共聚焦显微镜的成像深度约为 60–70 µm。若肿瘤体积较大，可能无法完整成像其总体积。 - 打开电子表格以记录数据。
- 统计所选三个切片中所有对应于肿瘤细胞的 DAPI 染色细胞核（图8 A, B）。操作步骤如下：
- 通过点击 插件 > 分析 > 细胞计数器，在 FIJI/ImageJ 中打开细胞计数器插件。
- 在细胞计数器工具中，点击 初始化，选择计数器类型，然后点击图像以进入手动计数模式。每次点击，计数器将累加所计细胞数量（即点击次数）。
- 完成一个完整切片的计数后，将细胞数量保存至相应的 Excel 文档中。
- 返回 FIJI，若需重复使用同一计数器，请在 细胞计数器 窗口中点击 重置 以清除信息；否则可保留当前数据，并使用其他计数器对其他切片（或细胞类型）进行计数。
- 切换至第二个代表性切片，重复上述步骤，收集全部数据。
注意：DAPI 复染常用于细胞计数，因其可清晰分辨单个细胞，但也可使用其他特异性细胞染色方法。
- 使用以下公式计算肿瘤中细胞总数：
注意：1.5 的校正系数是针对平均细胞核直径约为 10–12 µm 的细胞估算得出。若细胞尺寸显著偏大或偏小，该系数可能需要调整。详见讨论部分对该方法的进一步说明。
- 每例异种移植瘤的每个 z 轴层叠图像中，选取肿瘤顶部、中部和底部三个具有代表性的切片（图8 A）。
- 若要定量其他标志物（如免疫细胞、有丝分裂图像、PPH3、活化型 Caspase3、Ki67 等），使用相同插件对所有切片进行定量（参见 图8C-C'' 中有丝分裂图像的可视化示例）。将所计细胞总数除以对应的肿瘤大小，再乘以 100，得到百分比数值。
注意：部分细胞可能位于两个切片之间，需在 z 轴层叠图像中前后切换，确保同一细胞不被重复计数。
结果
斑马鱼异种移植作为研究抗癌疗法的工具。
将 CM-DiI 标记的 HCT116 结直肠癌细胞系注射至受精后 2 天（dpf）胚胎的脉络丛腔（PVS）中。注射后，将异种移植胚胎在 34 °C 下孵育，该温度可促进肿瘤细胞生长，同时不影响斑马鱼的正常发育。次日，根据脉络丛腔内是否存在肿瘤团块对异种移植个体进行筛选（未成功注射的斑马鱼被剔除并实施安乐死）（图 6A-A''）。根据肿瘤大小对异种移植个体进行分组（图 6B-B''），随后随机分配至 6 孔板中（每孔约 12 个异种移植个体），分别作为未处理对照组和 FOLFIRI 化疗组（含 0.18 mM 亚叶酸、0.08 mM 伊立替康和 4.2 mM 氟尿嘧啶（5-FU））。
对照E3培养基和药物每天更换，死亡的斑马鱼及时清除。在接种后第4天（4 dpi）以及治疗后第3天（dpt），按照方案第8.2步的方法对移植情况进行定量分析。移植成功率定义为在4 dpi时，在PVS区域形成肿瘤团块的异种移植胚胎所占的比例。例如，若实验结束时共有40条存活的幼鱼，其中35条在PVS区域出现肿瘤，则移植成功率为87.5%。随后对异种移植个体实施安乐死并进行固定，通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜检测肿瘤大小和细胞凋亡情况。
采用免疫荧光法检测凋亡细胞，一抗为抗裂解型Caspase 3抗体（Asp175）（兔源，1:100，#CST 9661），DAPI（50 µg/mL）用于细胞核复染。使用LSM710共聚焦显微镜获取图像堆栈数据集（每5 µm一层），数据分析按照步骤12中所述方法使用FIJI/ImageJ软件进行。有丝分裂指数、凋亡率（活化型Caspase3阳性细胞百分比）和肿瘤大小的定量结果显示，FOLFIRI处理可显著降低有丝分裂（Mann Whitney检验，P<0.0001），显著诱导细胞凋亡（Mann Whitney检验，P<0.0001），并伴随肿瘤体积缩小54%（P<0.001）（图8C-E，图9A-E）.
