基于乙型肝炎病毒（HBV）衍生的肽阵列，可同时评估HBV特异性的CD4 T细胞应答并鉴定HBV特异性的CD4 T细胞表位。
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本文内容
摘要
摘要
CD4 T细胞在慢性乙型肝炎的发病机制中发挥重要作用。作为一种多功能的细胞群体，CD4 T细胞可根据其分泌的细胞因子被划分为不同的功能亚群：例如，CD4辅助性T细胞1（Th1）分泌IFN-γ，CD4辅助性T细胞2（Th2）分泌IL-4和IL-13，CD4滤泡辅助性T细胞（Tfh）分泌IL-21，CD4辅助性T细胞17（Th17）分泌IL-17。通过乙型肝炎病毒（HBV）来源的多肽刺激后，基于细胞因子分泌情况分析HBV特异性CD4 T细胞，不仅可以了解HBV特异性CD4 T细胞应答的强度，还能揭示其功能亚群特征。一些新兴方法，如转录组学和代谢组学分析，可进一步提供关于HBV特异性CD4 T细胞的更详细功能信息。这些方法通常需要利用多肽-主要组织相容性复合物II类（MHC-II）多聚体来分离具有活性的HBV特异性CD4 T细胞，但目前关于HBV特异性CD4 T细胞表位的信息仍较为有限。基于一种HBV来源的多肽矩阵，已建立一种方法，可同时利用慢性HBV感染患者的外周血单个核细胞样本评估HBV特异性CD4 T细胞应答并鉴定HBV特异性CD4 T细胞表位。
引言
目前，分析抗原特异性T细胞主要有三种方法。第一种方法基于T细胞受体与肽段（表位）之间的相互作用。抗原特异性T细胞可直接使用肽段-主要组织相容性复合物（MHC）多聚体进行染色。该方法的优点是能够获得有活力的抗原特异性T细胞，适用于后续的转录组学/代谢组学分析。该方法的局限性在于无法提供针对特定抗原的完整T细胞应答信息，因为它依赖于已验证的表位肽段，而目前针对特定抗原所鉴定出的表位数量仍然有限。与乙型肝炎病毒（HBV）特异性的CD8 T细胞表位相比，目前已鉴定的HBV特异性CD4 T细胞表位较少1,2，因此该方法目前在分析HBV特异性CD4 T细胞方面应用受限。
第二种方法基于抗原肽刺激后一系列活化诱导标志物的上调3。常用的标志物包括CD69、CD25、OX40、CD40L、PD-L1、4-1BB4。目前该方法已用于分析疫苗接种个体5,6、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染患者7以及严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染患者8,
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方案
已获得参与本研究的每位患者的书面知情同意。本研究方案遵循1975年《赫尔辛基宣言》的伦理准则，并已事先获得西南医院医学伦理委员会的批准。
1. HBV来源的肽阵列设计
- 从NCBI数据库下载乙型肝炎病毒（HBV）核心抗原的氨基酸序列（GenBank: AFY98989.1）。
- 从多肽合成服务供应商处购买HBV核心抗原衍生的多肽（一组包含35条15-mer多肽，每条多肽与相邻多肽重叠10个氨基酸残基，纯度>90%，每条多肽4 mg）。
- 建立一个6×6的方形多肽矩阵，矩阵中每个位置仅包含1条多肽。共形成12个多肽混合池：6个行多肽池和6个列多肽池，每个池中含有5-6条多肽16。矩阵中的行多肽池和列多肽池代表HBV核心抗原的两种独立组合形式。
- 将所购多肽中约3/4的部分，按照矩阵中的同一行或同一列，分别混合成12个独立的多肽混合池，通过将每条多肽共同溶解于二甲基亚砜（DMSO）中实现（每条多肽浓度为2 µg/µL）。储存于-80 °C，用于分析HBV特异性CD4 T细胞应答。
- 将剩余的多肽分别单独溶解（浓度为10 µg/µL），储存于-80 °C，用于表位鉴定。
2. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离
- 从慢性 HBV 感染患者中采集 5 ....
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结果
分泌细胞因子的CD4 T细胞频率计算为单分泌细胞和双分泌细胞之和。如图1所示，背景对照（DMSO）中分泌TNF-α的CD4 T细胞频率和分泌IFN-γ的CD4 T细胞频率分别为0.154%和0.013%。针对Core11肽库特异性的分泌TNF-α的CD4 T细胞频率和分泌IFN-γ的CD4 T细胞频率分别为0.206%和0.017%，因此该肽库诱导的TNF-α分泌型CD4 T细胞反应和IFN-γ分泌型CD4 T细胞反应均被判定为阴性。针对Core09肽库特异性的分泌TNF-α的CD4 T细胞频率和分泌IFN-γ的CD4 T细胞频率分别为2.715%和0.973%，因此该肽库诱导的TNF-α分泌型CD4 T细胞反应和IFN-γ分泌型CD4 T细胞反应均被判定为阳性。
如图2所示，阳性孔以灰色背景表示。在计算乙型肝炎病毒（HBV）核心特异性TNF-α分泌型CD4 T细胞反应率时，应纳入肽库Core01、Core02、Core04、Core05、Core06、Core0.......
