神经节苷脂是一类含唾液酸的鞘糖脂，在脑组织中尤为丰富。由于其两亲性，需要采用有机相/水相萃取和纯化技术，以确保获得最佳回收率和准确的分析结果。本文概述了分析级和制备级规模的神经节苷脂提取、纯化及薄层色谱分析方法。
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摘要
摘要
神经节苷脂是一类含有一个或多个唾液酸残基的糖鞘脂。它们存在于所有脊椎动物的细胞和组织中，尤其在脑组织中含量丰富。神经节苷脂主要表达于细胞质膜的外层小叶，通过侧向相互作用调节细胞表面蛋白的活性，作为细胞间相互作用的受体，并且是病原体和毒素的作用靶点。人类神经节苷脂生物合成的遗传性失调会导致严重的先天性神经系统疾病。由于其两亲性特性，自神经节苷脂被发现以来的80年中，许多研究人员已对其提取、纯化和分析技术进行了优化。本文介绍可在数小时内完成的、从组织和细胞中提取、纯化以及初步定性和定量分析主要神经节苷脂的实验室常规方法。同时，我们还描述了从脑组织中大规模分离和纯化主要神经节苷脂组分的方法。这些方法共同为这类生物活性分子的分析和制备提供了可靠的技术途径。
引言
神经节苷脂被定义为含有一种或多种唾液酸残基的糖鞘脂1。它们主要表达于细胞表面，其疏水性神经酰胺脂质部分嵌入质膜的外层小叶中，而亲水性聚糖则延伸至细胞外空间2。尽管神经节苷脂在脊椎动物的细胞和组织中广泛分布，但在脊椎动物脑组织中尤为丰富3，其最初即在此处被发现并命名4。
神经节苷脂聚糖的结构具有多样性，这也是其命名的基础（图1）。神经节苷脂聚糖由一个中性糖核心构成，其上连接不同数量和分布的唾液酸。最小的神经节苷脂GM4仅含有两个糖基（唾液酸与半乳糖相连）5。较大的天然神经节苷脂可能含有超过十几个糖基6，或在一个中性核心上最多连接七个唾液酸7。它们的神经酰胺脂质部分也存在差异，具有不同长度的鞘氨醇以及多种脂肪酸酰胺。在脊椎动物大脑中，四种神经节苷脂组分——GM1、GD1a、GD1b和GT1b——占主导地位。神经节苷脂的表达具有发育阶段特异性、组织特异性和细胞类型特异性。
图1：主要脑部神经节苷脂及其生物合成前体。 结构表示采用糖类符号命名法11。请点击此处查看此图的放大版本。
神经节苷脂在分子水平上的功能是通过与其自身膜中的蛋白质相互作用并调节其活性（顺式调控），或通过与细胞外环境中的糖结合蛋白相互作用，包括细菌毒素及其他细胞上的凝集素（反式识别）3。神经节苷脂与调控蛋白的特异性结合，以及/或与其他分子自组装形成脂筏，可导致细胞行为的改变，从而影响神经系统的结构与功能、癌症进展、代谢、炎症、神经元蛋白病变以及感染性疾病8。由于神经节苷脂在细胞中具有多种功能，对其分离与分析的方法有助于更深入地理解生理和病理过程的调控机制。本文提供了从脑组织中快速小规模提取与分析，以及制备规模分离神经节苷脂的经验证方法，并讨论了将这些方法应用于其他组织时所面临的机遇与挑战。
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方案
组织采集是在约翰斯·霍普金斯动物护理和使用委员会授权的条件下进行的。
1. 小规模神经节苷脂提取与部分纯化
警告：使用挥发性和有毒溶剂时，应确保适当的通风。避免使用塑料制品；溶剂会从许多塑料中提取出干扰后续分析的化学成分。聚四氟乙烯（PTFE）除外；应使用带 PTFE 衬里的盖子密封玻璃储存瓶。
- 提取
- 称取单个小鼠脑组织（或半脑矢状切片，约 0.2–0.5 g），置于预冷的玻璃匀浆器（Potter-Elvehjem 匀浆器）中，冰浴备用。
注意：解冻后的先前冷冻脑组织可用于后续操作，解冻温度为 0-4 °C. - 按每克组织湿重加入 4.1 mL 水，匀浆 10 次。
注意：准确的溶剂比例是实现最佳提取和分配的关键，目标比例为氯仿-甲醇-水相（4:8:3），前提是脑组织含水量为80%。 - 每克组织湿重加入 13 mL 甲醇，转移至室温（22 °C）并混匀。
注意：溶液将呈现浑浊状态。此步骤中仅添加甲醇而不加入氯仿，可优化蛋白质沉淀效果。后续所有步骤均在室温下进行（22 °C). - 转移至室温下的厚壁玻璃螺口管中，使用带聚四氟乙烯（PTFE）衬垫的螺帽密封22 °C）并充分混匀。按每克组织湿重加入6.5 mL氯仿，盖紧盖子，充分混匀。于450 × g离心 g 15 分钟后，将上清液转移至新的螺旋盖管中，并测量体积， "回收提取液体积".
