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对城市环境进行拭子采样——从环境储存库中采样与检测 SARS-CoV-2 的流程

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DOI：

10.3791/62379

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2021年4月9日

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1Department of Biology, San Diego State University, 2Viral Information Institute, San Diego State University, 3Big Rose Web Design, LLC

本文内容

摘要

一项公民科学项目旨在招募圣迭戈居民，以采集环境样本用于检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。项目开发了一个多语言的基于网络的平台，通过用户友好的移动设备界面提交数据。实验室信息管理系统支持采集数千份地理分布多样的样本，并实现对结果的实时追踪。

摘要

为控制2020年全球大流行期间严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）在社区中的传播，大多数国家实施了基于人类直接检测、佩戴面部遮盖物以及物体表面消毒的防控策略。基于传播主要途径包括气溶胶和呼吸道飞沫的假设，针对污染物表面（fomites）中SARS-CoV-2的检测工作主要集中于疑似高流行率的场所（如医院病房、邮轮和公共交通系统）。为探究城市环境中极少清洁的物体表面是否存在SARS-CoV-2， 很少进行消毒，从大圣迭戈县招募了350名市民。这些公民科学家共采集了4,080份样本。开发了一个在线平台，用于监控采样套件的配送与回收，并收集样本数据。采样套件主要由疫情期间供应紧张的商店中可获得的物资组装而成。样本处理所用试剂在反复出现供应短缺的情况下仍易于获取。所采用的方法具有高灵敏度，并对环境中常见样本中普遍存在的抑制物具有较强抗性。所提出的实验设计与处理方法成功吸引了大量公民科学家，有效从多种表面区域收集样本。本文所述的工作流程与方法适用于对其他具有公共卫生关切且构成威胁的病毒在城市环境中的调查 未来的大流行病

引言

SARS-CoV-2 被认为主要通过吸入受污染的气溶胶和飞沫，以及与感染者直接接触而传播1,2,3,4。然而，在全球 COVID-19 大流行的初期，控制 SARS-CoV-2 传播的努力主要集中于物体表面消毒、洗手和卫生清洁。到 2020 年底，世界卫生组织（WHO）5 和美国疾病控制与预防中心（CDC）6 的传播指南认为，空气传播主要是在与感染者近距离接触（<2 m）或存在可产生气溶胶的医疗操作时构成风险。接触受污染的表面后自我接种，或吸入悬浮的污染物，作为 SARS-CoV-2 的传播途径，目前尚未被排除 。

已有报道的 COVID-19 病例中，气溶胶传播似乎不太可能7,8。SARS-CoV-2 病毒颗粒在铜表面可保持传染性长达 8 小时，在纸板和不锈钢表面长达 24 小时，在塑料表面长达 48 小时9。在游轮客舱中，乘客离开 17 天后仍可检测到 SARS-CoV-2 的 RNA7。医院和公共交通系统的空气及表面样本中已检测出 SARS-CoV-2 及其他冠状病毒8,10,11,12,13,14。一项针对无症状及轻度/中度症状 COVID-19 患者接触过的万圣节糖果外包装的研究得出结论：操作者洗手并用洗手液清洗糖果，可使 SARS-CoV-2 RNA 降至检测阈值以下15。

已发表的SARS-CoV-2诊断方法包括基于实时逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）16,17、逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）11,18,19,20,21以及CRISPR-Cas技术18,19,22,23的方法。大多数方法需要使用RNA提取试剂盒，而这类试剂盒在全球需求高峰期常常供应不足，且极少用于病毒的环境筛查24。研究表明，使用RT-LAMP检测SARS-CoV-2 RNA与使用RT-qPCR的符合率超过83%。此外，与RT-qPCR相比，RT-LAMP使不确定结果的比例降低了25%15。

RT-LAMP 是一种简单的方法，利用逆转录酶以 RNA 为模板合成 cDNA25，随后通过具有强链置换活性的 DNA 聚合酶在恒定温度下合成 DNA（即等温扩增）26。通过使用识别靶标 DNA 六个或八个区域的四对或六对引物，可提高病毒基因组检测的特异性。扩增由一个内引物启动，产生半双链 DNA 结构。随后由外引物扩增前导链。反向引物也进行类似的重复扩增。两端的内引物和外引物均含有内部反向自互补 位点，可在扩增产物中形成环状结构26,27。在等温链置换过程中，非同步的 DNA 合成可产生大量扩增产物，持续的聚合反应可将每反应低至 10 个拷贝的信号进行扩增11,20,28。比色法 RT-LAMP 反应体系缓冲能力较弱，使用酚红作为 pH 指示剂。当聚合酶掺入一个核苷酸时，会释放一个质子，足够数量的质子将改变溶液的 pH 值，使颜色由粉红色变为黄色11,20,28,29。

RT-LAMP 技术的开发旨在用于缺乏完备实验室设备的基层医疗机构中检测蚊媒传播疾病25，以及快速检测其他RNA病毒，例如人类免疫缺陷病毒30。根据世界卫生组织的定义，在疫情暴发期间最脆弱的人群往往缺乏足够的经济资源和适当的检测设备（联合国全球公共卫生议程）。在当前的 SARS-CoV-2 大流行中，医用级采样拭子和RNA提取试剂盒等物资无法满足全球需求，尤其是在非生产国。本方案采用基于硫氰酸胍（GITC）的粗提RNA方法，可在无需冷链的条件下有效保存RNA，并显著降低样本中抑制物的残留。此外，GITC-氯仿提取法通过将RNA与DNA和蛋白质分离，再分别进行沉淀，从而实现大部分遗传物质的回收 。只要采取适当措施向公众科学家充分告知相关风险，这些优势就超过了其在操作化学品时可能带来的潜在危害 。

