Method Article

城市环境 -环境水库SARS-CoV-2采样和检测管道

DOI:

10.3791/62379

⸱

April 9th, 2021

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1Department of Biology, San Diego State University, 2Viral Information Institute, San Diego State University, 3Big Rose Web Design, LLC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一个公民科学项目旨在招募圣地亚哥居民收集SARS-CoV-2的环境样本。使用用户友好的移动设备界面为提交数据创建了一个基于多语种的基于 Web 的平台。实验室信息管理系统通过实时结果跟踪，帮助收集了数千个地理上不同的样本。

Abstract

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为了控制2020年全球大流行期间严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）的社区传播，大多数国家实施了基于直接人体测试、面部覆盖和表面消毒的战略。假设传播的主要途径包括气溶胶和呼吸液滴，在胎儿中检测SARS-CoV-2的努力侧重于疑似高流行地点（例如医院病房、游轮和公共交通系统）。为了调查在城市环境中很少清洁和很少消毒的表面上存在SARS-CoV-2，350名市民从大圣地亚哥县入伍。这些公民科学家总共收集了4，080个样本。开发了一个在线平台，以监测抽样套件的交付和取件，以及收集样本数据。取样包大多来自大流行压力商店的用品。样品是使用试剂处理的，尽管经常出现供应短缺，但很容易获得。所使用的方法对环境样品中常见的抑制剂具有高度敏感性和抗药性。拟议的实验设计和处理方法成功地使许多公民科学家参与进来，他们有效地从不同的表面积采集样本。此处描述的工作流程和方法与调查城市环境中的其他病毒有关，这些病毒涉及公共卫生问题，并对未来的流行病构成威胁。

Introduction

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SARS-CoV-2主要通过吸入与受感染者直接接触的受污染气溶胶和液滴传播。然而，在全球COVID-19大流行的初始阶段，控制SARS-CoV-2传播的努力主要侧重于消毒表面、洗手和消毒。到2020年底，世界卫生组织（世卫组织）5和美国疾病控制和预防中心（CDC）6的传播指南认为，空气传播主要在与感染者密切接触（<2米）或存在产生气溶胶的医疗程序时存在危险。在与受污染表面接触或吸入气溶胶叶后自行接种，尚未排除作为SARS-CoV-2传播途径的可能性。

COVID-19病例已经报告，其中空中传输似乎不太可能7，8。SARS-CoV-2病毒在铜上保持感染力长达8小时，在纸板和不锈钢上保持24小时，在塑料上持续长达48小时9小时。在游轮客舱内，在乘客离开7天后17天发现SARS-CoV-2RNA。医院及公共交通系统的空气及表面样本，经测试呈非典型肺炎-CoV-2及其他冠状病毒8、10、11、12、13、14呈阳性反应。一项由无症状和中度/轻度症状COVID-19患者处理的万圣节糖果外包装的研究得出结论，处理者洗手和洗手糖与洗手皂相结合，将SARS-CoV-2 RNA降低到低于阈值水平15。

SARS-CoV-2诊断的几种方法已经发布基于实时反转转转聚合酶链反应（RT-qPCR）16，17，反转录环介介介式同热放大（RT-LAMP）11，18，19，20，21，和CRISPR-Cas技术18，19，22，23。大多数需要RNA提取工具包，在全球需求巨大的时期，这些试剂盒经常供不应求，而且很少用于病毒24的环境筛查。使用RT-LAMP检测SARS-CoV-2 RNA已证明与使用RT-qPCR的配合性超过83%。此外，RT-LAMP导致没有结果的结果比RT-qPCR15减少25%。

RT-LAMP 是一种简单的技术，使用反向转录酶从 RNA 模板25合成 cDNA，然后是具有强链位移活性的 DNA 聚合酶，在恒温下合成 DNA（即等热放大）26。通过使用四到六个引因来识别目标DNA的六到八个区域，可以实现病毒基因组检测的更高特异性。放大是从内部引金开始的，产生半双链DNA结构。然后，引线被外部引座放大。这些放大器重复为反向引物。两端的内部和外部引物都有一个内部反向自补充站点，在放大产品26、27中形成循环。在同热链位移中，异步DNA合成产生大量放大产品，其中连续聚合放大信号，每次反应11、20、28的信号只有10份。彩色RT-LAMP组合缓冲较弱，使用酚红色作为pH值指示器。由于聚合酶含有核苷酸，它释放质子，足够的质子将改变溶液的pH值，以及它的颜色从粉红色到黄色11，20，28，29。

RT-LAMP的研制用于检测缺乏设备齐全的实验室的 周边卫生保健设施中的蚊媒疾病，并用于快速检测其他RNA病毒，如人类免疫缺陷病毒30。根据世卫组织的定义，流行病疫情中最脆弱的人群往往缺乏足够的经济资源和适当的设备进行检测（《联合国全球公共卫生议程》）。在目前的SARS-CoV-2大流行中，用于RNA提取试剂的医用级拭子和试剂等用品未能满足全球需求，特别是在非制造业国家。拟议的协议使用了基于硫氰酸钛（GITC）的粗RNA提取，以冷链独立的方式有效地保留了RNA，并显著降低了样品中抑制剂的持久性。此外，GITC-氯仿提取协议基于RNA与DNA和蛋白质的分离，然后是各自的沉淀，从而能够恢复大部分遗传物质。如果采取措施适当告知公民科学家风险，这些优势就大于处理该化学品的公民科学家的潜在危险。