- 称取单个小鼠脑组织（或半脑矢状切片，约 0.2–0.5 g），置于预冷的玻璃匀浆器（Potter-Elvehjem 匀浆器）中，冰浴备用。
- 分离
- 加入 0.173x "回收提取物体积" 加入适量水至澄清上清液中，盖紧瓶盖，充分涡旋振荡，然后按照步骤1.1.4所述进行离心。
注意：目标是使氯仿-甲醇-水相的比例为4:8:5.6。混合物将呈浑浊状，并分离为两相：上层为富水相，下层为富氯仿相，体积比约为4:1。静置60分钟，或在450 × g下离心15分钟，以实现完全的相分离。 - 将含有神经节苷脂的上层相转移至带有聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的新玻璃管中。
- 加入 0.173x "回收提取物体积" 加入适量水至澄清上清液中，盖紧瓶盖，充分涡旋振荡，然后按照步骤1.1.4所述进行离心。
- 反相柱色谱
- 使用5 mL玻璃注射器，用3 mL甲醇冲洗tC18固相萃取柱（400 mg），随后用3 mL氯仿-甲醇-水（2:43:55）冲洗。将1.2.2步骤中的上相加载至tC18柱上 使用同一玻璃注射器收集流出液，并重新加载到柱子上，以优化吸附效果。
- 使用玻璃注射器，先用 3 mL 氯仿-甲醇-水（2:43:55）洗涤柱芯，再用 3 mL 甲醇-水（1:1）洗涤。
- 用3 mL甲醇将神经节苷脂洗脱至新的带螺口盖的试管中。在≤氮气缓流下吹干。 45 °C用甲醇溶解，每克原始组织湿重使用1 mL甲醇。
2. 大规模神经节苷脂的提取与纯化
警告：使用挥发性溶剂时，应使用防爆型搅拌器。除聚四氟乙烯（PTFE）外，不得使用其他塑料制品。四氢呋喃、氯仿和乙醚是有毒的挥发性有机化合物。操作应在通风橱中进行，并佩戴防护手套和安全护目镜。
- 提取
- 将冷冻的牛脑在 4 °C 下解冻数小时。从脑膜和白质中分离出灰质。
注意：以下步骤以 100 ± 20 g 分离得到的脑灰质为基准描述，可按比例放大或缩小。 - 将 100 g 脑灰质放入搅拌器中，按每克湿重脑组织加入 1 mL 冰冷的 10 mM 磷酸钾缓冲液（pH 6.8），低速均质 20 秒。然后按每克湿重脑组织加入 8 mL 四氢呋喃，低速均质 10 秒。将混合液倒入玻璃离心瓶中，在常温（22 °C）下以 5,000 × g 离心 15 分钟。
- 收集上清液，测量体积后转移至玻璃分液漏斗中。按每毫升上清液加入 0.3 mL 乙醚，剧烈振荡，静置 30 分钟，使液体分为两相：上层为乙醚相，下层为水相。收集含有神经节苷脂的下层水相，置于带聚四氟乙烯（PTFE）衬垫盖的玻璃瓶中。
- 向分液漏斗中残留的上层（乙醚）相中，按原始上清液体积每毫升加入 0.1 mL 水（见步骤 2.1.3）。剧烈振荡，待两相分层后，收集下层（水相），并与前次收集的下层水相合并。将合并后的水相蒸发至干燥粉末状，称重。
- 将冷冻的牛脑在 4 °C 下解冻数小时。从脑膜和白质中分离出灰质。
- 皂化
- 在密封试管中，按每克粉末加入 10 mL 100 mM 的水相 NaOH 溶液。混匀后于 37 °C 孵育 3 小时。冷却后，逐滴加入 100 mM 的水相 HCl 溶液，调节 pH 至 4.5。测量体积后转移至玻璃分液漏斗中。
注意：唾液酸在酸性条件下不稳定，应避免 pH 低于 4.5。 - 根据水相体积，加入 2.67 倍体积的甲醇，轻轻混匀，再加入 1.33 倍体积的氯仿，形成单一相的氯仿-甲醇-水溶液（4:8:3）。充分混匀。
- 根据原始水相体积，加入 2.6 倍体积的水，使混合液的氯仿-甲醇-水比例达到 4:8:5.6。剧烈振荡后静置，待其分层为两相：上层为含神经节苷脂的极性相，下层为非极性相。收集上层极性相，置于带聚四氟乙烯（PTFE）衬垫盖的玻璃瓶中。