这些特征在高通量表型药物筛选中具有重要应用价值，同时也可用于在较短时间内检测多种癌症治疗手段对细胞内在功能及生理效应的影响。
使用人源特异性抗体对人-斑马鱼异种移植模型进行表征
与所有异种移植模型一样，存在细胞误判的风险。例如，巨噬细胞可吞噬人源癌细胞，从而被脂溶性染料标记，并在斑马鱼宿主体内迁移，导致这些细胞被误认为是肿瘤微转移灶。因此，使用特异性人源抗体（如人源HLA、ki-67或人源线粒体抗体（hMITO））对异种移植细胞进行标记，对于初始表征至关重要，同时也有助于熟悉肿瘤细胞的形态特征（图9F-I）。
利用斑马鱼异种移植模型研究细胞间相互作用。
斑马鱼异种移植模型的另一大优势在于，可以研究不同肿瘤细胞之间的相互作用，并分析每种细胞类型如何影响其他细胞的行为。可将不同的人类癌细胞（来自同一肿瘤的不同克隆或来自不同肿瘤）共同注射。在此示例中，来源于同一患者的两种结直肠癌（CRC）细胞系用不同的疏水性染料标记，并按1:1的比例混合后进行注射（图9J-K'）。
在同一切片中混合人源细胞系（以生成多克隆肿瘤）时，应避免使用DiO染料，因其会导致非特异性双重染色（表2）。建议改用例如CM-DiI（细胞系#1）与绿色CMFDA（细胞系#2），或CM-DiI（细胞系#1）与深红色染料（细胞系#2）（表2，图9J-K'），以便在实验结束时轻松区分不同细胞群体。为量化肿瘤中各克隆所占比例，可在FIJI中使用两种不同的计数方式分别识别每个克隆，再除以总细胞数（所有克隆之和），从而获得各克隆的相对比例（%）。
图 1。斑马鱼异种移植实验流程图概览 请点击此处查看该图的高清版本。
图 2．斑马鱼胚胎注射所需材料：A．硼硅酸盐玻璃针头B．2% 琼脂糖平板。C 发夹环D．制作发夹环的步骤：1．将一根毛发插入玻璃毛细管中，使约1厘米长的毛发露在管外。2-3．用镊子将管外的毛发尖端卷入毛细管内，形成一个长约0.5 mm的环。4．用一滴指甲油密封毛细管边缘。5-6．在毛细管周围缠上一层电工胶带，以防止其断裂。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3．受精后48小时（48 hpf）斑马鱼胚胎的代表性体视显微镜图像：A-A'。 发育至48 hpf的斑马鱼胚胎正常形态，适用于显微注射。B-B'。 在48 hpf时尚未达到适宜显微注射发育阶段的斑马鱼胚胎形态，已出现一定程度的心包水肿（黑色箭头）及卵黄扩张。A' 和 B' 分别为 A 和 B 的放大图像。比例尺为 500 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4．斑马鱼显微注射板设置示意图：A．在3%琼脂/2%琼脂糖板中对麻醉后的胚胎进行排列。B．受精后2天斑马鱼胚胎的示意图，黑色箭头指示胚周腔（PVS）。C 和 D． 可以以不同角度将癌细胞注射至受精后48小时胚胎的胚周腔（PVS）中。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5．转移性检测。 注射后 1 小时（1 hpi），根据循环中是否存在肿瘤细胞，将胚胎分为无循环细胞组（NO_circ）和有循环细胞组（CIRC）。注射后第 4 天，对两组中出现微转移的异种移植体数量进行定量。NO_circ 组（A）的细胞必须经历全部转移步骤才能形成微转移灶，而 CIRC 组（B）的细胞仅完成转移级联反应的最后步骤。请点击此处查看该图的放大版本。
图6注射后1天和4天的异种移植瘤代表性荧光体视显微镜图像。 表达荧光蛋白 TdTomato（红色）的人类癌细胞被显微注射至 2 dpf 斑马鱼胚胎中。在 1 dpi 时，筛选注射后的胚胎，剔除注射不良或出现水肿的胚胎A-A根据肿瘤大小对显微注射后的胚胎进行分选（B-B''). C. 不同肿瘤大小类别中在1 dpi时SW620异种移植瘤内总细胞数的代表性定量结果。每个点代表一个异种移植物，其定量方法如第12节所述。在4 dpi时，筛选幼体并定量不同类别：无肿瘤（D); 伴有PVS肿瘤（E）以及CHT中存在微转移灶（micrometastasis）F比例尺代表 500 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 7．异种移植样本用于共聚焦成像的示意图。1． 盖玻片 Y 上标记示例，盖玻片 X 上的浅蓝色线表示涂抹凡士林/硅脂的边界，以防止封片介质泄漏。2． 异种移植样本在盖玻片 X 上用于共聚焦成像的对齐示例。3． 使用水性封片介质（蓝色箭头）将盖玻片 Y 置于盖玻片 X 上方进行粘合。4． 正确封片的盖玻片示例。5． 然后将盖玻片置于载玻片上，并用透明胶带固定。6． 已完成封片的异种移植样本，准备进行共聚焦成像。使用 BioRender.com 创建 请点击此处查看该图的放大版本。