建议的工作流程使用一般使用的材料和试剂。它需要在基本的，通常是农村的实验室环境中可用的设备。这些方法价格低廉，对环境样品或样品中常见的抑制剂具有很强的抗药性，无法用提取剂盒进行处理，无需高精度的恒温器。这项研究提出了一条管道，用于从环境水库对家庭和城市环境的常见接触和很少消毒的表面进行SARS-CoV-2的取样和检测。

Protocol

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有关试剂和耗材的详细列表（包括目录编号、制造商和相应的成本），请参阅 材料表 。

1. 对城市环境进行采样

  1. 公民科学家外展
    1. 利用通过当地和社交媒体发布的直接和明确的行动呼吁招募公民科学家。创建社交媒体手柄（例如 ，#swab4corona），将主题跨社交媒体内容连接起来。
    2. 创建一个电子邮件帐户，供实验室团队和每个公民科学家之间直接沟通，由精通感兴趣地区主要语言（例如圣地亚哥县的西班牙语和英语）的人管理。
    3. 建立一个安全的基于 Web 的样品管理平台 （SMP），作为数据库、实验室信息管理系统 （LIMS）和与公民科学家进行沟通。
      注:SMP 提供一个集中位置，用户可在此请求套件、访问样本收集协议、提交样本元数据以及请求已完成的样本套件的拾取。
    4. 创建一个链接到 SMP（例如，https://demo.covidsample.org/）（图 1），供个人通过回答在线表格中指定的与生物安全相关的问题来申请参与环境采样工作。
    5. 使用云计算机服务提供商提供的身份验证应用程序编程接口安全访问 SMP。允许已批准的用户访问 SMP。
      注:有关 OAuth 2.0 协议31 的描述，请参阅文献以进行身份验证和授权。它为公民科学家志愿者提供了一个无摩擦的登录过程。它还允许用户使用现有帐户登录，无需创建自定义登录解决方案和管理用户凭据，从而节省了大量时间并鼓励参与。根据最近的报告，所选云计算机服务提供商的免费电子邮件服务每月约有15亿活跃的电子邮件用户:要求该服务提供商提供电子邮件帐户以供其参与，并不被视为令人沮丧的因素。
    6. 在SMP的公民科学家要求他们的第一个工具包之前，向他们解释研究的目标和生物安全考虑。提供多语种插件，使云计算机服务提供商提供的多语种神经机器翻译服务能够使用任何语言进行导航。
    7. 包括英语和西班牙语的采样部分图形和视听协议。
    8. 为每个工具包分配一个唯一标识符，并设计用户界面，以利用链接到示例 ID 的按钮来简化数据录入过程 （图 1A）。
    9. 使用带有移动设备应用程序的交付路线规划软件，供驾驶员使用，以优化交付/取件路线，并将准确的到达时间通知公民科学家。
    10. 在 PHP Web 服务堆栈上构建 LIMS 平台，并在商业托管平台上托管该平台（建议操作系统、Web 服务器软件和数据库软件在 材料表中指定）。
    11. 提供安全的基于 Web 的应用程序界面，使实验室人员能够快速轻松地在 LIMS 中管理数据。使用云计算机服务提供商提供的数据图表应用程序编程界面提供数据可视化。
    12. 使用云计算机服务提供商提供的地理空间应用程序编程界面可视化地理空间数据。存储通过 SMP 提交给 LIMS 的数据，以方便 （1） 项目数据的集中存储:（2） 跟踪样本/数据处理工作流程;（3）管理向公民科学家分发样品的后勤工作。
    13. 使用最佳实践（例如 ，https://demo.covidsample.org/）安全提交元数据。
    14. 预加载信息，如样品套件 ID、示例 ID、日期、时间和全球定位系统 （GPS） 坐标（自动从站点图片中收集），以实现数据类型合规性，并最大限度地减少用户提交错误或缺失的数据（图1B）。包括以下由公民科学家手动和快速填写的字段（<1分钟）:收集日期和时间、位置简要说明以及采样地点的图片。
    15. 对所有上传的数据进行消毒，并验证数据类型。例如，验证用户上传的图像数据以选择.jpg文件，用示例 ID 重命名它们以快速与示例关联，并将上传的图像存储在用户无法访问的单独安全位置。
    16. 激活选项，要求在完成所有样品 （16） 后交付和取件。此外，激活选项，请求在拾取上一个工具包时交付新工具包（图 1A）。
      注:对于喜欢非基于 Web 的平台的志愿者，以及担心披露其 GPS 位置（例如，关注其迁移状态的社区成员）的志愿者，可在商定的会议地点交付工具包，志愿者需要记录数据收集的书面版本。为了在实验室和每个公民科学家之间进行沟通，该项目有一个双语成员，可用于电话和短信。
  2. 科罗纳的斯瓦布
    1. 确定采样工作与流行病学相关的时间窗口。
    2. 构建包含所有取样用品的工具包，包括必要的个人防护设备（即口罩、手套）、采样协议和生物安全相关信息（图 2）。预标记每个管与分配的独特标识符（样本ID）。
    3. Swab 很少对暴露在家庭和城市环境中的气溶胶叶的表面进行消毒。
      1. 在公共场合佩戴提供的口罩和一副 新的 手套，用于收集 每个 样品，以避免交叉污染。完成取样后，使用所提供的洗手液。
      2. 用洗涤剂（如 0.5% 硫酸钠 （SDS） 湿 1 厘米2 聚酯吸收拭子（例如拖把垫），通过破坏病毒的信封来灭活病毒，并通过诱导 RNases32展开来稳定裸RNA。
      3. 拭子表面为10厘米2。在牙签的帮助下，将每个样品拭子完全浸入相应的预标记管中，其中含有 200μL 的硫氰酸钛溶液 （GITC）。将管子存放在 4 °C，直到它们被运送到实验室。样品到达实验室后，将其储存在-80°C。
        注:GITC是一种有毒刺激物:避免与皮肤接触。GITC解决方案是简单的准备从常见的实验室化学品，为食谱见33，34。它使病毒失活，通过去硝化RNA34、35、36来稳定RNA，并在室温下稳定样品。然而，该套件包括冰袋，以保持样品冷，而无需使用家用冰箱存储。