注意：非唾液酸化的脂质在使用间苯二酚染色的薄层色谱（TLC）板上不显色，但在使用 p-茴香醛染色时可见。本皂化步骤的目的是去除如磷脂等 O-乙酰化化合物。
- 在密封试管中，按每克粉末加入 10 mL 100 mM 的水相 NaOH 溶液。混匀后于 37 °C 孵育 3 小时。冷却后，逐滴加入 100 mM 的水相 HCl 溶液，调节 pH 至 4.5。测量体积后转移至玻璃分液漏斗中。
- 反相色谱
- 使用真空或加压方式（每次冲洗时间 <1 分钟），依次通过 50 mL 下列三种溶剂对大规格（10 g）tC18 固相萃取柱进行预清洗：甲醇、甲醇-水（1:1）、氯仿-甲醇-水（2:43:55）。将步骤 2.2.3 得到的上层相加载至柱中，收集穿流液，重新上样，再次收集穿流液。
- 用 30 mL 氯仿-甲醇-水（2:43:55）洗涤柱子，再用 30 mL 甲醇-水（1:1）洗涤，随后用 50 mL 甲醇洗脱神经节苷脂，再用 10 mL 甲醇重复洗脱一次，分别收集每次洗涤液和洗脱液。通过薄层色谱（见下文）确认穿流液和洗涤液中无神经节苷脂，而神经节苷脂在第一次洗脱（50 mL 甲醇）中被洗出。将洗脱得到的神经节苷脂溶液蒸发至干燥粉末状，称重。
注意：tC18 色谱的目的是将神经节苷脂与极性更强或更弱的杂质分离。经皂化后，混合脑神经节苷脂的产率约为每克干脑提取物 120 mg（见步骤 2.1.4）。若在穿流液或洗涤液中通过薄层色谱检测到神经节苷脂，表明固相萃取柱已饱和。甲醇洗脱后，可进一步用氯仿-甲醇（1:1）洗脱以收集更非极性的脂质。
- 高效液相色谱法纯化单个神经节苷脂
- 配制高效液相色谱溶剂 A：乙腈-5 mM 水相磷酸钠缓冲液（pH 5.6）（83:17）；溶剂 B：乙腈-20 mM 磷酸钠缓冲液（pH 5.6）（1:1）。两种溶剂均脱气 5 分钟。
- 使用 100% 溶剂 A 对高效液相色谱柱（20 × 250 mm，填充氨基键合（NH2）硅胶微球，粒径 5 µm，孔径 100 Å）在流速 5 mL/min 下预平衡 20 分钟。将紫外（UV）检测器的波长设定为 215 nm。
- 将反相洗脱得到的神经节苷脂粉末溶于水中，浓度为 5 mg/mL。取 0.5 mL 神经节苷脂混合液进样至高效液相色谱系统，按（表 1）设定的梯度程序在 5 mL/min 流速下运行，并收集各组分。神经节苷脂将在 25–70 分钟间以 A215 峰形式出现（主要脑神经节苷脂的保留时间）：GM1 ≈ 28 分钟；GD1a ≈ 38 分钟；GD1b ≈ 46 分钟；GT1b ≈ 65 分钟。每次运行后用溶剂 A 重新平衡 20 分钟。通过薄层色谱分析各组分。
| 时间 (min) | %A | %B |
| 0 | 100 | 0 |
| 7 | 100 | 0 |
| 12 | 63 | 37 |
| 82 | 54 | 46 |
| 82.01 | 0 | 100 |
| 92 | 0 | 100 |
表1：HPLC的溶剂梯度。
3. 神经节苷脂的薄层色谱（TLC）分析
注意：氯仿是一种有毒的挥发性有机化合物。操作时应在通风橱中进行，并佩戴防护手套和安全护目镜。
- 展开溶剂与薄层色谱板的制备
- 配制氯仿-甲醇-0.25% KCl水溶液（体积比60:35:8）作为展开剂。将其倒入10 cm × 10 cm的玻璃薄层层析槽中，使用不锈钢盖，使溶剂深度约为0.5 cm。盖上盖子，置于无气流干扰的环境中平衡 >10 分钟
