一种用于填充高分辨率C18反相纳米高效液相色谱柱的稳健方法

摘要

本文介绍并评估了一种用于肽段表征的低成本反相纳米流液相色谱柱的制备方案，该方案适用于LC-MS/MS蛋白质组学工作流程。

摘要

生物样品普遍具有高度复杂性，需要采用高灵敏度和高分辨率的色谱分离方法才能有效分析。本文介绍一种稳定、可重复且低成本的制备纳米流速反相高效液相色谱（RP-HPLC）柱的方案，用于在传统的自下而上蛋白质组学工作流程中，对分析肽段进行在线分离，随后引入质谱仪进行检测。根据实验目的及被分离分析物的化学性质，最佳色谱柱参数可能在内径、外径、长度、填料粒径、孔径、固定相颗粒的化学性质以及柱尖端是否集成电喷雾发射器等方面有所不同。自主搭建的色谱柱填装系统不仅能够快速制备具有理想特性的色谱柱，还显著降低了制备成本。本文讨论的C18 AQ（亲水型）熔融石英色谱柱填装优化方案，适用于多种液相色谱仪器，可实现对分析物的有效分离。

引言

高效液相色谱柱在制药、医学和环境研究领域的生产效率提升中发挥了巨大作用^1,2,3,4。获得高质量的色谱柱是实现复杂分析物分离的关键步骤。在鸟枪法蛋白质组学中，通常通过将电喷雾电离（ESI）质谱（MS）与纳流速色谱联用来实现高分析灵敏度^5,6,7,8。在此应用中，对数千种肽段进行高效分离至关重要，因为这能使质谱仪以高灵敏度和高分辨率对分析物进行鉴定和定量。

近年来，随着对固定相形貌、溶剂-颗粒相互作用及硬件设计等基本装柱原理的深入理解，用于质谱分析的色谱柱装填领域取得了巨大进展，使得在复杂的生物环境中对多种生物分子进行详细表征成为可能^{9,10,11,12,13,14}。针对液相色谱-质谱（LC-MS）分析目的的分析柱装填实践要点所开展的研究，为蛋白质组学实验室开发内部装柱系统以满足其特定需求并实现最佳性能提供了可行路径^15,16,17,18。

内径在50-150 μm范围内且末端拉细的纳米喷雾色谱柱非常适合用于电喷雾电离。在鸟枪法蛋白质组学领域，通常采用溶剂梯度流经填充的非极性固定相进行分离，最常见的是键合有疏水性碳链的二氧化硅材料（C8-C30），其颗粒尺寸介于1.7至3.5 μm之间^19,20,21,22。洗脱出的分析物通过集成在色谱柱内的电喷雾电离（ESI）发射器喷出，从而实现溶液相分析物向气相离子的温和电离。将液相色谱柱与电喷雾电离质谱（ESI-MS）联用，显著推动了串联质谱技术在生物医学科学蛋白质组学策略中的应用。

内径较窄的液相色谱柱相较于内径较大的微流速色谱柱可产生更窄的色谱峰并具有更高的灵敏度，因此在蛋白质组学工作流程中具有显著优势。尽管市面上可购得的预装色谱柱因其使用方便、操作简便而颇具吸引力，但其价格可能极为昂贵，且灵活性不如实验室自制色谱柱。本研究旨在介绍一种技术上简单且低成本的浆液填充方法，利用熔融石英毛细管和实验室自制的压力罐系统，制备适用于蛋白质组学应用的窄内径反相高效液相色谱柱。