所提出的实验流程使用了常规通用的材料和试剂。它 需要的设备在基础的、通常是农村的实验室环境中即可获得。这些方法成本低廉，对环境样本或无法使用提取试剂盒处理的样本中常见的抑制剂具有高度抗性，并且无需高精度的热循环仪。本研究提出了一种从家庭和城市环境中常被触摸且很少消毒的表面采集和检测环境储存库中SARS-CoV-2的流程。

方案

有关试剂和耗材的详细列表，包括目录号、生产商及相应成本，请参见材料表。

1. 城市环境采样

  1. 公民科学家外展
    1. 通过本地媒体和社交媒体发布直接且明确的行动号召，招募公民科学家。创建一个社交媒体标签（例如 #swab4corona），以在社交媒体内容中统一主题。
    2. 建立一个电子邮件账户，用于实验室团队与每位公民科学家之间的直接沟通，由精通目标地区主要语言（例如，圣地亚哥县的西班牙语和英语）的人员管理。
    3. 构建一个安全的基于网络的样本管理平台（SMP），作为数据库、 实验室信息管理系统（LIMS），并用于与公民科学家进行沟通。
      注：SMP 提供一个集中化的平台，用户可在其中申请试剂盒、访问样本采集方案、提交样本元数据，并为已完成的样本试剂盒申请取件服务。
    4. 创建指向 SMP 的链接（例如，https://demo.covidsample.org/） （图1），供个人通过填写在线表格回答生物安全相关问题，申请参与环境采样工作。
    5. 通过云计算机服务提供商支持的身份验证应用程序编程接口（API）实现对 SMP 的安全访问，并向已批准的用户授予 SMP 访问权限。
      注：有关身份验证和授权的 OAuth 2.0 协议描述，请参考相关文献31。该协议 为公民科学家志愿者提供无缝的登录流程，允许用户使用现有账户登录，无需开发自定义登录系统或管理用户凭证，从而节省大量时间并鼓励参与。根据近期报告，所选云计算机服务提供商提供的免费电子邮件服务拥有约 15 亿月活跃用户；要求参与者使用该服务提供商的电子邮件账户并不被视为阻碍因素。
    6. 在公民科学家申请首个试剂盒之前，通过 SMP 向其说明研究目的及生物安全注意事项。提供多语言插件，支持用户使用由云计算机服务提供商支持的多语言神经机器翻译服务所提供的任意语言进行导航。
    7. 在采样部分提供英文和西班牙文的图文及音视频操作指南。
    8. 为每个试剂盒分配唯一标识符，并设计用户界面，使用与样本编号（Sample ID）关联的按钮，以简化数据录入流程（图1A）。
    9. 使用配备移动设备应用程序的配送路线规划软件，供司机优化配送/取件路线，并向公民科学家准确通知预计到达时间。
    10. 在 PHP 网络服务架构上构建 LIMS 平台，并将其托管于商业托管平台（建议的操作系统、Web 服务器软件和数据库软件详见材料表）。
    11. 提供安全的基于网络的应用程序接口，使实验室人员能够快速、便捷地在 LIMS 中管理数据。利用云计算机服务提供商支持的数据图表应用程序编程接口实现数据可视化。
    12. 利用云计算机服务提供商支持的地理空间应用程序编程接口可视化地理空间数据。通过 SMP 提交至 LIMS 的数据应进行存储，以支持（1）项目数据的集中存储；（2）样本/数据处理流程的追踪；（3）向公民科学家分发样本试剂盒的物流管理。
    13. 采用最佳实践方法保护所提交的元数据（例如，https://demo.covidsample.org/）。 
    14. 预加载样本试剂盒编号、样本编号、日期、时间以及全球定位系统（GPS）坐标（自动从采样点照片中获取），以确保数据类型合规，并最大限度减少用户提交错误或缺失数据的情况（图1B）。以下字段需由公民科学家手动快速（<1 分钟）填写：采样日期和时间、位置简要描述以及采样点照片。
    15. 对所有上传 的数据进行清理，并验证数据类型。例如，验证用户上传的图像数据，仅接受 .jpg 文件，使用样本编号重命名文件以便快速关联样本， 并将上传的图像存储在用户无法访问的安全独立位置。
    16. 当所有样本（共 16 个）完成采集后，激活试剂盒配送与取件请求选项。此外，在取走上一个试剂盒的同时，激活申请新试剂盒配送的选项（图1A）。
      注：对于偏好非网络平台或担心披露其 GPS 位置的志愿者（例如，对自身移民身份有所顾虑的社区成员），可在双方约定的地点交付试剂盒，并请志愿者以书面形式记录数据采集信息。实验室与每位公民科学家之间的沟通，应安排项目中的双语成员负责电话和短信联系。
  2. 冠状病毒采样
    1. 确定采样工作的流行病学相关时间窗口。
    2. 构建一个包含所有采样用品的试剂盒，包括必要的个人防护装备（即口罩、手套）、采样方案以及与生物安全相关的信息（图2）。为每根试管预先贴上分配的唯一标识符（样本编号）。
    3. 对家庭和城市环境中暴露于气溶胶污染物但极少消毒的表面进行拭子采样。
      1. 在公共场所佩戴提供的口罩，并为采集每个样本使用新的手套，以避免交叉污染。采样结束后，使用提供的手部消毒剂。
      2. 用清洁剂（例如，0.5% 十二烷基硫酸钠（SDS））润湿一块 1 cm2 的聚酯吸收性拭子（例如，拖把垫），通过破坏病毒包膜使其失活，并通过诱导核糖核酸酶（RNase）去折叠来稳定裸露的 RNA32。
      3. 对 10 cm2 的表面进行拭子采样。借助牙签，将每个采样拭子完全浸入对应预标记试管中，试管内含 200 µL 硫氰酸胍溶液（GITC）。将试管在 4 °C 下保存，直至运送至实验室。样本到达 实验室后，应储存于 -80 °C。
        注：GITC 为有毒刺激物，避免接触皮肤。GITC 溶液可使用常见实验室化学品简便配制，配方见文献33,34。该溶液可使病毒失活，通过使 RNase 变性来稳定 RNA34,35,36，并可在室温下稳定样本。然而，试剂盒中仍包含冰袋，以确保样本保持低温，无需使用家用冰箱储存。