注意：为使薄层层析室免受气流干扰，可自制或购买一个丙烯酸材质的五面盒 (图2）。切勿在染色缸内使用溶剂饱和的滤纸。 - 将一块10 cm × 10 cm或5 cm × 10 cm的硅胶涂层玻璃背板高效薄层色谱板置于干燥烘箱中 125 °C 10分钟。静置冷却。使用磨钝的2号铅笔，在距板底部1厘米、距左右两侧至少1厘米的位置画一条直线，并沿此线每隔2毫米画一条5毫米的点样线，线间间距为2毫米（图3）。标记时避免扰动硅胶层。
- 在甲醇中配制纯神经节苷脂的标准混合液，其中包含 100 µM GM1, 50 µM GD1a 和 GD1b 各 33 µM GT1b。
注意：该混合物每含有 100 pmol 神经节苷脂唾液酸 µL 对于每种神经节苷脂，其用量需能够通过依赖唾液酸的间苯二酚染色产生强烈的比色信号。
- 配制氯仿-甲醇-0.25% KCl水溶液（体积比60:35:8）作为展开剂。将其倒入10 cm × 10 cm的玻璃薄层层析槽中，使用不锈钢盖，使溶剂深度约为0.5 cm。盖上盖子，置于无气流干扰的环境中平衡 >10 分钟
- 神经节苷脂分离
- 洗涤一个10-µL 带有斜面针头的汉密尔顿注射器，内含甲醇。抽取 1 µL 将甲醇注入玻璃注射器以填充针头的死体积，然后 1 µL 样品或标准品的点样。将样品均匀地点加到已标记的5-mm线上，直至 <1 µL 溶剂（甲醇）残留在注射器中。让板在室温下自然干燥（22 °C所有样品点样完成后。
注意：在上样不同样品之间，用甲醇清洗注射器。可使用设置为低档的未加热吹风机以加速干燥。 - 将点样并干燥的薄层板放入预先平衡的薄层色谱展开槽中，使板的底边浸入展开剂中，盖上盖子并避免气流干扰。图2）。让展开剂通过毛细作用沿板上升，直至溶剂前沿距板顶端约1 cm处。取出薄层板，用铅笔在板边缘标记溶剂前沿位置。将溶剂完全挥发，可静置或在温和气流下进行。
- 洗涤一个10-µL 带有斜面针头的汉密尔顿注射器，内含甲醇。抽取 1 µL 将甲醇注入玻璃注射器以填充针头的死体积，然后 1 µL 样品或标准品的点样。将样品均匀地点加到已标记的5-mm线上，直至 <1 µL 溶剂（甲醇）残留在注射器中。让板在室温下自然干燥（22 °C所有样品点样完成后。
图2：神经节苷脂薄层色谱设备及装置 setup。 双槽室被填充至 ≈ 两侧各留 0.5 cm，加入展开溶剂。将薄层板置于一侧，原点端浸入展开缓冲液中。用丙烯酸盒覆盖层析缸，以避免气流干扰。图 A，插入薄层板前的侧面图；可见溶剂液面位于层析缸底部上方几毫米处；图 B，展开过程中的正面图。溶剂前沿位于薄层板约 40% 高度处。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 神经节苷脂染色
警告：试剂具有毒性。盐酸具有腐蚀性和毒性。请在通风橱内配制和喷洒试剂，并佩戴防护手套和安全护目镜。
注意：可通过移除夹子并用透明胶带固定盖板来保存薄层色谱板，或直接成像用于定性图像分析。通过测量相邻泳道中点样的神经节苷脂标准品的光密度，可进行定量分析。- 制备间苯二酚喷雾试剂，用于基于神经节苷脂中唾液酸的检测。将6 g间苯二酚溶解于100 mL水中，配制成6%间苯二酚储备液。将1 g CuSO4溶解于100 mL水中，配制成1%储备液。向64.7 mL水中加入5 mL 6%间苯二酚储备液和0.31 mL 1% CuSO4储备液，然后缓慢加入30 mL浓盐酸，轻轻搅拌。该试剂可在4 °C下保存一个月。
- 在化学通风橱内，将已分离神经节苷脂的薄层色谱板（原点端朝上）放入一个切去部分的纸板箱中，以防止酸雾喷溅到通风橱内壁。将间苯二酚喷雾试剂装入玻璃薄层喷雾器中，连接至加压氮气源，以轻柔的动作沿垂直和水平方向对角喷洒色谱板。应均匀但轻柔地喷洒薄层吸附剂表面。
- 立即用一块尺寸相同的洁净干燥玻璃盖板覆盖色谱板，并用文件夹夹子固定盖板位置（图3）。将盖好的板在125 °C下加热20分钟。神经节苷脂将在白色背景上呈现深紫色。
