方法文章

基于肽矩阵的 HBV 特异性 CD4 T 细胞响应和 HLA-DR 受限 CD4 T 细胞表位的识别分析

DOI：

10.3791/62387

⸱

2021年10月20日

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medial University), 2Chongqing Key Laboratory for Research of Infectious Diseases

本文内容

摘要

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根据乙型肝炎病毒（HBV）衍生肽基质，可在识别乙肝病毒特异性CD4 T细胞表位的同时，对乙肝病毒特异性CD4 T细胞反应进行评估。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CD4 T细胞在慢性乙型肝炎的发病机制中起着重要作用。CD4 T细胞作为多功能细胞群，根据它们分泌的细胞因子被归类为独特的功能子集:例如，CD4 T帮手1细胞的IFN-γ，CD4 T帮手2细胞的IL-4和IL-13，CD4 T卵泡辅助细胞的IL-21，CD4 T助剂细胞的IL-17。分析乙型肝炎病毒（HBV）特异性CD4 T细胞，基于细胞因子分泌后，乙肝病毒衍生肽刺激，不仅可以提供有关乙肝病毒特异性CD4 T细胞反应的大小的信息，还可以提供有关HBV特异性CD4 T细胞功能子集的信息。新的方法，如转录学和代谢学分析，可以提供关于HBV特异性CD4 T细胞的更详细的功能信息。这些方法通常需要基于肽主要组织相容性复合II多默的活性HBV特异性CD4 T细胞进行分离，而目前有关HBV特异性CD4 T细胞表位的信息有限。基于乙肝病毒衍生肽基质，开发出一种利用慢性乙肝病毒感染患者的周围血单核细胞样本同时评估HBV特异性CD4 T细胞反应和识别HBV特异性CD4 T细胞表位的方法。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

目前，有3种主要方法分析抗原特异性T细胞。第一种方法基于T细胞受体和肽（同位素）之间的相互作用。抗原特异性T细胞可直接沾染肽主要组织相容性复合物（MHC）多元体。这种方法的优点是，它可以获得可行的抗原特异性T细胞，适合下游转录学/代谢学分析。这种方法的一个局限性是，它不能提供有关整个T细胞对特定抗原的反应的信息，因为它需要验证表位肽，而目前特定抗原的识别表位数量有限。与乙肝病毒（HBV）特异性CD8T细胞表位相比，目前发现的HBV特异性CD4 T细胞表位较少，使得该方法目前不太适用于HBV特异性CD4 T细胞的分析。

第二种方法是基于抗原肽刺激3后一系列激活诱发的标记物的调高。常用的标记包括CD69，CD25，OX40，CD40L，PD-L1，4-1BB4。目前，该方法已用于分析接种疫苗的5、6、人免疫机能丧失病毒感染患者7例、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2例感染患者8例、9例等抗原特异性T细胞反应。与基于检测的肽-MHC多默尔不同，这种方法不受验证表位的限制，可以获得可行的细胞进行下游分析。这种方法的一个局限性是它不能提供有关抗原特异性T细胞细胞因子特征的信息。此外，一些激活的抗原非特异性细胞表达这些激活诱导标记可能有助于分析中的背景信号，这可能是一个问题，尤其是当目标抗原特异性T细胞很少时。目前，该方法在HBV特异性CD4 T细胞4上的应用有限。该方法能否以可靠的方式用于分析乙肝特异性CD4 T细胞，还有待进一步研究。

第三种方法基于抗原肽刺激后的细胞因子分泌。与激活诱导标记分析一样，此方法不受验证表位的限制。这种方法可以直接揭示抗原特异性T细胞的细胞因子特征。这种方法的灵敏度低于激活诱导标记法，因为它依赖于抗原特异性T细胞的细胞因子分泌，测试的细胞因子数量通常有限。目前，该方法在HBV特异性T细胞分析中得到广泛应用。由于细胞因子分泌HBV特异性T细胞很难通过直接前体内肽刺激10，11检测到，HBV特异性T细胞的细胞因子特征通常分析后，10天的体外肽刺激膨胀12，13，14，15，16。已利用以矩阵形式排列肽池，以方便识别抗原特异性表位17、18。结合肽基质和细胞因子分泌分析，开发出一种评估HBV特异性CD4 T细胞反应，同时识别HBV特异性CD4 T细胞表位的方法。在此协议中，将描述此方法的详细信息。HBV 核心抗原被选为本协议中演示的示例。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

书面知情同意从每个患者包括在研究。研究协议符合1975年《赫尔辛基宣言》的伦理准则，西南医院医学伦理委员会事先批准后就反映了这一点。

1. HBV衍生肽基质的设计

  1. 从NCBI数据库（GenBank:AFY98989.1）下载HBV核心抗原的氨基酸序列。
  2. 从肽合成服务提供商处购买 HBV 核心抗原衍生肽（由 35 15 mer 肽组成的面板，由 10 种残留物重叠，纯度> 90%，4 毫克/肽）。
  3. 设置一个方形 6×6 肽基质，矩阵中每个位置仅包含 1 肽。有12个肽池:6排肽池和6列肽池，每个池5-6肽16。矩阵中的排肽池和柱肽池代表HBV核心抗原的2个单独的形成。
  4. 对于购买的肽中的 3/4，将矩阵的同一行/列中的多肽混合到 12 个单独的肽池中，将它们溶解在一起，以二甲基硫化物 （DMSO） （每个肽 2 μg/μL） 溶解。存储在 -80 °C，用于分析 HBV 特定 CD4 T 细胞响应。
  5. 分别溶解其余肽（10 μg/μL），并储存在 -80 °C 以进行表位识别。