2. SARS-CoV-2 检测

  1. 总RNA提取
    1. 使用2 mM硫酸铜和3%过氧化氢溶液对台面、设备和移液器进行消毒；随后使用含10%次氯酸钠、90 mM碳酸氢钠、5%十二烷基硫酸钠（SDS）和2.5%氢氧化钠（NaOH）的溶液处理。用蒸馏水彻底擦拭，再用75%乙醇擦拭。
      注意：这些溶液可作为市售消毒液的替代品。
    2. 将样品置于冰上解冻。以中等速度涡旋振荡2分钟。
    3. 为提高筛查速度，可将样品分组处理。若某组结果为阳性，则需对组内各样本单独提取RNA以确定阳性样本。将每个采样套件中的样品（共16个）分为2组，每组8个样品。
      注意：每组包含8个样本，意味着每个套件仅需处理2个组。若某组结果为阳性，则需重新处理该组内各个样本，进行单独的RT-LAMP分析。此方法可节省时间、降低成本并减少试剂消耗。
    4. 将8个样本各取50 µL加入同一微量离心管中（总体积400 µL）；剩余样本保存于-80 °C。加入0.2倍体积（80 µL）氯仿，涡旋振荡15秒，然后在4 °C孵育20分钟。在4 °C下以13,000 × g离心20分钟。
    5. 将水相（澄清液体）转移至新的微量离心管中。将剩余的界面层和粉红色液体保存于-80 °C冰箱中；这些组分含有DNA和蛋白质33,36。
    6. 加入等体积异丙醇（约200 µL）和2.6 µL糖原共沉淀剂（15 mg mL-1）37。充分混匀后，在-20 °C孵育至少1小时，随后在4 °C孵育10分钟以沉淀RNA。
      ​注意：此处可通过在-20 °C过夜孵育代替1小时孵育，暂停实验流程。
    7. 在4 °C下以13,000 × g离心20分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀。将沉淀重悬于50 µL焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水中，加入等体积（50 µL）无RNase的5 M醋酸铵和2.5倍体积（250 µL）100%乙醇7,38。
      注意：若在后续步骤中使用多核苷酸激酶，铵离子会对其产生抑制作用38。该混合液可使RNA沉淀，而脱氧核苷三磷酸和寡糖则保留在溶液中38。
    8. 充分混匀，在-20 °C孵育至少1小时，随后在4 °C孵育10分钟以沉淀RNA。
      注意：此处可通过在-20 °C过夜孵育代替1小时孵育，暂停实验流程。
    9. 在4 °C下以13,000 × g离心20分钟。用1 mL预冷（-20 °C）的新鲜配制75%乙醇洗涤沉淀。在4 °C下以8,000 × g离心5分钟。使用P10移液器小心移除上清液，避免扰动沉淀。
    10. 将沉淀在空气中干燥10–15分钟，直至无残留乙醇。将沉淀重悬于50 µL DEPC处理过的水中，加入5 µL 10× DNase缓冲液和1 µL DNase（2 Units µL-1），在37 °C孵育30分钟。
    11. 加入0.1倍体积（5.6 µL）DNase失活试剂，在室温孵育5分钟，每隔1分钟轻轻混匀一次。在13,000 × g下离心2分钟，将上清液转移至新管中（约50 µL）。立即置于冰上，用于准备RT-qPCR或RT-LAMP反应，或保存于-20 °C冰箱中。
      注意：RNA提取应在无扩增子污染的环境中进行，以避免交叉污染。
  2. 多重反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）
    1. 为每组引物 （表1） 配制20X 引物混合液 （表2）。在室温下配制RT-LAMP反应体系 （表3），额外增加10%体积以补偿移液损耗。
      注意：含有南极热不稳定尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）的显色法LAMP 2X预混液可防止前次反应中DNA污染的扩增20,28。
    2. 涡旋振荡并短暂离心混合液。向每个反应管中加入20 µL混合液：样本、加标、阳性对照和阴性对照。将反应管在室温孵育10分钟，使UDG作用于可能存在的残留污染。
    3. 向样本反应中加入5 µL RNA，向加标反应中加入5 µL RNA和2.5 µL（450拷贝）合成SARS-CoV-2 RNA，向阳性对照反应中加入2.5 µL（450拷贝）合成SARS-CoV-2 RNA，向阴性对照反应中加入5 µL H2O。充分混匀后短暂离心；所有RNA均需在冰上解冻。
    4. 当热循环仪或水浴锅升温至65 °C时，保持所有反应体系处于室温。UDG在 高于>50 °C时失活。将反应管放入热循环仪（使用加热盖），在65 °C孵育40分钟，随后让反应体系自然冷却至室温（约22 °C，5分钟），或在冰上冷却1分钟。通过显色变化（肉眼观察）或琼脂糖凝胶电泳分析结果。
      注意：尽管检测下限（LOD）为每反应10拷贝，但当每反应拷贝数接近500时，检出频率显著升高（图3A）。对于显色观察，阴性结果呈粉红色（pH = 8.8），阳性结果呈黄色（pH = 5）（图3B）。显色法可在扩增后避免打开RT-LAMP管，从而减少工作环境中RT-LAMP产物的释放及交叉污染风险。 进行凝胶电泳时，使用0.5% Tris/硼酸/EDTA（TBE）缓冲液配制1.5%琼脂糖凝胶，并加入1X DNA染料。每孔上样25 μL反应产物和5 μL 6X上样缓冲液。以100 V电压电泳60分钟。阳性样本呈现梯状条带，无需使用分子量标记物（图3C）。