注意：喷洒完成后，板面不应呈现湿润状态。盖板可通过单刃剃须刀片刮除已使用过的薄层色谱板上的吸附剂来制作。
警告：二氧化硅粉末对肺部有毒性。操作时应佩戴口罩，并将二氧化硅置于密封容器中妥善处理。
图 3：分离的混合神经节苷脂的薄层色谱板。 分离的混合神经节苷脂标准品（左泳道）和纯化的牛脑灰质来源混合神经节苷脂（右泳道）经间苯二酚染色并用夹好的玻璃盖板加热后的薄层色谱（TLC）板。标准神经节苷脂（从上至下）分别为 GM3、GM2、GM1、GD3、GD1a、GD1b、GT1b 和 GQ1b。冷却后，可对色谱板进行成像，和/或用胶带固定盖板以供储存。请点击此处查看该图的放大版本。
- 用于神经节苷脂和磷脂的通用脂质染色。
警告：硫酸具有毒性和腐蚀性。将浓酸加入乙醇时会放热，必须缓慢进行。应在通风橱内配制染色试剂，并佩戴防护手套和安全护目镜。- 准备 p-茴香醛染色液：将15 mL浓硫酸缓慢加入500 mL乙醇中。搅拌30分钟，待溶液冷却后再进行后续操作。加入15 mL p-茴香醛，轻轻搅拌。可在室温下保存（22 °C长达六个月。
- 在化学通风橱中，将已分离神经节苷脂的薄层色谱板点样端浸入 向下，放入一个含有 p-anisaldehyde 染色剂。将 TLC 板浸入染色剂中至展开前沿，持续 ≥ 2 秒。取出 TLC 板并沥干。将 TLC 板置于低温加热板上加热显色。
注意：脂质在紫色背景下呈暗色。染色液可回收后重复使用。
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结果
第1部分（小规模）所述方法可提供足量且高纯度的神经节苷脂，用于定性和定量测定主要脑神经节苷脂。按照所述方法从小鼠脑组织中提取时，每克脑组织湿重可获得约 1 µmol 神经节苷脂（1 nmol/µL）。如野生型和基因修饰小鼠的结果所示（图4），采用第3部分方法对1 µL（1 nmol）样品进行薄层色谱（TLC）分离，可获得足够材料用于间苯二酚显色检测，并能完全分辨所有主要脑神经节苷脂。尽管采用第1部分方法制备的混合神经节苷脂仍含有其他主要脂类成分，但其纯度已足以满足质谱（MS）分析要求（如图5所示），既可在负离子模式下直接分析天然纯化的神经节苷脂，也可在完全甲基化后采用正离子模式分析9。由于第1部分方法避免了使用碱性水解去除磷脂，因此保留了对碱敏感的天然修饰基团，例如O-乙酰化唾液酸（见GT1b-OAc，图4）9。
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讨论
本文所述的小规模和大规模神经节苷脂提取与分离方法并非唯一选择——已有多种不同的溶剂提取和纯化方法可获得优异的结果12. 本文所述从小鼠脑组织中进行小规模纯化的方法来自 Fredman 和 Svennerholm13，被证明可优化回收率，并且在本实验室多年实践中已被证实为稳健且简便的方法。从完整组织到分离 gangliosides，适用于薄层色谱（TLC）和质谱（MS）分析的分离与纯化过程可在数小时内完成。质谱分析可在负离子模式下直接对天然纯化的 gangliosides 进行，或在完全甲基化后于正离子模式下进行（图7，例如参见 Sturgill 等人9产量非常稳定， ≈ 1 µmol 神经节苷脂（≈ 2 µ每克新鲜脑组织中多数哺乳动物的神经节苷脂结合唾液酸含量约为 10–15 nmol。本文所述的大规模脑组织神经节苷脂提取与分配方法由 Tettamani 等人提出。