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讨论
本方案中最关键的步骤如下：1）获取足量且活力高的外周血单个核细胞（PBMC），以启动PBMC扩增；2）为PBMC扩增提供适宜的培养环境；3）在进行表位鉴定前，彻底清除PBMC培养物中残留的肽段混合物。
本方案中的所有分析均依赖于CD4 T细胞的稳健增殖。通常情况下，外周血单个核细胞（PBMC）经过10天扩增后的细胞数量将达到初始数量的2至3倍。细胞数量和PBMC的活力是PBMC扩增过程中的两个关键因素。如果目的仅为分析乙型肝炎病毒（HBV）特异性CD4 T细胞而无需表位鉴定，则可以合理减少初始PBMC数量，尤其是在血样体积有限的情况下。然而，根据我们的经验，若每孔起始PBMC数量低于1.5×105个细胞，则几乎无法实现成功的PBMC扩增。使用新鲜PBMC进行扩增时，细胞活力通常不会成为问题；但在使用冻存PBMC进行扩增时，必须谨慎操作PBMC的冷冻保存与复苏过程，以维持其细胞活力。
在HBV特异性T细胞的功能分析中，通常使用IL-12扩增外周血单个核细胞（PBMCs），以增强CD8 T细胞的功能。由于IL.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（81930061）、重庆市自然科学基金（cstc2019jcyj-bshX0039，cstc2019jcyj-zdxmX0004）和中国国家重点研发计划
传染病防治科技重大专项（2018ZX10723203）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白 V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC标记的抗人TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | 避光保存 |
| 苯并核酸酶（Benzonase Nuclease） | Sigma-Aldrich | E1014 | 防止细胞聚集 |
| B淋巴母细胞系（BLCLs） | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803纯合子 |
| B淋巴母细胞系（BLCLs） | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202纯合子 |
| 细胞培养瓶（T75） | Corning | 430641 | |
| 细胞培养板（96孔，平底） | Corning | 3599 | 平底 |
| 细胞培养板（96孔，圆底） | Corning | 3799 | 圆底 |
| 细胞筛 | Corning | CLS431751 | 孔径70 μm，白色，无菌 |
| 离心管（15 mL） | KIRGEN | KG2611 | 无菌 |
| 离心管（50 mL） | Corning | 430829 | 无菌 |
| 冷冻离心机 | Eppendorf | 5804R | |
| 冷冻离心机 | Thermo | ST16R | |
| 冷冻离心机 | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm试剂盒（转录因子缓冲液套装） | BD Biosciences | 562574 | 使用前配制溶液 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2650 | 室温保存以防止结晶 |
| Dulbecco’s磷酸盐缓冲液 | 配制含NaCl（8000 mg）、KCl（200 mg）、KH2PO4（200 mg）和Na2HPO4·7H2O（2160 mg）的ddH2O（1000 ml）。调节pH至7.4，高压灭菌。 | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| 滤芯吸头（0.5–10） | Kirgen | KG5131 | 无菌 |
| 滤芯吸头（100–1000） | Kirgen | KG5333 | 无菌 |
| 滤芯吸头（1–200） | Kirgen | KG5233 | 无菌 |
| FITC标记的抗人CD4 | BioLegend | 300506 | 避光保存 |
| 可固定的活力染料eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | 避光保存 |
| 高尔基体阻断蛋白转运抑制剂（含莫能菌素） | BD Biosciences | 554724 | 蛋白转运抑制剂 |
| 血细胞计数板 | Brand | 718620 | |
| 乙型肝炎病毒核心抗原衍生肽 | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| 人AB型血清 | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| 离子霉素（Ionomycin） | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa流式细胞仪 | BD | ||
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| 微量离心管（1.5 mL） | Corning | MCT-150-C | 使用前需高压灭菌 |
| 微孔板振荡器 | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| 丝裂霉素C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4·7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR管（0.2 mL） | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7标记的抗人CD8 | BioLegend | 300914 | 避光保存 |
| PE标记的抗人IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | 避光保存 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5标记的抗人CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | 避光保存 |
| 佛波醇12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA） | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| 重组人IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| 重组人IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| 丙酮酸钠（100 mM） | Gibco | 15360070 | |
| 台盼蓝染液（0.4%） | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF纯化的抗人HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard基因组DNA纯化试剂盒 | Promega | A1125 |
参考文献
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al.
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重印与许可