图8．肿瘤大小共聚焦显微镜图像定量的可视化表示。 注射后第4天HCT116异种移植瘤的共聚焦图像。A． DAPI通道中以5 µm间隔获取的z轴层扫图像序列。红色虚线圈出用于细胞计数的三个代表性切片。B． 使用ImageJ/Fiji软件中的Cell Counter插件对DAPI染色的细胞核进行定量的示意图。C-E． 肿瘤内单细胞分辨率的示例，可在其中观察和定量DAPI染色图像中的有丝分裂相，或使用磷酸化组蛋白H3抗体（绿色）进行检测。D 和 E 是 C 的放大图。比例尺为50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 9．代表性结果。A-E。 将 HCT116 结直肠癌细胞系用 Vybrant CM-DiI 标记后注射至受精后 2 天（dpf）的胚胎脉络丛腔（PVS）中。注射后，异种移植体在 34 °C 下孵育。在 1 dpi 时，筛选异种移植体并随机分配至未处理对照组和 FOLFIRI 处理组，连续处理 3 天，并在 4 dpi 时固定。 A．通过免疫荧光检测凋亡细胞，使用抗裂解型 Caspase 3 抗体，并用 DAPI 对细胞核进行复染。有丝分裂指数的定量分析 C、凋亡率（活化 Caspase3 的百分比）D 以及肿瘤大小 E 显示，FOLFIRI 可显著降低有丝分裂（Mann-Whitney 检验，P<0.0001），并显著诱导凋亡（Mann-Whitney 检验，P<0.0001），同时伴随肿瘤大小减少 54%（P<0.001）。图中注明了所分析的异种移植体数量，每个点代表一个异种移植体。 F-H。 在注射后第 4 天，结直肠癌异种移植体的代表性图像，使用人特异性标记物（人 HLA、ki67 和 hMITO，绿色）在 PVS 和 CHT 区域进行标记 I。 J-J'。 多克隆异种移植体的共聚焦图像，注射了两种不同的人结直肠癌细胞系，分别用亲脂性染料 CellTracker Deep Red（Cy5 - 白色）、CellTracker Green CMFDA（488 - 绿色）标记，并用 DAPI 复染。 K-K'。 两种不同的人结直肠癌细胞系的共聚焦图像，分别用亲脂性染料 CellTracker Deep Red（Cy5 - 白色）、Vybrant CM DiI（594 - 红色）标记，并用 DAPI 复染。比例尺为 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 细胞系 | 组织 | 物种 | 形态学 | 生长方式 | 注射时的理想汇合度 | 注射用解离试剂 | 解离时间 | 标记操作方案 | 注射用培养基 | 将细胞总数除以（以达到注射的理想浓度） | |||||||
| SW480 | 结直肠腺癌（原发） | Human | 上皮样 | 贴壁生长 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 分钟 | 培养瓶 | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| SW620 | 结直肠腺癌（转移） | Human | 上皮样 | 贴壁生长 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 分钟 | 培养瓶 | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HCT116 | 结直肠癌（原发），Kras 突变 | Human | 上皮样 | 贴壁生长 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 分钟 | 培养瓶 | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HKE3 | 结直肠癌，Kras 野生型 | Human | 上皮样 | 贴壁生长 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 分钟 | 培养瓶 | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HT-29 | 结直肠腺癌（原发） | Human | 上皮样 | 贴壁生长 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 分钟 | 培养瓶 | PBS 1x | 0,2 | |||||||