结果

由公民科学家采集的用于检测SARS-CoV-2的样本。 在为期8个月的时间内（2020年3月中旬至11月下旬），共有482名公民获准参与本项目，其中350人（73%）申请了采样套件。总计发放了362套采样套件（部分参与者申请了多套），其中246套（70%）被寄回（图4A，B）。这些套件中包含的全部4,080份样本均已完成处理。采样地点覆盖该县的北海岸、北中部、中部和南部地区，以及少数东部地区（图4A）。根据圣迭戈人类卫生服务局的报告，这些地区是圣迭戈县人口密度最高、且记录的COVID-19病例最多的区域39。

市民要求领取了大多数采样套件（即平均成功率为70.4%）。每天有1至16套套件被领取，0至14套套件被送回实验室（图4B）。对公民科学家的调查显示，完成一套完整套件（16个样本）的采集平均需要1至3小时，分布在约8天内完成（图4A 和 表4）。绝大多数套件是完整的（91.1%），即所有16个采样管中均包含拭子，并且相应的采样数据已上传至实验室信息管理系统（LIMS）（图4A 和 表4）。

使用GITC-氯仿提取和多重逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测SARS-CoV-2。 在比色法RT-LAMP检测中，采用两组引物11,20,28 靶向核衣壳（N2）和包膜（E1）基因 （表2）。这些引物识别的序列区域与美国疾病控制与预防中心（CDC）40 和欧盟（EU）41 批准用于RT-qPCR方法进行人类COVID-19诊断的引物和探针区域相同。这些结果印证了Zhang等28 的报道，即在多重反应中加入60 mM盐酸胍可提高检测下限（LOD）。在100%检出频率下，检测下限为每25 µL反应体系中500个拷贝 （图3A，B）。在比色法RT-LAMP中，阳性样本因pH值从约8降至5.5而由粉红色变为黄色 （图3B）。当低拷贝数样本反应呈现橙色时，将其在1.5%琼脂糖凝胶中电泳以确认其为阳性，结果显示为梯状条带模式 （图3C）。RT-LAMP被用于检测混合RNA样本中的SARS-CoV-2。

为排除因反应抑制剂导致的假阴性结果，每个样本均额外进行一次添加了500拷贝合成SARS-CoV-2的反应测试。对于检测呈阳性的混合样本，通过分离池中各单个样本的RNA，并分别进行RT-LAMP反应，以确定阳性样本的具体来源。检测结果随后上传至实验室信息管理系统（LIMS），将唯一的样本编号与采样日期、时间、GPS坐标、采样地点及样本图像等信息进行关联。

实时和传统反转录 PCR 方法：样本污染物的抑制作用。为了选择适用于拟议检测流程的最佳方法，使用由一组试点公民科学家收集的环境样本测试了其他RNA扩增方法。每种方法的结果示例如图5所示，用以展示在病毒拷贝数浓度较低时，这些方法对环境抑制物和背景信号噪声的敏感性。

测试了六种经美国疾病控制与预防中心（CDC）和世界卫生组织（WHO）批准的RT-qPCR试剂配方（材料表），用于环境样本中病毒的检测。检测操作遵循制造商说明书以及CDC关于在临床环境中检测SARS-CoV-2的指南40。在粗提RNA后，将含有不同浓度合成SARS-CoV-2 RNA对照品的反应体系加入拭子采集的表面样本中。所有预混液在阳性对照的检出限（LOD）浓度下均对抑制物敏感（图5A）。