方案

1. 毛细管尖端的制备

1. 使用陶瓷切割石，截取约 60–70 cm 长、内径（ID）为 75 µm、外径（OD）为 360 µm 的聚酰亚胺涂层熔融石英毛细管。
2. 用手握住毛细管中段，使手指间留出约 4–5 cm 的间隙，将间隙处置于酒精灯火焰上加热，同时旋转毛细管。用浸有甲醇的低絮纤维纸巾擦拭灼烧区域，直至露出透明玻璃。（图 1）。
   注意：在将聚酰亚胺涂层熔融石英毛细管装入激光拉制仪之前，需暴露并抛光约 4–5 cm 的长度。
3. 为制备适用于电喷雾电离（ESI）的锥形发射极，使用激光拉制仪，并设置特定程序参数：加热值为 300（相当于激光功率 2 瓦），拉伸速度为 10（相当于 0.25 mm/s），延迟时间为 180 毫秒，以获得直径约为 1–5 µm 的尖端（图 2 和 图 3A）。将毛细管的抛光部分装入激光拉制仪，按下“拉制”按钮，得到两根可填充的空毛细管柱。
   ​注意：在任何步骤中，均需频繁使用显微镜检查尖端。不同激光拉制仪的参数设置可能存在差异，需通过实验确定最佳条件。

2. 尖端的聚合/刻蚀

1. 为了在毛细管中保留固定相颗粒，使用两种硅酸钾溶液与甲酰胺的混合物制备多孔烧结物。在使用前立即于2 mL离心管中配制该溶液，并用涡旋振荡器混合。
   1. 将SiO₂/K₂O质量比为2.50（w/w）和1.65（w/w）的两种硅酸钾溶液与甲酰胺按体积比1:3:1（v/v/v）混合。例如，取100 µL SiO₂/K₂O质量比为2.50（w/w）的硅酸钾溶液、300 µL SiO₂/K₂O质量比为1.65（w/w）的硅酸钾溶液以及100 µL甲酰胺，混合后涡旋振荡。该溶液在加热时会发生聚合，形成多孔烧结物。
2. 将激光拉制的毛细管尖端浸入烧结悬浮液的澄清母液中（非沉淀部分），持续约10–20秒，使液体通过毛细作用渗入尖端约5 mm深处。根据尖端的直径不同，可能需要更长的浸入时间。通常情况下，尖端越宽，浸入时间越短，因为溶液能更快进入尖端。
3. 将设定温度为350 °F的热烙铁沿毛细管尖端移动，以启动烧结溶液的聚合反应，同时在显微镜下观察毛细管。请参见图3，查看拉制后尖端在聚合前（图3A）和聚合后（图3B）的状态。
4. 为防止烧结物聚合后喷雾发射器发生堵塞，将色谱柱尖端浸入50%氢氟酸（HF）溶液中5分钟（装置示意图见图4）。氢氟酸刻蚀还能使色谱柱尖端形成平坦的锥形结构，从而延长其使用寿命。氢氟酸刻蚀后，务必彻底清洗色谱柱尖端，先用氢氟酸中和剂清洗，再用大量水冲洗，以避免接触酸液。
   警告：氢氟酸是一种高度危险且具有强腐蚀性的化学品。操作时必须格外小心，防止暴露。确保始终在通风橱内操作氢氟酸，并佩戴适当的防护装备，通风橱应设有标明"危险！ 急性 毒素"的警示标志。
   1. 为确保安全，操作氢氟酸时应同时穿戴普通实验服和防燃实验服，并佩戴双层腈类和氯丁橡胶手套。
      ​注意：对毛细管尖端制备烧结物为可选步骤；但该步骤可显著提高色谱柱抗堵塞能力并延长其使用寿命。带有集成电喷雾发射器的空熔融石英毛细管色谱柱可商业购得，必要时可用于替代步骤1和2。

3. 固定相的制备

1. 取25-50 mg粒径为1.9 µm、孔径为120 Å的全多孔ReproSil-Pur 120 C18-AQ硅胶颗粒，悬浮于300 µL甲醇中。上下吹打约20次，确保浆液颗粒在甲醇中形成均匀混合物。
2. 将含有浆液悬浮液的离心管放入自制柱填装加压装置的压力腔内，该装置置于磁力搅拌器上方，以便使浆液颗粒保持悬浮状态。将加压装置连接至氦气罐（<1500 psi），并以恒定压力运行，以避免在填柱过程中破坏高效液相色谱（HPLC）浆液。（示意图见图5）。
3. 按照图6A所示，通过拧紧螺栓将压力腔盖固定到位。
   ​注意：需明确区分高效液相色谱泵与高效液相色谱填柱加压装置的操作差异。前者设计为在色谱柱固定相产生反压的情况下仍能维持恒定流速，而后者则在恒定压力下运行，以确保毛细管柱全长范围内固定相颗粒填充连续且致密。