| CACO-2 | 结直肠腺癌（原发） | Human | 上皮样 | 贴壁生长 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 分钟 | 1.5 mL 微量离心管 | 完全培养基 | 0,25 | |||||||
| MCF-7 | 乳腺腺癌（转移） | Human | 上皮样 | 贴壁生长 | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 分钟 | 1.5 mL 微量离心管 | 60% FBS + 40% 完全培养基 | 0,5 | |||||||
| Hs578T | 乳腺癌（原发） | Human | 上皮样 | 贴壁生长 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 2 分钟 | 1.5 mL 微量离心管 | 60% FBS + 40% 完全培养基 | 0,5 | |||||||
| MDA-MB-468 | 乳腺腺癌（转移） | Human | 上皮样 | 贴壁生长 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 8 分钟 | 1.5 mL 微量离心管 | 60% FBS + 40% 完全培养基 | 0,5 | |||||||
| MDA-MB-231 | 乳腺腺癌（转移） | Human | 上皮样 | 贴壁生长 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 分钟 | 1.5 mL 微量离心管 | 完全培养基 | 0,5 | |||||||
| RT112 | 膀胱移行细胞癌（原发） | Human | 上皮样 | 贴壁生长 | 85% - 90% | TrypLE | 6 分钟 + 细胞刮刀 | 1.5 mL 微量离心管 | 完全培养基 | 0,5 | |||||||
| BFTC905 | 膀胱移行细胞癌（原发） | Human | 上皮样 | 贴壁生长 | 75% - 85% | TrypLE | 10 分钟 | 1.5 mL 微量离心管 | 80% 完全培养基 + 20% PBS/EDTA 2 mM | 0,5 | |||||||
| J82 | 膀胱移行细胞癌（原发） | Human | 上皮样 | 贴壁生长 | 85% - 90% | TrypLE | 10 分钟 | 1.5 mL 微量离心管 | 完全培养基 | 0,5 | |||||||
| RT4 | 膀胱移行细胞癌（原发） | Human | 上皮样 | 贴壁生长 | 85% - 90% | TrypLE | 6 分钟 | 1.5 mL 微量离心管 | 完全培养基 | 0,5 | |||||||
| MIA PaCa-2 | 胰腺上皮样癌（原发） | Human | 上皮样 | 贴壁生长 | 80% - 90% | TrypLE | 3 分钟 | 1.5 mL 微量离心管 | 60% FBS + 40% 完全培养基 | 0,5 | |||||||
| PANC-1 | 胰腺上皮样癌（原发） | Human | 上皮样 | 贴壁生长 | 80% | TrypLE | 5 分钟 | 1.5 mL 微量离心管 | PBS/EDTA 2mM | 0,5 | |||||||
| VC8 | 肺成纤维细胞，BRCA2 突变，同源重组缺陷 | Chinese hamster | 上皮样 | 贴壁生长 | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 分钟 | 1.5 mL 微量离心管 | 完全培养基 | 0,25 | |||||||
| VC8-B2 | 肺成纤维细胞，人源 BRCA2，BRCA2 −/−，同源重组缺陷 | Chinese hamster | 上皮样 | 贴壁生长 | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 分钟 | 1.5 mL 微量离心管 | 完全培养基 | 0,25 | |||||||
表1：多种细胞系显微注射的最佳体外汇合度
| 细胞染料 | 目录号 | 荧光光谱（激发波长 - 发射波长） | 储备液稀释 | 工作稀释液用于烧瓶中染色 | 用于在 1.5 mL 微离心管中染色的工作稀释度 | 孵育时间 | 观察 | ||||||
| Vybrant CM-DiI | V22888 | 549 nm - 569 nm | 已稀释 | PBS 1x 中按 4:1000 稀释 | PBS 1× 中按 4:1000 稀释 | 15 分钟 @ 37 ºC + 4 分钟 @ 4 ºC | |||||||
