利用人源间质促进转移的卵巢癌小鼠原位模型

摘要

将卵巢癌细胞与人类间质细胞混合后进行原位移植，可建立一种表现出快速、弥漫性转移行为的小鼠模型，该特征与人类卵巢癌相似。该模型还可用于研究肿瘤细胞与间质细胞之间的相互作用，以及它们在肿瘤进展和转移中的作用。

摘要

卵巢癌的特点是早期即发生弥漫性转移，70%的女性在确诊时已存在转移性疾病。尽管已有精巧的卵巢癌转基因小鼠模型，但这些小鼠成本高昂且成瘤时间长。腹腔注射异种移植模型缺乏人类间质成分，无法准确模拟卵巢癌的转移过程。即使是患者来源的异种移植模型（PDX），也无法完全重现人类间质微环境，因为连续传代的PDX模型显示出显著的人源间质丢失。因此，能够在生理相关间质微环境中便捷地模拟人类卵巢癌，仍是尚未满足的需求。本方案介绍了一种正位卵巢癌小鼠模型，该模型联合使用人类卵巢癌细胞与患者来源的癌相关间充质干细胞（CA-MSCs）。CA-MSCs 是间质前体细胞，可驱动间质微环境的形成，并支持卵巢癌的生长与转移。 该模型可重现临床上的早期弥漫性转移特征。在此模型中，将表达荧光素酶的卵巢癌细胞与 CA-MSCs 按 1:1 比例混合后，注射至 NSG 小鼠的卵巢囊中。通过活体生物发光成像对肿瘤生长和转移进行连续动态监测。结果显示，肿瘤生长迅速，并在注射后第14天即形成腹腔转移灶。小鼠出现显著的体重下降，提示系统性疾病的进展及肿瘤负荷增加。至注射后第30天，所有小鼠均达到实验终点标准，即>10% 的体重减轻，且尸检证实100%的小鼠存在腹腔内转移，60%-80%的小鼠出现肺部和肝实质转移。综上所述，卵巢癌细胞与间质细胞的正位移植可生成高度模拟人类卵巢癌早期弥漫性转移行为的肿瘤模型。此外，该模型为研究卵巢癌细胞与间质细胞相互作用在转移进展中的作用提供了有力工具。

引言

卵巢癌是一种致命性疾病，其5年生存率较低^th 女性所有癌症中最高的死亡率¹大多数卵巢癌女性患者在确诊时已处于晚期，70%的患者在诊断时已出现转移性扩散。早期转移和诊断时的晚期阶段等因素导致了该疾病较高的死亡率。此外，这些独特的疾病特征为建立卵巢癌小鼠模型带来了挑战，包括难以重现疾病向腹腔的快速迁移。^2,3,4.

卵巢癌的发病机制，包括腹膜播散，依赖于支持性肿瘤微环境（TME）的形成，该微环境由多种组分构成⁵。卵巢癌TME中的一个关键组分是癌相关间充质干细胞（CA-MSC）。CA-MSC是一类间质前体细胞，可促进卵巢癌的起始、生长、化疗耐药及转移^6,7。CA-MSC还通过促进肿瘤相关纤维化、诱导血管生成以及改变免疫微环境，驱动卵巢癌TME的形成^6,8,9。鉴于CA-MSC在卵巢....

方案

患者样本的获取遵循匹兹堡大学机构审查委员会（IRB）批准的方案（编号：PRO17080326）。动物实验方法遵循匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

1. 患者来源的癌相关间充质干细胞（CA-MSCs）的分离与鉴定

注意：CA-MSCs 来源于手术切除的人卵巢癌组织（本研究使用高级别浆液性癌），包括输卵管、卵巢和/或大网膜转移灶。CA-MSC 培养基由乳腺上皮细胞基础培养基（MEBM）配制而成，添加 10% 热灭活胎牛血清（FBS）、1× B27、20 ng/mL 表皮生长因子（EGF）、1 ng/mL 氢化可的松、5 µg/mL 胰岛素、100 µM β-巯基乙醇、10 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（β-FGF）、1% 青霉素/链霉素和 20 µg/mL 庆大霉素^7,13。

1. CA-MSC 的分离
   1. 使用无菌手术刀和镊子将组织样本切成约 1 mm³ 大小的组织块。将三块组织放入 6 孔细胞培养板的每个孔中。
      注意：0.2 g 肿瘤组织可切割为 12 块，并分配至 6 孔细胞培养板的四个孔中。
   2. 每孔加入约 1 mL 的 CA-MSC 培养基，形成薄层。将细胞培养板置于 37 °C、5....