4. 用固定相填装色谱柱

1. 将色谱柱的底部（无烧结开口端）先穿过压力罐顶部的手拧接头，使色谱柱尖端朝上。推动色谱柱穿过接头，直至其接触含有浆料的小瓶底部，然后将其回撤至高于底部1-2 mm的位置。拧紧手拧接头以固定色谱柱的位置。
2. 将装柱压力罐连接至氦气瓶（推荐压力< 1500 psi），并开启至约1300 psi的压力。氦气通过三通阀进入容纳浆料小瓶的压力腔。通过顺时针缓慢旋转180°打开阀门。
   注意：一旦氦气开始在腔内流动，便会将浆料从小管推入毛细管中。当浆料流经色谱柱时，颗粒被保留在毛细管内，而溶剂则在色谱柱尖端形成液滴（图6B）。
   1. 如果色谱柱尖端液滴形成延迟，可快速用火焰灼烧尖端以确保其通畅。在此阶段，可在色谱柱后方放置光源以帮助观察装柱过程的进展（图7）。对于内径为75 µm的色谱柱，通常需要约30-60分钟完成约30 cm长度的装填。
   2. 如果浆料在色谱柱中的流动停止或减慢，请用手紧紧压住毛细管，使其位于装柱压力罐的手拧接头上方，并略微松开约四分之一圈（可能听到泄压的嘶嘶声）。
      ​注意：此操作可在无需完全释放压力的情况下重新调整色谱柱位置。
   3. 然后轻轻上下移动色谱柱进行重新定位，再重新拧紧手拧接头，确保色谱柱不再接触小瓶底部。这可确保浆料在整个过程中始终以均匀流速通过毛细管。
   4. 如果上述措施仍无法恢复装柱，请关闭阀门，释放压力罐中的压力，旋开盖子并检查浆料，确保其中无沉淀物。也有可能是色谱柱末端被固定相颗粒堵塞，此时从毛细管后端切去一小段可能有助于恢复流动。
3. 在色谱柱末端多装填几厘米，以确保固定相颗粒完全填充，并尽量减少氦气泡进入已装填色谱柱的可能性。

5. 完成色谱柱并制备柱尾烧结片

1. 当达到所需的填充长度后，关闭氦气罐的主阀门，并等待至少15分钟，以确保色谱柱填充均匀，并使系统自行卸压。
   注意：为了避免因色谱柱末端空的熔融石英部分引入氦气泡，建议采用更长的填充长度。即使肉眼可见的色谱柱部分已完成填充，仍必须继续填充过程，以补偿压力腔内毛细管的实际长度。此外，在需要反复调整色谱柱位置的情况下，建议使用更长的填充长度，这有助于减少气泡产生并提高填充效率。
2. 通过将阀门逆时针旋转180度至其原始位置，缓慢释放压力腔内的压力。用手紧握色谱柱，拧开手指拧紧接头，并逐渐取出色谱柱。此步骤必须轻柔操作，以避免引入气泡。
3. 将色谱柱末端切割至25.5 cm长度。在显微镜下观察的同时，使用350 °F的热烙铁从色谱柱后端去除0.5 cm的浆体。
   1. 将色谱柱后端浸入步骤2.1中剩余的筛板溶液中约10秒，然后在显微镜下观察的同时，沿色谱柱后部放置热烙铁使其聚合固化。后端筛板可确保ReproSil-Pur 120 C18-AQ颗粒保留在色谱柱内，并防止色谱洗涤过程中发生回流。
      注意：色谱柱后端的筛板为可选步骤，但与步骤2中所述前端筛板类似，可增强色谱柱的机械强度。