| Vybrant DiO | V22886 | 484 nm - 501 nm | 已稀释 | PBS 1x 中 1:5000 | 5:1000，溶于1× PBS | 37 ºC 下 15 分钟 + 4 ºC 下 4 分钟 | 注射后4天共聚焦成像分辨率不佳 | ||||||
| CellTracker Deep Red | C34565 | 630 nm - 660 nm | 1 mM，溶于 DMSO | 0.5 - 2.5 µM 在 PBS 1× 中 | 0.5 - 2.5 µM 在 PBS 1× 中 | 15 分钟 @ 37 ºC | |||||||
| CellTracker Green CMFDA | C7025 | 492 nm - 517 nm | 10 mM，溶于DMSO | 0.5 - 2.5 µM 在 PBS 1× 中 | 0.5 - 2.5 µM 在 PBS 1× 中 | 15 分钟 @ 37 ºC | 注射48小时后产物渗漏至腹腔，但适用于共注射研究 | ||||||
表2：染料及实验条件
| 规格 | 幼虫数量 | E3 1x 培养基体积 |
| 100 mm x 15 mm（标准） | 最多 50 条 | 20–25 mL |
| 60 mm x 15 mm | 最多 20 条 | 10 mL |
| 6 孔板 | 每孔最多 15 条 | 每孔 3–4 mL |
表3：培养皿选项
| E3 培养基 50x - 储存液 | 每 10 升无菌水： |
| 146.9 g NaCl | |
| 6.3 g KCl | |
| 24.3 g CaCl2·2H2O | |
| 40.7 g MgSO4·7H2O | |
| E3 培养基 1x – 即用型 | 400 mL E3 培养基 50x |
| 60 mL 0.01% 亚甲蓝溶液 | |
| 加鱼系统水至 20 升 | |
| Tricaine 25x – 储存液及安乐死用 | 2 g Tricaine 粉末 |
| 500 mL 反渗透水 | |
| 10 mL 1 M Tris（pH 9） | |
| 调节 pH 至 7 | |
| Tricaine 1x - 麻醉用 | 20 mL Tricaine 25x |
| 加系统水至 500 mL | |
| 60 mg/mL Pronase - 储存液 100x | 1 g pronase |
| 16.7 mL 无菌水 | |
| 0.6 mg/mL Pronase – 1x 即用型 | 100 µL pronase 100x |
| 9.9 mL E3 培养基 1x |
表4：溶液组成
讨论
斑马鱼作为癌症发育和药物筛选模型的重要性日益增加，已催生了大量出版物3,4,7,13,14,16,18,19,20,21。然而，将癌细胞注射到斑马鱼胚胎中的技术需要极高的操作技巧，对研究人员而言可能具有挑战性。本方案旨在提供实用信息和一些技巧，以帮助克服建立斑马鱼胚胎异种移植模型初期所面临的困难。
注射前的细胞处理
该优化方案可用于在斑马鱼中建立多种形态的细胞系异种移植模型，并可适用于不同类型的（癌）细胞。我们建议用于斑马鱼异种移植的所有细胞系均应无支原体污染。与其他细菌污染不同，细胞培养物中支原体的存在不会在显微镜下产生易于察觉的明显变化22。支原体污染可能影响细胞系的移植能力、对药物的敏感性以及斑马鱼胚胎的存活率。
尽管细胞可能持续增殖较长时间，但其表型和基因型可能发生改变。熟悉细胞系在培养中的形态和行为非常重要。建议在冻存细胞复苏后，将传代次数控制在3至12代之间，以获得可重复的实验结果。因此，应定期进行支原体检测。
注射当天，细胞应处于对数生长期（即达到约70%汇合度之前的指数生长期）。这将有助于实现充分的移植以及肿瘤特有特征的正常发育。为防止异种移植中细胞表型出现差异，关键是要在不同实验之间保持用于注射的细胞汇合度一致。注射的细胞数量可根据各细胞系的特性进行调整，因为某些细胞系可能需要较高的注射密度才能在斑马鱼胚胎中良好生长。
细胞标记的注意事项
为了更清晰地观察用于注射及后续分析的人类肿瘤细胞，可使用荧光染料对肿瘤细胞进行标记。由于细胞大小存在差异，每厘米的细胞总数2 在贴壁培养中，不同细胞系的细胞生长情况存在差异。这将影响染色方案的效果以及用于注射的细胞收获数量。某些细胞体积较大，每瓶产生的细胞数较少（如 Hs578T），或以簇状生长（如 BFTC905），此类细胞在单次实验中需合并多个培养瓶的细胞。在此情况下，不应直接在培养瓶内进行染色，否则会导致染料用量过多（成本较高）。另一方面，对离心次数敏感或每瓶产量较高的细胞（如 HCT116），可在培养瓶内直接染色，随后使用 EDTA/细胞刮刀消化收集（更多信息请参见 表1).