为了规避这些实时检测技术的抑制物影响，测试了一种传统的RT-PCR系统。采用一步法RT-PCR系统（材料表），使用美国疾病控制与预防中心（CDC）和欧洲疾病预防与控制中心（ECDC）分别批准的引物组N1、N2扩增核衣壳基因，以及引物组E1扩增包膜基因（表2）。实验操作严格遵循制造商说明书以及CDC关于临床环境中SARS-CoV-2检测的指导方案40。由CDC设计的引物组N1和N2可扩增出约70 bp的产物；然而，在低拷贝数样本中，阳性信号无法与阴性对照的扩增背景噪音区分开来（图5B），从而导致结果出现假阳性。而E1引物扩增产物在低拷贝数时信号微弱（图5B），导致结果中出现假阴性。此外，所测试的RT-PCR方法仍对环境样本中存在的抑制物敏感（数据未显示）。

已开发出其他方法用于检测极微量的目标序列。其中一种方法是滚环扩增（Rolling Circle Amplification, RCA），该方法通过特异性线性探针识别目标RNA或DNA序列后，由连接酶将探针模板环化。利用设计为与探针杂交的引物，在等温反应中通过具有链置换活性的DNA聚合酶对探针进行扩增42。该方法扩增的是识别目标序列的探针本身，而非目标序列，因此具有很高的灵敏度43。Wang等44发表了一种直接检测SARS-CoV-1 RNA的RCA方案。该方法经修改后使用针对SARS-CoV-2的特异性引物。然而，在无模板对照（NTC）中，即使使用多种不同的连接酶（包括对单核苷酸多态性敏感的连接酶），探针仍会发生环化并在无RNA模板的情况下产生扩增产物。而在缺乏连接酶的情况下，线性化探针在NTC中未出现扩增信号（图5C）。

用于城市研究的智能手机样本数据录入界面的 SARS-CoV-2 检测流程图。
图 1：基于网页的采样平台及其适用于移动设备的样本数据采集界面。（A）建立了一个包含多语言插件的网站，用于协调实验室与公民科学家之间的互动。该平台用于样本套件的递送/取回申请以及样本数据的提交。平台内含详细的英文/西班牙文图文及音视频采样操作规程。（B）用于上传样本数据的移动设备界面：日期、时间、GPS 坐标、采样点描述以及采样现场的照片。缩写：SARS-CoV-2 = severe acute respiratory syndrome coronavirus 2；GPS = Global Positioning System。请点击此处查看此图的放大版本。

RNA病毒采样装置示意图；包括个人防护装备、安全说明书、冷藏箱、试管、手套、棉签、消毒剂。示意图。
图2：样本采集工具包。 公民科学家收到一个冷藏箱，内含两个冰袋、一份安全数据说明书（用于告知志愿者处理GITC溶液时可能存在的危险）、详细的采样和佩戴口罩操作规程、一个KN95口罩、一个废弃物收集袋、一瓶手部消毒液、一瓶0.5% SDS溶液、16副手套、一个小袋（内含16根牙签和16根聚酯棉签）、16个预先标记的微量离心管（每管含200 µL GITC溶液）、一个用于存放采样管的盒子，以及一个作为管盒次级容器的袋子（以防发生泄漏）。缩写：GITC = 异硫氰酸胍；SDS = 十二烷基硫酸钠。 请点击此处查看该图的放大版本。

SARS-CoV-2 检测阳性率；箱形图，比色试管，RNA 凝胶电泳。
图 3：多重逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测。 使用针对 SARS-CoV-2 核衣壳（N2）和包膜（E1）基因的引物进行多重反应，可检测每反应中低至 10 个病毒拷贝。合成的 SARS-CoV-2 RNA 用作阳性对照。(A) 在不同基因组拷贝数条件下，多重比色 RT-LAMP 检测 SARS-CoV-2 的检出频率。粉色表示五个重复的平均值。(B) 多重比色 RT-LAMP 检测 SARS-CoV-2 的检测下限（LOD）；黄色 = 阳性（pH ~5）；粉色 = 阴性（pH ~8）。(C) SARS-CoV-2 阳性 RT-LAMP 反应在 1.5% 琼脂糖凝胶电泳中呈现的梯状条带模式。缩写：SARS-CoV-2 = 严重急性呼吸综合征冠状病毒 2；rxn = 反应。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示数据请求、试剂盒请求趋势的地理分布图和饼状图。
图 4：公民科学家采样试剂盒在圣迭戈县的分布位置及试剂盒申请的成功率。（A）橙色圆点代表一个采样试剂盒的位置，每个试剂盒包含16个样本。蓝色饼状图显示了从试剂盒送达公民科学家手中到其返回实验室之间所用天数的占比情况（括号内为天数）。橙色饼状图显示了每个试剂盒中完成采样数量（共16个样本）的百分比，括号内为样本管中包含拭子且相应采样数据已上传至实验室信息管理系统（LIMS）的完成样本数量。（B）相对于试剂盒申请日期，返回至实验室的试剂盒百分比（圆点），以及申请试剂盒的总数（柱状图）。请点击此处查看该图的放大版本。