2. 非典-COV-2检测

  1. RNA隔离总数
    1. 用2mM硫酸铜和3%过氧化氢溶液对表面、设备和管道进行消毒:其次是10%漂白剂、90m碳酸氢钠、5%SDS和2.5%NaOH溶液。用蒸馏水彻底擦拭，然后用75%的乙醇擦拭。
      注意:这些解决方案是商用解决方案的替代方案。
    2. 在冰上解冻样品。漩涡样品以中等速度2分钟。
    3. 为了提高筛选速度，在池中处理样品。如果池为正，请独立提取每个样本的 RNA 以找到阳性样本/ s。将每个取样包中的样品（共 16 个样本）组合成 2 个 8 个样本池。
      注:每个池有 8 个样本意味着每个套件只需要处理 2 个池。如果池呈阳性，则对单个样本进行重新处理，以进行单独的 RT-LAMP 分析。这减少了时间、成本和试剂。
    4. 将 8 个样本中的 50μL 池放入微中微管（总容量 400 μL）;将剩余样品保存在-80°C。 加入 0.2 卷 （80μL） 的氯仿，漩涡为 15 秒，然后在 4 °C 下孵育 20 分钟。 离心机在 13，000 × g 20 分钟在 4 °C。
    5. 将水（透明液体）层转移到新的微中流管中。将剩余的接口和粉红色液体存放在 -80 °C 冰柜中;这些分数包含DNA和蛋白质33，36。
    6. 加入等量的异丙酚（+200μL）和2.6微升糖原同源剂（15毫克mL-1）37。混合好，并在-20°C孵育至少1小时，然后4°C 10分钟沉淀RNA。
      注意:协议可以在这里暂停，在-20°C的夜间孵化样品，而不是1小时。
    7. 离心机在 13，000 × g 20 分钟在 4 °C。 在不干扰颗粒的情况下取出超自然。将颗粒重新注入 50μL 的二乙基碳酸氢化合物 （DEPC） 处理水中，并加入同等体积 （50 μL） 的无 RNase 5 M 醋酸铵和 2.5 卷 （250 μl） 100% 乙醇7，38。
      注:如果在下游过程中使用，铵离子抑制多核苷酸激酶。混合沉淀RNA，同时留下脱氧核苷三磷酸和寡糖在解决方案38。
    8. 混合好，并在-20°C孵育至少1小时，然后4°C 10分钟沉淀RNA。
      注意:协议可以在这里暂停，在-20°C的夜间孵化样品，而不是1小时。
    9. 离心机在 13，000 × g 20 分钟在 4 °C。 用1mL的冷（-20°C）清洗颗粒，新鲜生产75%乙醇。离心机在 8，000 × g 5 分钟在 4 °C。 用 P10 移液器取出超自然，以避免干扰颗粒。
    10. 空气干燥颗粒10-15分钟，直到没有剩余乙醇。将颗粒重新注入 50 μL 的 DEPC 处理水中，加入 5 μL 的 10 倍 DNase 缓冲器 + 1μL DNase （2 单位 μL-1），并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
    11. 加入 0.1 卷（5.6μL）的 DNase 灭活试剂，在室温下孵育 5 分钟，每分钟轻轻混合。离心机在13，000× 克 2分钟，并将超自然体转移到一个新的管子（约50μL）。在准备 RT-qPCR 或 RT-LAMP 反应时，立即将管子放在冰上，或存放在 -20 °C 冰柜中。
      注意:在无放大音室进行RNA隔离，以避免结对污染。
  2. 多路复用反转录循环介介式等热放大（RT-LAMP）
    1. 为每组引座 （表 2） 准备 20X 底漆混合解决方案 （表 1）。在室温下准备RT-LAMP反应组合 （表3）， 超容量10%，以弥补管道损失。
      注:彩色LAME 2X主混合南极热拉贝尔尿素-DNA糖酶（UDG）防止从先前的反应20，28放大DNA污染。
    2. 漩涡和旋转下来的混合物。将20μL的混合物分配到每个反应管中: 样本、 尖刺、 正对照和 负控制。在室温下将反应在管中孵化 10 分钟，使 UDG 能够对潜在的结存污染采取行动。
    3. 在 样本 反应中加入 5μL 的 RNA，将 5 μL 的 RNA + 2.5 μL （450 份） 合成 SARS-CoV-2 RNA 添加到 峰值 反应中，将 2.5μL （450 份） 合成 SARS-CoV-2 RNA 添加到 阳性控制 反应中，将 5 μL 的 H2O 添加到 负控制 反应中。混合好，并旋转下来的反应:解冻冰上的所有RNA。
    4. 当热循环器或水浴被加热到 65 °C 时，允许所有反应保持在室温下。UDG 将在 50°C >失活。 将反应放在热循环器中（使用热盖），在65°C孵育40分钟，让反应达到室温（+22°C 5分钟），或在冰上冷却1分钟。使用色度特征（简单观察）或在蔗糖凝胶中运行产品来分析结果。
      注:虽然检测限制 （LOD） 是每个反应 10 份，但随着每个反应的拷贝数接近 500 份（图 3A），检测频率会增加。对于色度观测，请注意，阴性结果由粉红色表示（pH = 8.8），而正结果表示为黄色（pH = 5）（图 3B）。彩色选项可避免放大后打开 RT-LAMP 管，这将减少工作环境中 RT-LAMP 产品的体积和结转污染。对于凝胶电泳，在 0.5% 特里斯/博拉特/EDTA （TBE） 缓冲器中用 1X DNA 凝胶污渍准备 1.5% 的 agarose 凝胶。在每口井中装载25μL的反应+5μL的6倍装载染料。在 100 V 下运行凝胶 60 分钟。不需要分子标记，因为阳性样本显示梯形（图3C）。