结果

为评估色谱柱的性能，将从HEK293细胞全细胞裂解液中制备的750 ng胰蛋白酶肽段消化产物进行在线分离。分离采用一根25 cm长、内径75 µm的熔融石英毛细管柱，柱内自行填装散装ReproSil-Pur 120 C18-AQ颗粒，填料方法如实验方案所述。在上样前，使用6 µL乙腈、异丙醇与H₂O按6:2:2比例混合的溶液清洗色谱柱，并用缓冲液A（缓冲液A：含3% DMSO的水溶液）进行预平衡。胰蛋白酶肽段消化产物采用70分钟的反相梯度进行分析。溶剂梯度起始阶段，在400 nL/min流速下，缓冲液B（缓冲液B：含3% DMSO和0.1%甲酸的乙腈溶液）从0%升至6%，持续4分钟。随后将流速降低至200 nL/min，在接下来的58分钟内施加6%至25%缓冲液B的线性梯度。之后在8分钟内将缓冲液B进一步升至25%至32%，再迅速升至85%以清洗色谱柱。在色谱分离剩余的4分钟内，梯度组分恢复至1%缓冲液B。

采用2.2 kV的远端喷雾电压使肽段离子化，离子传输毛细管温度为275 °C，并在轨道阱质谱仪上通过串联质谱法（MS/MS）进行分析。

讨论

现代蛋白质组学策略依赖于高质量的色谱分离，以有效分析复杂的生物系统。因此，高性能且成本效益高的纳流液相色谱柱是成功实现串联质谱分析的关键组成部分，旨在单一流程中表征数千种蛋白质。

在本研究中，我们评估了采用上述方案制备的一系列用于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的液相色谱柱的性能与可靠性。通过对过去两年内制备的色谱柱进行测试，将其用于HEK293细胞胰蛋白酶消化产物的在线分级分离，随后进行串联质谱分析。如图8和图9所示，对色谱柱参数（如色谱洗脱谱图的一致性、鉴定出的肽段和蛋白质数量）进行比较，结果显示不同色谱柱之间的差异小于10%，具有良好的可重复性。这些结果表明，采用上述方案在不同时间点制备的色谱柱表现出稳定的性能以及可靠的连续运行重复性。

综上所述，本文所述方案可制备出高质量色谱柱，且柱间变异小，适用于蛋白质组学应用。由于所需原材料易得且成本低廉，这种自制色谱柱填装方法可迅速在许多液相色谱-质谱（L...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
99.99% 甲酰胺酸	Sigma-Aldrich		用于制作烧结头
酒精灯	任意品牌		用于提供热量
Brechbuehler 氦气加压装置	BioSurplus		用于填充色谱柱
陶瓷色谱柱切割器	任意品牌		用于切割硅胶毛细管
二甲基亚砜 (DMSO) ≥ 99%	Sigma-Aldrich		储存于易燃品柜中
甲酰胺  ≥99.5%	Sigma-Aldrich		用于制作烧结头
氢氟酸 (HF) (50%)	Fisher Scientific		用于聚合后打开喷雾头
KASIL（硅酸钾溶液）	PQ Corporation		用于制作烧结头
Orbitrap Fusion Lumos	Thermo Fisher Scientific		用于质谱数据采集
P2000 激光拉制仪	Sutter		用于拉制毛细管
PTFE 1/16" 卡套，内径 0.4 mm（长型），用于管路接头	Chromre	214104	用于高压反应装置设置
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 μm, 1g	Dr. Masch GmbH	r119.aq.0001	批次 5910
焊锡	任意品牌		用于启动聚合反应
不锈钢管路接头，六角耦合器，1/4 英寸内螺纹 NPT	Swagelok	SS-4-HCG	用于高压反应装置设置
TSP075375 熔融石英，内径 75 µm × 外径 360 µm	MOLEX/Polymicro	1068150019	用作色谱柱管材
Ultimate 3000 UHPLC	Dionex		超高效液相色谱类型