PCR amplification graph and gel electrophoresis results; cycle threshold for DNA quantification.
图5替代性 SARS-CoV-2 RNA 检测方法 (A) SARS-CoV-2 核衣壳蛋白的 RT-qPCR 检测 (N) 基因，使用引物组 N2混合环境样本中添加了900（绿色）或9（橙色）拷贝的SARS-CoV-2。相同拷贝数的阳性对照为蓝色。箭头指示当存在环境样本时，低拷贝数阳性对照的荧光检测信号下降。B传统RT-PCR检测SARS-CoV-2。上图：使用引物组扩增核衣壳基因的RT-PCR产物 N1 和 N2无模板对照中观察到微弱的背景信号。底部: 使用引物组对包膜基因进行RT-PCR扩增产物 E1在检测限浓度下观察到信号非常微弱。蓝色箭头指示预期的阳性产物：（上）约 70 bp 和（下）在 2% 琼脂糖凝胶电泳中为 113 bp。CSARS-CoV-2 RNA的RCA检测. 在连接酶存在且无RNA模板（NTC）的条件下，环形探针发生扩增cir）；在无连接酶和RNA模板的情况下，线性探针不会扩增（NTClin缩写：SARS-CoV-2 = 严重急性呼吸综合征冠状病毒2；RFU = 相对荧光单位；bp = 碱基对；rxn = 反应；MM = 分子标记物；RT-PCR = 逆转录聚合酶链式反应；RT-qPCR = 实时定量RT-PCR；RCA = 滚环扩增；NTC = 无模板对照；LOD = 检测限；rxn = 反应。 请点击此处以查看此图的放大版本。

引物20X 浓度 (μM)1X 浓度 (μM)
FIP321.6
BIP321.6
F340.2
B340.2
LoopF80.4
LoopB80.4

表1：20X 逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）引物混合液的配制方案。 在RT-LAMP反应中，6条引物识别靶DNA的8个区域。缩写： reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification（逆转录环介导等温扩增）；FIP = 正向内引物；BIP = 反向内引物；F3 = 正向置换引物；B3 = 反向置换引物；LoopF = 正向环引物；LoopB = 反向环引物。

引物序列靶标产物大小
RT-LAMP9,18,19
E1-F3TGAGTACGAACTTATGTACTCATE梯状条带模式
E1-B3TTCAGATTTTTAACACGAGAGT
E1-FIPACCACGAAAGCAAGAAAAAGAAGTTCGTTTCGGAAGAGACAG
E1-BIPTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT
E1-LoopBGCGCTTCGATTGTGTGCGT
E1-LoopFCGCTATTAACTATTAACG
N2-F3ACCAGGAACTAATCAGACAAGN
N2-B3GACTTGATCTTTGAAATTTGGATCT
N2-FIPTTCCGAAGAACGCTGAAGCGGAACTGATTACAAACATTGGCC
N2-BIPCGCATTGGCATGGAAGTCACAATTTGATGGCACCTGTGTA
N2-LoopFGGGGGCAAATTGTGCAATTTG
N2-LoopBCTTCGGGAACGTGGTTGACC
RT-qPCR38
2019-nCoV_N1-FGACCCCAAAATCAGCGAAATN72 bp
2019-nCoV_N1-RTCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG
2019-nCoV_N1-P5’-FAM-ACC CCG CAT TAC GTT TGG TGG ACC-BHQ1-3’
2019-nCoV_N2-FTTACAAACATTGGCCGCAAAN67 bp
2019-nCoV_N2-RGCGCGACATTCCGAAGAA
2019-nCoV_N2-P5’-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-BHQ1-3’
RT-PCR39
E1_Sarbeco_FACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTE113 bp
E1_Sarbeco_RATATTGCAGCAGTACGCACACA

表2：用于RT-LAMP、RT-qPCR和RT-PCR的引物。 列出了引物序列、靶基因、预期产物大小及相应参考文献。缩写：RT-LAMP = 逆转录环介导等温扩增；RT-PCR = 逆转录聚合酶链反应；bp = 碱基对；RT-qPCR = 实时定量RT-PCR；E1 = 包膜蛋白基因；N2 = 核衣壳蛋白基因；F = 正向引物；R = 反向引物；P = 探针；FIP = 正向内引物；BIP = 反向内引物；F3 = 正向外引物；B3 = 反向外引物；LoopF = 正向环引物；LoopB = 反向环引物。

试剂体积 (μL)
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG12.5
N2 引物混合液 (20x)1.25
E1 引物混合液 (20x)1.25
盐酸胍 (600 mM)*2.5
靶标 RNA5
无核酸酶水 H2O2.5
总体积25

表3：多重比色RT-LAMP反应主混合液。（*）盐酸胍可通过一种尚未明确的机制提高反应的灵敏度和速度28。缩写：LAMP = 环介导等温扩增；UDG = 尿嘧啶-DNA糖基化酶；N2 = 核衣壳基因；E1 = 包膜基因；DEPC = 焦碳酸二乙酯。

已批准的参与者申请试剂盒的参与者已送达的试剂盒已返还的采样试剂盒用于采样的天数完整试剂盒比例不完整试剂盒比例已处理的样本
48272.6% (350/482)36270.4% (255/362)平均值891.1% (224/246)8.9% (22/246)4,080
中位数3

表4：新冠病毒（SARS-CoV-2）采样数据统计。 外展与采样成功率。缩写：SARS-CoV-2 = 严重急性呼吸综合征冠状病毒2。

讨论

公民科学家参与。 招募公民科学家在圣迭戈县范围内对各类表面进行拭子采样，以检测城市环境中是否存在严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。大多数发放的采样套件（70%）被送回实验室，其中几乎全部样本均完整无缺（91%）（图3A，B 和表4）。志愿者可通过基于网络的平台轻松申请套件的递送或取件，而递送路线规划软件会向公民科学家通知预计到达时间，这两项因素很可能对所观察到的成功率具有重要影响。从采样套件送达公民科学家手中至其返回实验室的平均时间为8天，中位数为3天，时间范围为1至64天（图3A 和表4）。对志愿者进行更频繁的提醒可能会进一步缩短这一滞后时间。