结果

该方法通过将患者来源的间充质干细胞（CA-MSCs）与卵巢癌细胞共同注射到卵巢囊中，高度模拟了卵巢癌（特别是高级别浆液性癌）的支持性微环境。首先，CA-MSCs 从手术切除的、累及大网膜的人类高级别浆液性卵巢癌原发组织中分离获得（本实验中使用的所有 CA-MSCs 均来自同一位患者）。组织样本贴壁培养两周后，对 CA-MSCs 进行检测，确认其符合国际细胞治疗学会（ISCT）定义的间充质干细胞/多能间充质基质细胞标准。由于 CA-MSCs 为患者来源的原代细胞，不同细胞系之间在形态上可能存在轻微差异（图 1）。

在将OVCAR3-Luc肿瘤细胞与CA-MSCs以1:1比例混合后原位移植至NSG小鼠卵巢囊膜内，肿瘤形成率达100%。移植后第7天，通过活体生物发光成像系统（IVIS）确认肿瘤成功植入。此后每周进行IVIS成像，以记录肿瘤生长及转移情况。生物发光成像显示，随着时间推移，肿瘤持续进展性生长图 2A）。连续成像还显示，注射后第14天出现腹腔内转移灶，且随着实.......

讨论

尽管在临床和研究方面付出了巨大努力，但在卵巢癌的治疗和预防方面取得的进展仍然有限¹。虽然已有多种小鼠模型被用于研究卵巢癌的发展和转移过程，但这些模型存在显著的局限性。特别是，以往的小鼠模型无法完全重现卵巢癌进展的自然病程，包括早期广泛性腹腔内转移这一标志性特征^11,12。最近的研究表明，卵巢癌的间质微环境在疾病进展和转移中起着关键作用⁶，因此，构建一个能够在生理相关间质微环境中模拟卵巢癌的小鼠模型，将是一个极具优势的特性。

本研究建立了一种包含卵巢间质微环境的原位卵巢癌小鼠模型，该模型通过使用癌相关间充质干细胞（CA-MSCs）实现。实验结果表明，当将患者来源的CA-MSCs与卵巢癌细胞共同注射后，所形成肿瘤表现出侵袭性表型，表现为注射后14天内所有小鼠均出现早期且弥漫性的腹腔内转移。此外，在实验过程中，小鼠群体出现显著的总体重下降，至注射后第30天时体重减轻超过10%。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶/0.02% EDTA	Sigma	SLCD2568
抗人CD105抗体	BD Pharmingen	560847
抗人CD73抗体	BD Pharmingen	555596
抗人CD90抗体	BD Pharmingen	561443
B27	Gibco	17504-044
β-FGF	Gibco	PHG0261
β-巯基乙醇	MP Biomedicals	194834
卡洛芬	Henry Schein	11695-6934-1
D-荧光素	PerkinElmer	122799
DMEM	Gibco	11995-065
EGF	Gibco	PHG0311
庆大霉素	Gibco	15710072
热灭活胎牛血清	Gibco	16000069
胰岛素	Gibco	12585014
胰岛素注射器	BD Pharmingen	324704
活体成像系统 IVIS	PerkinElmer	IVIS Lumina X5
Matrigel	Corning	354230
MEBM（乳腺上皮细胞基础培养基）	ATCC	PCS-600-030
支原体检测试剂盒	ABm	G238
NSG 小鼠	The Jackson Laboratory	5557
OVCAR3	ATCC	HTB-161
青霉素/链霉素	Gibco	15070063
聚乙醇酸缝合线	ACE	003-2480