在注射当天，应尽可能使用EDTA而非酶法来解离细胞，以便细胞更快地恢复细胞间连接，并减少离心步骤。然而，如果细胞对EDTA敏感、贴壁性极强或以细胞簇形式生长，则可采用酶法处理。注射所需的最佳细胞浓度及注射用培养基取决于各细胞系的特性，因此可能需要进行适当调整（表1）。
显微注射校准
与将寡核苷酸或药物递送至斑马鱼胚胎不同，在使用异种移植的细胞系进行显微注射时，无需使用网格测微尺来校准注射针。注射过程中经过一段时间后，细胞会开始堵塞针尖，此时需要剪断针尖以增大其直径，或直接更换新的注射针。这一操作使得使用测微尺进行校准变得不可行。
为解决这一问题，通过调节喷射压力和脉冲次数（1-3次脉冲），控制所分配的细胞数量，使其体积达到与胚胎眼相似的大小。随后，为进一步控制肿瘤大小，在移植后1天（1 dpi），根据肿瘤大小对异种移植体进行分选，如 图6 B-B"所示。如图6C示例所示，该分选方法可有效降低肿瘤大小的变异程度：若将所有样本合并（+，++，+++），标准化肿瘤体积误差（STEV）约为++类别的两倍（约906个细胞对比约422个细胞），变异系数约为31.9%，而++类别的变异系数为14.5%。由于注射的参考标准是体积，不同细胞类型的总细胞数差异较大，这取决于细胞的大小和形态。例如，具有大量细胞质的大细胞（如乳腺癌Hs578T细胞）形成的肿瘤较小（约600个细胞）。此外，不同细胞系所需的细胞数量也各不相同。例如，HT29结直肠癌和RT112尿路膀胱癌细胞系显示，注射的细胞数量越多，斑马鱼胚胎的死亡率越高。因此，在建立异种移植模型的过程中，需要进行一段优化期，以检测该细胞系是否对胚胎具有毒性作用，或是否需要调整注射密度（更高或更低）。
注射部位
在制备斑马鱼胚胎异种移植模型时，最常见的差异之一是注射部位的选择。通常选择卵黄作为注射部位，因其易于接近。然而，我们观察到注射到卵黄中的细胞更容易死亡。尽管在技术上更具挑战性，我们建议将细胞注射到体腔（PVS）中，并尽可能远离心脏。在体腔内，若细胞具有转移特性，则可发生细胞聚集、招募血管和免疫细胞、迁移、内渗、外渗并形成微转移灶8,11。
移植效率
由于不同细胞系的基础细胞死亡/存活/增殖程度存在差异，以及各细胞系可能表现出的固有免疫原性不同，因此在接种后第4天（4 dpi）各细胞系间的移植效率和肿瘤大小存在差异是可预期的9。
转移
转移包含一系列多步骤的级联事件，可人为分为两个阶段。在第一阶段，肿瘤细胞必须从原发部位脱离，迁移并侵入邻近组织，随后进入血液循环。在第二阶段，肿瘤细胞必须在循环系统中存活，从血管或淋巴管中穿出，并最终在继发部位定植23。为了区分这些早期和晚期事件，并评估不同肿瘤细胞执行这些步骤的潜能或能力，我们设计了一种简单的检测方法。
通常情况下，当肿瘤细胞被注射到PVS时，可直接进入循环系统，随后在尾部造血组织（CHT，尾部区域）中被物理性截留。然而，根据每种肿瘤细胞的特性，我们发现某些肿瘤细胞在接种后第4天仍保留在CHT中，并能够形成微转移灶，而其他肿瘤细胞则会消失（在被CHT截留后被清除）。
因此，通过比较在细胞直接进入循环时（CIRC，细胞仅需完成转移的后期步骤）与未直接进入循环时（NO CIRC，细胞需经历转移的早期和后期步骤才能形成微转移灶）的微转移效率（在4 dpi时），我们可以评估这些细胞的早期或晚期转移潜能。我们已观察到某些肿瘤细胞在两种情况下（CIRC和NO CIRC）均能高效地在CHT中形成微转移灶，表明这些细胞具备完成整个转移级联过程的能力（例如SW480和MDA-MB-468）8,11。相反，另一些肿瘤细胞在两组中的转移潜能均非常低，几乎无法形成微转移灶，即使被直接注射入循环中（例如在24 hpi时可在CHT中观察到，但在4 dpi时已消失不见，如Hs578T）8。然而，我们明确发现还存在另一类细胞——仅在被注射入循环时才能形成微转移灶（仅在CIRC组中可观察到微转移灶）。这表明这些细胞在执行转移级联的初始步骤方面效率较低，但另一方面仍能在循环中存活，并完成外渗及在远端部位定植的过程。
免疫染色与成像
在固定之前，该注射方案可用于其他活体成像方法，例如活细胞微分干涉差（DIC）显微镜、转盘显微镜、高分辨率活细胞共聚焦成像以及光片显微镜等。