大多数用户（73%）成功使用了该数据采集平台（表4）。尽管未对公民科学家所付出的努力进行量化，但实地测试表明，该数据采集平台显著减少了正确完成样本采集所需的工作量和时间。因此，减少记录工作 有助于提高公民科学家的参与度。该基于网络的平台旨在通过提供多语言神经机器翻译服务，以及提供英文和西班牙文的图形化和音视频操作指南，以克服人口统计学上的局限性。然而，这一目标仅部分实现，因为在该县大多数西班牙裔/拉丁裔人口居住的南湾和北县地区，采集到的样本数量较少45。这些地区还集中了圣迭戈县63%的新冠肺炎总病例（每10万人中有1,700例），疾病流行率最高46，住院率也最高（62%）47,48。尽管大多数样本来自中部县区，但在受新冠肺炎影响最严重的区域也采集到了具有代表性的样本数量，且仅有少量样本呈阳性，这表明城市环境中SARS-CoV-2的表面储存库相对罕见。

样本处理。 采样拭子用SDS润湿，通过破坏病毒包膜使其失活，并通过使RNase解折叠来稳定裸露的RNA32。在采样过程中，拭子中的洗涤剂可同时清洁采样表面。环境样本中通常含有极微量的RNA。为了最大限度地回收RNA，采用基于GITC的、无需离心柱的粗提取方法进行RNA分离。GITC是一种强变性剂，可破坏维持蛋白质折叠的氢键（即疏水效应），从而导致病毒颗粒失活，同时因抑制RNase活性而使RNA保持稳定34,35,36。GITC溶液可在无需严格冷链的条件下维持RNA样本的稳定性，因此当无法提供冰袋冷冻保存时，民众可将样本置于室温保存。为降低该试剂在直接接触皮肤或黏膜时可能带来的风险，已在试剂盒中附带材料安全数据表以提醒民众注意相关风险 ，并在装有采样管的盒子上贴有警示封条 。

粗提的GITC-氯仿提取法有助于从拭子中回收微量RNA，且通过加标样品的扩增结果可见，提取后样品中极少残留抑制物。对于SARS-CoV-2检测呈阴性且未显示RT-LAMP抑制的样品，其结果代表真实阴性，或病毒拷贝数低于检测下限（LOD），在100%频率下均如此。相反，表面检出病毒RNA并不直接意味着存在通过接触传播的风险，因为阳性样品中病毒的感染性仍需进一步验证。对环境进行及时筛查至关重要，该筛查不应受限于复杂试剂的可及性或高资质人员的配备，以评估表面是否构成病毒储存库，并更有效地指导预防与控制措施。

选择RT-LAMP作为适用于所提出检测流程的最佳方法。该方法已被证明是一种快速且成本低廉的技术，对大多数残留抑制物具有高度耐受性，且其灵敏度和特异性与其他RT-qPCR方法相当。由于在SARS-CoV-2大流行期间临床环境中的广泛应用，RT-qPCR试剂盒的供应受到全球需求的影响。此外，即使采用其他常见策略减少抑制物对酶结合位点的竞争，RT-qPCR技术（包括那些设计为抗抑制物的试剂盒）仍对公民科学家试点队列所采集环境样本中的某些物质敏感49。这些发现得到了最近一项研究的支持，该研究比较了两种方法在检测由COVID-19患者接触过的糖果拭子样本中SARS-CoV-2的表现，结果显示两种方法的结果一致性超过83%，而RT-LAMP检测样本中的抑制效应降低了25%15。此外，采用GITC-氯仿粗提取结合RT-LAMP的方法，与RNA试剂盒提取结合RT-qPCR相比，使试剂和耗材成本降低了42%（材料表）。

该方法实现了对数千个表面拭子样本的高通量分析。从RNA提取到通过RT-LAMP检测SARS-CoV-2，最多80个样本池（代表640个样本）可在2 天内完成处理。所提出的方案为半定量方法， 仅限于病毒RNA的检测，无法指示具有感染性的病毒颗粒的存在。需要进一步分析以评估从采样表面存在的被污染物体传播SARS-CoV-2的风险。

本研究提出了一种快速建立检测策略的方案，该方案在面对传染性疾病引发的公共卫生紧急事件时，包含有效的操作流程。 所建议的采样方案简便易行，使用家庭中常见的物品作为材料，病毒检测方法则可在基础实验室条件下进行，例如以水浴锅替代热循环仪。RT-LAMP试剂的成本显著低于RT-qPCR所需试剂，且不易受全球高需求情况的影响。本研究为今后在疫情暴发和全球大流行期间评估环境中的病毒储存库提供了一个可行的框架。

披露

所有作者均声明不存在竞争利益。

致谢

我们感谢病毒信息研究所（VII）的研究人员， Anca M. Segall 博士、Willow Segall、Patricia L. Rohwer、Gary Rohwer、Cary L. Rohwer、Magda Silvia Pinetta、Elizabeth Cruz Cano、Gregory Peters 博士、Stuart A. Sandin 博士和 Jennifer Smith 博士，感谢他们抽出时间采集大量样本。我们还感谢加利福尼亚大学圣地亚哥分校医学院（UCSD）儿科系的 Rob Knight 博士、Jack Gilbert 博士、Pedro Balda-Ferre 博士和 Sarah Allard 博士，他们为提供阳性对照及有益反馈提供了支持。感谢 Stacey Carota（SDSU 理学院）和 Gina Spidel（SDSU）提供的后勤支持，以及 Juan Rodríguez 对采样方案的艺术设计与图形制作。感谢所有参与者在极其困难时期对本项目的投入与奉献。本研究工作得到了 Jo Ann Lane 博士（SDSU 理学院）的慷慨捐赠以及 美国国家科学基金会快速响应研究资助：SARS-CoV-2环境储存库（资助编号：2030479）