Results

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公民科学家为检测SARS-CoV-2而采集的样本。在8个月（2020年3月中旬至11月第三周）期间，有482名公民获准参加该项目，其中350人（73%）请求套件。共交付了 362 个套件（即一些参与者要求多个套件），246 个套件（70%）返回（图4A，B）。这些试剂盒中包含的所有 4，080 个样本都经过处理。收集地点分布在该县的北沿海、中北部、中部和南部地区，以及东部地区的少数地区（图4A）。圣地亚哥人类健康服务局39日报告说，这些地区的人口密度是圣地亚哥县最高的，有记录的COVID-19病例最多。

公民要求取件大多数样品套件（即平均成功率:70.4%）。每天要求1-16个试剂盒，并将0-14个试剂盒送回实验室（图4B）。对公民科学家的一项调查显示，收集一个完整的工具包（16个样本）以1-3小时的速度分布，平均8天（图4A和表4）。绝大多数试剂盒是完整的（91.1%），这意味着它们在所有16个样品管内都含有一个拭子，相应的采样数据被上传到LIMS（图4A和表4）。

使用 GITC-氯仿提取和多路复用转录酶循环介质等热放大 （RT-LAMP） 检测 SARS-CoV-2。对于彩色RT-LAMP测定，两组引物11，20，28用于瞄准核胶囊（N2）和信封（E1）基因（表2）。这些引物所识别的序列与 CDC40和欧盟 （EU）41批准的用于 RT-qPCR 人类诊断 COVID-19 的引物和探针位于同一区域。这些结果证实了张等人28日所描述的，即在反应中加入60m的盐酸瓜尼丁，在多路复用中运行时会增加LOD。100% 的 LOD 频率为每 25μL 反应 500 份（图 3A，B）。在彩色RT-LAMP中，由于pH度从~8到5.5（图3B），阳性样品的颜色从粉红色变为黄色。当反应变成橙色在低拷贝的数字，样品运行在1.5%的糖凝胶，以确认这些是阳性的，并导致梯子状模式（图3C）。RT-LAMP 用于在汇集的 RNA 样本中检测 SARS-CoV-2。

为了控制反应抑制剂导致的假阴性，每个样本都进行了额外的反应测试，其中500份合成SARS-CoV-2。通过隔离池中每个样本的RNA并以RT-LAMP反应运行以确定阳性样本的身份，对阳性池样本进行了去渗透。然后将检测结果上传到 LIMS，其中唯一的样本 ID 与样本的日期、时间、GPS 坐标、站点和图像的信息配对。

实时和传统的RT-PCR方法:通过样品污染物抑制。 为了选择适合拟议检测管道的最佳方法，其他RNA放大方法通过一组公民科学家的试点人群收集的环境样本进行了测试。每种方法的结果示例均见 图 5， 以描述它们对低病毒拷贝数浓度的环境抑制剂和背景信号噪声的敏感性。