在荧光体视显微镜下观察时，死亡细胞和细胞碎片会呈现明亮的信号，可能被误认为是活细胞，尤其是在研究目的为评估细胞系转移潜能的情况下。我们希望强调使用共聚焦成像结合特异性活力标记物和DAPI来评估肿瘤及微转移灶存活状态的重要性。此外，使用特异性的人源抗体（如抗人线粒体抗体或抗人HLA抗体）来检测人源细胞至关重要。在实施该实验方案时，应通过比较体视显微镜与共聚焦显微镜下的染色结果，训练实验人员的判读能力。经过一段时间的实践后，实验人员便能够在荧光体视显微镜下清晰区分细胞碎片与活细胞。
尽管其他量化肿瘤负荷的方法（如整体荧光面积）被广泛使用，但我们建议采用全组织免疫染色结合共聚焦成像作为更精确的方法。脂溶性染料染色的效率往往差异很大（即某些细胞染色非常充分，而另一些则不然——可能与其细胞膜的脂质含量有关），而且脂溶性染料经常形成聚集体，同时死细胞往往荧光更强，从而产生多种可能被误判为活细胞的假象。
可通过转导荧光蛋白来标记细胞，以辅助细胞追踪并省去细胞染色步骤。然而，需确保转导细胞与非转导细胞在斑马鱼异种移植模型中产生相同的结果。
此外，巨噬细胞可吞噬这些荧光标记的细胞碎片，从而被荧光标记并发生迁移，产生假阳性的转移细胞。因此，我们建议采用一系列分析工具，这些工具当然也可扩展应用于其他多种检测指标，以更准确地解读肿瘤行为：
- 增殖 - 使用 DAPI 或抗 pHH3Ser10 抗体（Merck Millipore 货号 #06-570）对有丝分裂相进行定量分析，
- 细胞凋亡性死亡 - 使用抗活化型 Caspase3Asp175 抗体（Cell Signalling Technologies 货号 #9661）或同等抗体，
- 肿瘤大小 - 通过 DAPI 计数人源肿瘤细胞，人源细胞具有非常独特的染色质结构，因此可轻松与斑马鱼细胞区分；在训练识别能力时，也可始终使用染料进行二次确认，
- 转移研究 中为明确检测人源细胞，可使用抗人 HLA 抗体（Abcam EP1395Y 货号 #ab52922）或抗人线粒体抗体（Merck Millipore 货号 #MAB1273-克隆 113-1）。
对于使用DAPI复染的对照癌细胞HCT116（平均细胞核直径为10–12 µm）进行共聚焦成像时，在Z轴堆栈中以5 µm间隔采集图像，我们观察到约50%的细胞会同时出现在两个相邻的切片中。因此，如果对每个切片中的细胞都进行计数，则存在将同一细胞重复计数的高风险。为避免定量分析中的此类问题而反复比对不同切片，会导致耗时且容易出错。为了便于对细胞总数进行定量，并提高不同研究人员之间的可重复性，我们建立了本方案中先前描述的肿瘤大小计算公式8。
我们引入了一个校正系数（1.5），以校正切片间约50%的细胞重叠。研究发现，不同研究人员对整个肿瘤进行手动计数的平均误差为20%。两名研究人员使用该公式时，误差仅为2%。该公式的使用具有93%的准确率和98%的可重复性。我们还测试了自动化方法，但由于阈值设置问题，其误差超过50%。
由于凋亡细胞的特性，活化型Caspase 3阳性细胞的定量较为困难。为了减少错误和结果的变异，我们建议由同一名研究人员对对照组和实验组样本进行计数。此外，在学习该技术时，新手研究人员必须对已有经验丰富的研究人员完成定量的图像进行计数，以比较结果并进行训练。
如果需要，可以延长检测时间。但需要注意的是，斑马鱼幼鱼从受精后约7天（注射后5天）开始需要进行活体喂养。此外，针对受精后超过6天的幼鱼，所适用的动物福利指南和法规可能有所不同。
本方案提供了实用的工具，使单名研究人员每小时可注射约200-300条斑马鱼幼鱼；并在三周内完成包括分析和统计学解释在内的全部实验。我们希望本方案能够帮助研究人员熟练掌握斑马鱼异种移植模型的建立技术。这一过程并不容易，需要不断练习，但您终将成功。祝您好运！
致谢