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>SMP、LIMS 与社区 outreach：
认证应用程序编程接口谷歌谷歌账号登录
商业托管平台GoDaddy
数据图表应用程序编程接口谷歌谷歌图表
数据库软件MySQL 
配送路线规划软件 电路团队版电路
免费电子邮件服务谷歌谷歌邮箱
地理空间应用程序编程接口谷歌Google Maps API
多语言神经机器翻译服务谷歌谷歌翻译
在线表格谷歌谷歌表单
操作系统Linux
网页与数据库开发 Big Rose 网页设计
Web 服务器软件阿帕奇 
<强>采样工具包：
冷却器科尔曼（亚马逊）B00363X3F2每100次反应成本（美元）：70
加仑装Ziploc密封袋索利莫（亚马逊）B07BJ495GL每100次反应成本（美元）：18
甘油（洗手液）FischerScientificG33-4每100次反应成本（美元）：9
冰袋冰糖度计（Amazon）B075GLD3X1每100次反应成本（美元）：110
异丙醇（洗手消毒剂）FischerScientificAA36644K7每100次反应成本（美元）：43
KN95口罩Echo-SigmaEcho-Sigma每100次反应成本（美元）：400
实验方案用纸与Trizol安全数据表Office Depot348037每100次反应成本（美元）：36
30 mL 喷雾瓶（SDS 和手部消毒剂）Anyumocz（亚马逊）B07T64FHXR每100次反应成本（美元）：80
RNase、DNase、DNA &无DNA酶、RNA酶及PCR抑制剂的微量离心管Genesee Scientific22-281每100次反应成本（美元）：83
样品编号耐溶剂标签实验室标签XST-10C1-1WH每100次反应成本（美元）：68
Swiffer WetJet 拖布垫（拭子）Swiffer（亚马逊）B001F0RBT2每100次反应成本（美元）：8
牙签厨房必备品（Amazon）B00PBK4NG6每100次反应成本（美元）：8
Trizol 试剂（异硫氰酸胍溶液 - GITC），非 LSInvitrogen15596018每100次反应成本（美元）：40
试管盒Genesee Scientific21-119每100次反应成本（美元）：180
小型自封袋Ziploc（亚马逊）B01LRKEI9K每100次反应成本（美元）：8
Zebra 热转印台式打印机 斑马GK420t
每100次反应的采样试剂盒总成本（美元）：1,160
<强>Trizol RNA 提取
无RNase乙酸铵InvitrogenAM9070G每100次反应成本（美元）：2
氯仿FisherScientificC298-500每100次反应成本（美元）：2
GlycoBlue（糖原 15 mg/mL）InvitrogenAM9515每100次反应成本（美元）：80
分子生物学级无水乙醇（200 proof）FisherScientificBP2818500每100次反应成本（美元）：30
分子级异丙醇FisherScientificBP2618500每100次反应成本（美元）：3
TURBO DNA-free 试剂盒 InvitrogenAM1907每100次反应成本（美元）：110
<强>多重比色RT-LAMP：
盐酸胍Alfa AesarAAJ6548522每100次反应成本（美元）：1
RT-LAMP E1引物IDTn/a每100次反应成本（美元）：7
RT-LAMP N2引物IDTn/a每100次反应成本（美元）：7
合成的 SARS-CoV-2 RNAATCCVR-3276SD每100次反应成本（美元）：14
含 UDG 的 WarmStart 比色 LAMP 2X 预混液NEBM1800S每100次反应成本（美元）：210
Eppendorf Mastercycler Pro 梯度PCR仪Eppendorf950030010
Trizol总RNA提取 + LAMP每100次反应成本（美元）：470
<强>RNA提取试剂盒：
QIAamp DSP病毒RNA小型试剂盒Qiagen61904每100次反应成本（美元）：570
<强>实时定量聚合酶链式反应
合成的 SARS-CoV-2 RNAATCCVR-3276SD每100次反应成本（美元）：14
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix应用生物系统公司4444432每100次反应成本（美元）：180
SARS-CoV-2（2019-nCoV）N1、N2 引物和探针IDT10006713每100次反应成本（美元）：20
qScript XLT 一 步法 RT-qPCR ToughMixQuantabio95132-100
QuantiNova 病原体 Qiagen208652
QuantiNova 探针Qiagen208352
UltraPlex 1-Step ToughMix Quantabio95166-100
CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统伯乐（BioRad）1855196
RNA提取试剂盒 + RT-qPCR 每100次反应成本（美元）：790 
<强>RT-PCR
SuperScript IV 一步法 RT-PCR Invitrogen12594025
<强>实验室清理：
DNAZapInvitrogenAM9890
RNAZapInvitrogenAM9780

参考文献

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对城市环境进行拭子采样——从环境储存库中采样与检测 SARS-CoV-2 的流程
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