疾病预防控制中心和世卫组织批准的六种RT-qPCR制剂（材料表）在环境样本上检测出该病毒。根据制造商的指示，以及疾病预防控制中心在临床环境中发现SARS-CoV-2的指引，遵守了协议。含有不同浓度的合成SARS-CoV-2RNA控制的反应在粗RNA隔离后被刺入擦拭表面样本中。所有主混合物对正控制（图5A）的LOD浓度的抑制剂都很敏感。

为了绕过这些实时技术的抑制剂，测试了传统的RT-PCR系统。使用一步式RT-PCR系统（材料表）使用引物组N1、N2和信封基因分别使用疾病预防控制中心（美国）和ECDC（欧盟）批准的引物集E1（表2）来放大核胶囊基因。根据制造商的指示，以及疾病预防控制中心在临床环境中发现SARS-CoV-2的指引，遵守了协议。CDC 设计的引物设置N1和N2可产生约 70 bp 的产品;然而，低拷贝数阳性与负控（图5B）的放大背景噪声没有区别，后者在结果中引入了误报。E1引物的产品在低拷贝数（图5B）下信号较弱，在结果中引入假底片。此外，测试的RT-PCR方法对环境样本中的抑制剂仍然敏感（未显示数据）。

已经开发出其他方法来检测非常少量的目标序列。其中一种方法是滚动圆放大 （RCA），通过特定的线性探头识别目标序列、RNA 或 DNA，使连带气循环模板。使用设计用于与探头杂交的引物，具有链位移活性的DNA聚合酶在等热反应42中放大了探针。是探测器识别了目标，即放大的，而不是目标序列，使得这种方法高度敏感。王等人44 日公布了直接检测SARS-CoV-1RNA的RCA协议。该方法经过修改，使用SARS-CoV-2特有的引因。不幸的是，在非模板控制 （NTC） 中，探针在没有 RNA 模板的情况下循环和产生产品，即使使用各种韧带（包括 SNP 敏感的韧带）也是如此。在没有韧带的情况下，NTC没有显示线性探针 （图5C）的放大。

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图1:基于网络的取样平台，为移动设备提供样本收集数据界面。 （A）建立了一个包含多语种插件的网站，以调解实验室与公民科学家之间的互动。该平台用于样品套件交付/拾取请求和样品数据提交。该平台包含详细的英语/西班牙语图形和视听采样协议。（B） 用于上传样本数据的移动设备视图:日期、时间、GPS 坐标、样本站点描述和采集站点的图像。缩写:SARS-CoV-2 = 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2;全球定位系统=全球定位系统。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图2:样本收集套件。 公民科学家收到了一个装有两个冰袋的冷却器，一个安全数据表，告知志愿者处理GITC解决方案的危害，详细的采样和戴口罩协议，KN95口罩，一个垃圾袋， 带洗手液的喷雾瓶、含有 0.5% SDS 的喷雾瓶、16 副手套、带 16 个牙签和 16 个聚酯拭子的小袋子、16 个预标记的微中燃料管，包含 200 μL GITC 溶液的喷雾瓶、包含采样管的盒子以及用于发生泄漏时管盒的辅助容器的袋子。缩写: GITC = 紫青酸盐:SDS=硫酸钠。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 3: 多路复用循环介质等热放大 （RT-LAMP） 测定。 使用SARS-CoV-2核胶囊（N2）和信封（E1）基因的引物进行多重反应，以检测反应中病毒的多达10个拷贝。合成SARS-CoV-2RNA被用作正控制。（A） SARS-CoV-2多色RT-LAMP中每个反应的多重色度RT-LAMP检测频率，每个反应的基因组拷贝数不同。粉红色复制的五个复制品的平均值。（B） 多色RT-LAMP中SARS-CoV-2的检测限值（LOD）:黄色=正数（pH~5）:粉红色=阴性（pH~8）。（C） 1.5% 的凝胶电泳中SARS-CoV-2 RT-LAMP反应阳性的梯子模式。缩写:SARS-CoV-2 = 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2;rxn=反应。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图4:圣地亚哥县公民科学家取样包的位置和所要求的试剂盒的成功率。 （A） 橙色点代表1个取样包的位置，其中包含16个样本。蓝色饼图显示了从交付给公民科学家到返回实验室所需的不同天数的试剂盒的百分比。括号中的天数。橙色饼图显示了总共 16 个样本中完成样本数量不同的套件的百分比。样品管内含有拭子的已完成样品数量，以及上传到括号中 LIMS 的相应采样数据。（B） 返回实验室的套件百分比（点）和请求的套件（条）总数，相对于请求套件的日期。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图5:替代SARS-CoV-2的抗病毒方法。（A） RT-qPCR使用引物集N2检测SARS-CoV-2核胶囊（N）基因。汇集的环境样本中，有900份（绿色）或9份（橙色）SARS-CoV-2。蓝色相同副本编号的正控件。箭头表示存在环境样本时低拷贝数阳性控制荧光检测的减少。（B） 传统的RT-PCR检测SARS-CoV-2。顶部:使用引物集N1和N2的核胶囊基因的RT-PCR产品。在无模板控制中观察到微弱的背景信号。底部:使用引物集E1的信封基因的RT-PCR产品。在LOD浓度下观察到非常低的信号。蓝箭显示预期正产品:（ 顶部） ~70 bp 和 （底部） 113 bp 在 2% agarose 凝胶电泳。（C） 非典-科夫-2RNA的 RCA.圆形探针在存在韧带和没有RNA模板的情况下放大（NTCcir）:在没有韧带和RNA模板线性探头的情况下，不会放大（NTCLin）。缩写:SARS-CoV-2 = 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2;RFU = 相对荧光单位;bp=碱基对:rxn=反应:MM = 分子标记:RT-PCR = 反转录聚合酶链反应;RT-qPCR=实时定量RT-PCR;RCA=滚动圆放大:NTC= 无模板控制;LOD=检测限制:rxn=反应。请单击此处查看此图的较大版本。