感谢Champalimaud基金会、Congento（LISBOA-01-0145-FEDER-022170，由FCT/Lisboa2020共同资助） 以及FCT-PTDC/MEC-ONC/31627/2017 提供的经费支持。感谢FCT为VP（SFRH/BD/118252/2016）和MML（PD/BD/138203/2018）提供的博士奖学金。感谢Fior实验室所有成员参与的重要讨论；感谢B. Costa和C. Rebelo de Almeida分享数据；感谢本实验室成员C. Rebelo de Almeida、M. Barroso和L. Leite参与本视频的制作。我们谨向CF鱼类设施（C. Certal、J. Monteiro等）以及Champalimaud传播、活动与外展团队表示感谢，特别感谢Alexandre Azinheira出色的影片制作，以及Catarina Ramos和Teresa Fernandes提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细菌学用琼脂 | VWR | 97064-336 | 琼脂平板 |
| anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | 全组织免疫染色一抗（稀释比例 1:100） |
| anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | 全组织免疫染色一抗（稀释比例 1:100） |
| anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | 全组织免疫染色二抗（稀释比例 1:200） |
| anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | 全组织免疫染色二抗（稀释比例 1:200） |
| CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | 脂溶性染料（稀释比例 1:1000） |
| CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | 脂溶性染料（稀释比例 1:1000） |
| 50 mL 锥形离心管 | VWR | 525-0610 | |
| 15 mL 锥形离心管 | VWR | 525-0604 | |
| DAPI | 细胞核与染色体复染剂 | ||
| 激光拉针仪 P-2000 | Sutter-Instrument | 微电极拉制仪 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Abdos | P10202 | |
| 切边显微镜载玻片 | RS France | BPB016 | 封片用载玻片 |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | 封片介质 |
| 气动皮升注射泵 | World Precision Instruments | PV820 | 微量注射仪 |
| 矩形盖玻片，Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | 封片用盖玻片 |
| SeaKem LE 琼脂糖 | Lonza | 50004 | 琼脂平板 |
| 薄壁玻璃毛细管 | World Precision Instruments | TW100-4 | 硼硅酸盐毛细管 |
| TrypLE | Gibco | 12605036 | 酶解解离溶液 |
| 凡士林 | 用于玻片封固的石油 jelly | ||
| Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | 脂溶性染料（稀释比例 1:1000） |
| Vybrant DiO 细胞标记溶液 | ThermoFisher Scientific | V22886 | 脂溶性染料（稀释比例 1:1000） |
| ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | 荧光体视变倍显微镜 | |
| Zeiss LSM 710 | ZEISS | 共聚焦显微镜 |
参考文献
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