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）糖科学共同基金项目U01CA241953资助。MJP得到了约翰斯·霍普金斯大学化学生物学交叉项目（T32GM080189）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 去膜牛脑 | PelFreez | 57105-1 | |
| 神经节苷脂标准品 | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| 带聚四氟乙烯（PTFE）内衬瓶盖的玻璃瓶 | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| 玻璃离心管 | Fisher Scientific | 05-586B | |
| 玻璃培养管，16 × 125 mm | VWR | 60825-430 | 用于收集高效液相色谱（HPLC）组分 |
| 玻璃分液漏斗（2 L） | Pyrex | 6400-2L | |
| 进样注射器 - Hamilton 1750 气密型 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| 对甲氧基苯甲醛，98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem 匀浆器 | Fisher Scientific | 08-414-14A | 选择合适体积规格 |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5×4 mm 保护柱 | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2，5 μm，250 mm × 20 mm 高效液相色谱柱 | Analytics-Shop | 定制填充 | 提供其他尺寸 |
| 间苯二酚 | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| 旋转蒸发仪 | Buchi | R-300 | |
| 7725 型进样器样品环（5 ml） | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 真空小柱，35 cc（10 g） | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus 短柱，400 mg | Waters | WAT036810 | |
| 点样注射器 - Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| 带聚四氟乙烯（PTFE）内衬瓶盖的厚壁试管（直径 13 mm） | Fisher Scientific | 14-933A | |
| 带螺纹盖及聚四氟乙烯（PTFE）内衬的 2 ml 小瓶 | Fisher Scientific | 14-955-323 | 用于神经节苷脂储存 |
| TLC 板，HPTLC 硅胶 60 F254 多规格板 | Fisher Scientific | M1056350001 | 荧光指示剂（F254）可稳定吸附剂表面 |
| TLC 试剂喷雾器 | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| 适用于 10 × 10 cm TLC 板的展开槽 | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1 升不锈钢防爆搅拌器 | Waring | E8520 |
参考文献
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