底漆20倍浓度（微米）1倍浓度（微米）
图片321.6
比普321.6
F340.2
B340.2
循环80.4
循环B80.4

表1:20X RT-LAMP底漆组合的配方。 在RT-LAMP反应中，6个引金识别目标DNA的8个区域。缩写: 反转录循环介介等热放大:FIP=向前内引器:BIP=落后的内引器:F3=前置置换引物:B3=向后位移引数:循环F=前循环引数:循环B=向后循环引号。

底漆序列目标产品尺寸
RT-兰普9，18，19
E1-F3特加格特加特塔克特卡特戊梯形图案
E1-B3特卡加塔塔卡加格特
E1-FIP阿卡加
E1-比普特克塔格塔克塔克卡塔卡塔克塔卡卡奇特
E1 循环GCGCCT贸易技术
E1 循环克格塔塔克
N2-F3阿卡加法塔卡格N
N2-B3加特
N2-FIP特克卡加加克特加加特卡卡特
N2-双克加特加特加特卡卡特加特克特格特格塔
N2-循环格卡特格特加特
N2-循环反恐委员会
RT-qPCR38
2019-nCoV_N1-F加卡卡特卡加特N72 个基点
2019-nCoV_N1-R泰克特克特加加特克
2019-nCoV_N1-P5 '- 家庭 - acc Ccg 猫塔克 · 特格 · 特格 · 阿克 - Bhq1 - 3'
2019-nCoV_N2-F塔卡卡塔奇卡N67 个基点
2019-nCoV_N2-RGC加卡特加加
2019-nCoV_N2-P5 '- 家庭 - 阿卡 ATT Tgc C C CG CGC TTC AG-BHQ1-3'
RT-PCR39
E1_Sarbeco_F阿卡格塔克塔塔格特戊113个基点
E1_Sarbeco_R阿塔特加塔卡卡

表2:用于RT-LAMP、RT-qPCR和RT-PCR的引言。列出引物序列、目标基因、预期产品大小和相应的参考。缩写:RT-LAMP = 反转录循环介释等热放大;RT-PCR = 反转录聚合酶链反应;bp=碱基对:RT-qPCR=实时定量RT-PCR; E1 =信封基因; N2 =核胶囊基因;F=前引物:R=反向引引器:P = 探针:FIP=向前内引器:BIP=落后的内引器:F3=前置置换引物:B3=向后位移引数:循环F=前循环引数:循环B=向后循环引号。

试剂音量 （μL）
暖启动彩色灯 2X 主混合与 UDG12.5
N2 引号混合 （20 倍）1.25
E1 引号混合 （20 倍）1.25
盐酸瓜尼丁（600米）*2.5
目标RNA5
无核糖 H2O2.5
总成交量25

表3:多重色度RT-LAMP的反应主组合。 (*)盐酸瓜尼丁已被证明通过一种非特性的机制28来增加反应的灵敏度和速度。缩写:LAMP = 循环介介式等热放大:UDG=尿素-DNA糖酶; N2 =核胶囊基因; E1 =信封基因;DEPC=二乙基碳酸酯。

批准公民要求套件的公民已交付套件返回的取样套件专门进行采样的日子% 完整套件% 不完整的套件处理样品
48272.6% (350/482)36270.4% (255/362)意味 着891.1 (224/246)8.9 (22/246)4,080
中位数3

表4:按数字为SARS-CoV-2进行擦拭。 外展和抽样成功率。缩写:SARS-CoV-2 = 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

公民科学家参与。招募了公民科学家到圣地亚哥县各地的拭子表面，以采样和检测城市环境中是否存在SARS-CoV-2。大多数交付的取样套件 （70%）被送回实验室，其中，几乎所有的样品都完成（91%）（图3A、B和表4）。志愿者可以通过基于 Web 的平台轻松请求套件递送/取件，并且交付路线规划软件将估计到达时间通知了公民科学家，这两个因素都可能是观测到的成功的重要因素。从将试剂盒交付给公民科学家到返回实验室的平均时间为8天，中位数为3天，范围为1-64天（图3A和表4）。更频繁地提醒志愿者可能会减少这种滞后时间。

数据收集平台被绝大多数用户成功使用（73%）（表4） 。虽然没有测量公民科学家的努力，但实地测试表明，数据收集平台大大减少了正确完成样本收集所需的努力和时间。因此，减少簿记量鼓励公民科学家参与。该基于 Web 的平台旨在通过提供多语种神经机器翻译服务以及提供英语和西班牙语的图形和视听协议来克服人口限制。这只是部分成功，因为从南湾和北县收集的样本较少，该县大部分西班牙裔/拉丁裔人口居住在45个。这些地区还窝藏了63%（每10万例1700例）的COVID-19病例总数在圣地亚哥县与疾病的最高流行率46和住院率（62%）47，48。虽然大部分样本来自中央县，但从受COVID-19影响最大的地区收集了一个有代表性的数字，只有一小部分样本呈阳性，这表明城市环境中SARS-CoV-2的表面水库相对较少。

样本处理。取样拭子被SDS弄湿，SDS通过破坏病毒的信封来灭活病毒，并通过展开RNAS32稳定裸RNA。在收集过程中，棉签中的洗涤剂可以方便地清洁取样表面。环境样本通常含有非常少量的RNA。为了最大限度地恢复，使用基于 GITC 的无柱粗提取方法进行 RNA 隔离。GITC，一种强效的超热带剂，会破坏维持蛋白质折叠的氢键（即疏水效应）。此操作导致病毒颗粒失活，由于RNA酶34、35、36的抑制，RNA保持稳定。GITC 解决方案在没有严格冷链考虑的情况下保持了 RNA 样品的稳定性，如果无法提供冰袋的冰柜，公民可以在室温下维护样品。为了减少这种试剂在发生直接皮肤或粘膜接触时可能构成的危险，公民通过在工具包中加入材料安全数据表并放置在包含管子的盒子中而意识到这些风险。

粗 GITC-氯仿提取方法有助于从拭子中恢复RNA的痕迹，如尖峰样品的放大所示，萃取后样品中很少存在抑制剂。样本对SARS-CoV-2呈阴性，没有RT-LAMP抑制作用，表示为真正的阴性，或复制数低于LOD，频率为100%。相反，在表面检测病毒RNA并不直接意味着通过接触传播的风险，因为需要测试阳性样本中的病毒感染率。迅速检查环境，不限于提供精密的供应品或高素质的人员，对于评估表面是否构成病毒库以及更好地指导预防和遏制工作至关重要。

RT-LAMP 被选为适合拟议检测管道的最佳方法。它被证明是一种快速和廉价的方法，对大多数剩余的抑制剂具有很强的抗药性，与其他RT-qPCR方法一样敏感和具体。由于在SARS-CoV-2大流行期间在临床环境中使用，RT-qPCR套件的供应受到全球需求的影响。此外，RT-qPCR技术——即使是那些用来抵抗抑制剂的技术——对一组公民科学家收集的环境样本中所含物质非常敏感，即使在使用其他常见策略来减少抑制剂对酶结合49的竞争之后也是如此。最近的一项研究证实了这些发现，该研究将两种检测SARS-CoV-2的方法对比，从COVID-19患者处理的糖果中采集拭子样本，结果均超过83%，在RT-LAMP 15分析的样本中，抑制率降低了25%。此外，与RNA套件提取和RT-qPCR（ 材料表）相比，GITC-氯仿原油提取，加上RT-LAMP，将试剂和耗材成本降低了42%。

这种方法允许对数千个表面拭子样本进行高吞吐量分析。从RNA提取到RT-LAMP检测SARS-CoV-2，在两天内处理了多达80个池，代表640个样本。拟议的协议是半量的，仅限于检测病毒RNA，并不表示存在传染性病毒颗粒。需要进一步分析，以评估从目前在擦拭表面的受感染的胎儿传播SARS-CoV-2的风险。

这项研究提出了一个协议，以迅速建立一个测试策略，其中包括一个有效的工作流程时，面对卫生紧急情况与传染病。提议的取样方案很简单，使用家庭中常见的用品，病毒检测方法是在基本实验室环境中可用的设备上进行的，例如水浴代替恒温器。RT-LAMP 试剂的成本明显低于 RT-qPCR 所需的成本，且不易受全球高需求情景的影响。这项研究是评估未来流行病爆发和全球大流行病的环境病毒库的框架。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有作者都宣称不存在相互竞争的利益。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢病毒信息研究所（VII）的调查人员安卡·塞格尔博士、柳·塞格尔博士、帕特里夏·罗威尔、加里·罗威尔、卡里·罗威尔、玛格达·西尔维娅·皮内塔、伊丽莎白·克鲁兹·卡诺博士、格雷戈里·彼得斯博士、斯图亚特·桑丁博士和詹妮弗·史密斯博士抽空收集了大量样本。我们还感谢加州圣地亚哥医学院儿科系的罗布·奈特博士、杰克·吉尔伯特博士、佩德罗·巴尔达-费雷博士和萨拉·阿拉德博士为积极的控制和有用的反馈提供便利。我们感谢史黛西·卡罗塔（SDSU科学学院）和吉娜·斯皮德尔（SDSU）的后勤支持，感谢胡安·罗德里格斯为采样协议的艺术和平面设计。我们感谢所有与会者在非常困难的时候对这个项目的承诺和奉献。这项工作得到了乔安·莱恩博士（SDSU科学学院）和国家科学基金会RAPID:SARS-CoV-2资助的环境水库（奖励号码:2030479）的慷慨捐赠的支持。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
SMP、LIMS 和社区外展：
Authentication 应用程序编程接口GoogleGoogle 登录
商业托管平台GoDaddy
数据图表应用程序编程接口GoogleGoogle 图表
数据库软件MySQL 
配送路线规划软件 CircuitCircuit for Teams
免费电子邮件服务GoogleGoogle Email
地理空间应用程序编程接口GoogleGoogle Maps API
多语言神经机器翻译服务GoogleGoogle Translate
在线表单GoogleGoogle Form
作系统Linux
Web 和数据库开发 Big Rose 网页设计
Web 服务器软件Apache 
采样套件：
CoolersColeman（亚马逊）B00363X3F2每 100 次反应的成本（美元）：70
加仑密封袋Solimo（亚马逊）B07BJ495GL每 100 次反应的成本（美元）：18
甘油（洗手液）FischerScientificG33-4每 100 次反应的成本（美元）：9
冰袋Ice-Brix（亚马逊）B075GLD3X1每 100 次反应的成本（美元）：110
异丙醇（洗手液）FischerScientificAA36644K7每100 次反应的成本（美元）：43
个 KN95 口罩Echo-Sigma每 100 次反应的成本（美元）：400
个协议纸和 Trizol 安全表Office Depot348037每 100 次反应的成本（美元）：36
30 mL 喷雾瓶（SDS 和洗手液）Anyumocz （Amazon）B07T64FHXR每 100 次反应的成本（美元）：80
个 RNase、DNase、DNA 和不含 PCR 抑制剂的微量离心管Genesee Scientific22-281每 100 次反应的成本（美元）：83
个样品 ID 耐溶剂标签LABTAGXST-10C1-1WH每 100 次反应的成本（美元）：68
个 Swiffer WetJet 垫（拭子）Swiffer（亚马逊）B001F0RBT2每 100 次反应的成本（美元）：8
牙签Kitchen Essential （Amazon）B00PBK4NG6每 100 次反应的成本（美元）：8
Trizol 试剂（异硫氰酸胍溶液 - GITC），不是 LSInvitrogen15596018每 100 次反应的成本（美元）：40
个试管盒Genesee Scientific21-119每 100 次反应的成本（美元）：180
个小拉链袋Ziploc（亚马逊）B01LRKEI9K每 100 次反应的成本（美元）：8
台斑马热转印桌面打印机 ZebraGK420t
总采样试剂盒 每 100 次反应的成本（美元）：1,160
Trizol RNA 提取：
乙酸铵 RNase 的InvitrogenAM9070G每100 次反应的成本（美元）：2
氯仿FisherScientificC298-500每 100 次反应的成本（美元）：2
个糖蓝（糖原 15 mg/mL）InvitrogenAM9515每 100 次反应的成本（美元）：80
分子级绝对（200 度）乙醇FisherScientific每100 次反应的BP2818500成本（美元）：30
分子级异丙醇FisherScientific每 100 次反应的BP2618500成本（美元）：3
TURBO 无 DNA 试剂盒 InvitrogenAM1907每 100 次反应的成本（美元）：110
多路比色 RT-LAMP：
盐酸胍AAJ6548522每100 次反应的成本（美元）：1
个 RT-LAMP E1 引物IDTn/a每 100 次反应的成本（美元）：7
个 RT-LAMP N2 引物IDTn/a每 100 次反应的成本（美元）：7
合成 SARS-CoV-2 RNAATCCVR-3276SD每 100 次反应的成本（美元）：14
次 WarmStart 比色 LAMP 2X 预混液，含 UDGNEBM1800S每 100 次反应的成本（美元）：210
Eppendorf Mastercycler Pro 热循环仪Eppendorf950030010
Trizol RNA 总提取 + LAMP 每 100 次反应的成本（美元）：470
用于 RNA 提取的 试剂盒：
QIAamp DSP 病毒 RNA 小量试剂盒Qiagen61904每 100 次反应的成本（美元）：570
RT-qPCR：
合成 SARS-CoV-2 RNAATCCVR-3276SD每 100 次反应的成本（美元）：14
个 TaqMan Fast 病毒 1 步法预混液Applied Biosystems每100 次反应的 4444432 成本（美元）：180
个 SARS-CoV-2 （2019-nCoV） N1，N2 引物和探针IDT10006713每100 次反应的成本（美元）：20
个 qScript XLT 一步法 RT-qPCR ToughMixQuantabio95132-100
QuantiNova 病原体 Qiagen208652
QuantiNova 探针Qiagen208352
UltraPlex 1 步法 ToughMix Quantabio95166-100
CFX96 触摸实时 PCR 检测系统BioRad1855196
试剂盒用于 RNA 提取 + RT-qPCR 每 100 次反应的成本（美元）：790 
RT-PCR：
SuperScript IV 一步法 RT-PCR Invitrogen12594025
实验室净化：
DNAZapInvitrogenAM9890
RNAZapInvitrogenAM9780
个 根不含 个 个

References

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