2. 周围血单核细胞的分离

  1. 从慢性乙肝病毒感染患者身上抽取5mL静脉血。
    注:血量应大致根据肽池的数量加上1个背景控制和1个正控制来估计。分析 1 肽池需要 3 x 105 PBMC。平均而言，从1 mL血液中可获得1×106 个PC。
  2. 使用 Ficoll 密度梯度离心机（800 × 克，20 分钟）将 PBMC 与血液隔离，并在液氮中冷冻保存分离的 PBMC，供以后使用。
  3. 使用巴斯德移液器在透明菲科尔层和红血球层之间收集粒细胞。根据制造商的协议，使用基因组DNA净化试剂盒从粒细胞中提取基因组DNA。
  4. 将 DNA 样本发送给基因型服务提供商，以确定 HLA-DRB1 基因型。

3. 使用乙肝V肽矩阵的PCMCS的体外扩展

  1. 解冻 PBMC。
    1. 温暖的RPMI 1640 补充 1:10，000 苯甲酸酶 （25 U/mL） 到 37 °C 在水浴。
      注:本佐纳塞有助于限制解冻过程中的细胞堵塞。每个样品将需要20ml的RPMI 1640与苯甲酸酶。计算解冻所有样品所需的量，并准备单独的介质（37 °C），1:10，000 Benzonase（25 U/mL）。一次解冻不超过 5 个样本。
    2. 从液氮中取出样品，在水浴中快速解冻冷冻小瓶（37 °C）。
    3. 将解冻的电池悬架转移到 15 mL 离心机管上。向管中滴入 1 mL 的本佐纳塞 RPMI 1640 （37 °C）。慢慢地将 6 mL 的本佐纳塞 RPMI 1640 （37 °C） 添加到离心管中，用另一个 2 mL 的本佐纳塞 RPMI 1640 （37 °C） 冲洗冷冻，以检索所有细胞。尽快继续其他样品。
      注:冷冻保存样品的缓慢稀释是保持解冻细胞生存能力的关键。
    4. 离心机（400×克，10分钟），取出超高线，通过敲击管子松开颗粒。
    5. 轻轻地将颗粒重新沉入 1 mL 的温暖本佐纳塞 RPMI 1640 中。轻轻混合，并在需要时通过 70 μm 细胞过滤器过滤细胞（即，如果存在任何可见的团块）。
    6. Aliquot 在杜尔贝科的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 中加入 10 μL 悬浮物并稀释，加入 Trypan 蓝色 （0.04%），加载到血细胞计上，等待 1 分钟，并计算可行细胞（清除细胞）的数量。
    7. 在管子中加入 9 mL 的 Benzonase RPMI 1640 （37 °C），离心机（400 × g，10 分钟），取出超高音，然后通过轻触管子松开颗粒。
  2. RPMI 1640 中的再悬浮 PBMC 辅以 25 mM HEPES、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM 丙状酸钠、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和 10% 人类 AB 血清（完整培养介质）。将细胞密度调整为 1.5 x 106 细胞/mL。板式PC在96井板（平底）的密度为3×105 细胞/井。
  3. 将乙肝衍生肽池（每口肽 2 μg/mL）添加到每口井中。对于背景控制和正控井，添加相同数量的溶剂（DMSO，1 μL/mL）。添加 10 U/mL IL-2 和 10 ng/mL IL-7。在 37 °C 和 5% CO2下孵育。
  4. 在第 3 天，用 50 U/mL IL-2 和 10 ng/mL IL-7 补充培养介质。
    注:在第1天至第3天，不会观察到明显的T细胞增殖。由于B细胞、NK细胞、NKT细胞和单核细胞等非T细胞的死亡，细胞总数通常会减少1/3到1/2。
  5. 在第 7 天，用含有多肽（4 μg/mL）、IL-2 （100 U/mL） 和 IL-7 （20 ng/mL） 的新鲜介质替换一半的培养基。
    注意:为了避免干扰底部的细胞，移液器从介质顶部小心地将培养介质的 90 μL 左右。在第3天到第7天，将观察到强大的T细胞增殖，并扩散T细胞通常聚集成集群。
  6. 在第10天，在每口井中轻轻地进行7-9次移液器细胞培养，以分解细胞群，计算可行细胞的数量，并将每口井中的2×105 个细胞转移到96井板（圆形底部），用于HBV特异性CD4 T细胞反应分析。
  7. 继续在第12天培养其余细胞进行表位识别，将培养介质的体积调整到100微升（丢弃过量介质），并补充含有肽（4微克/mL）、IL-2（100 U/mL）和IL-7（20 ng/mL）的新鲜完整培养基培养。
    注:在第7天到第10天，T细胞继续大力增殖。如果介质变黄，则替换培养介质，如第 3.5 步。一般来说，细胞数将超过6×105 在第10天。每口井通常显示相似的细胞数，在 3 口井中计算细胞数，并使用平均值作为所有油井的细胞数估计值。

4. 通过细胞内流动细胞学分析HBV特异性CD4 T细胞反应

  1. 刺激带肽池的 PBMC
    1. 对于转移到96井板（圆底）的细胞，在一个盘子中洗3次（550×克，3分钟）。每次洗涤使用 200 μL 介质（前 2 次洗涤使用 RPMI 1640，最后一次洗涤使用完整的培养介质）。丢弃超强的。
      注:通过反复清洗去除培养物中的残余细胞因子，可以有效减少细胞内流动细胞学分析的背景。
    2. 对于每口用特定肽池刺激的细胞，加入 200 μL 的完整培养介质，辅以相同的肽池（每种肽 2 μg/mL）。对于背景控制井，添加完整的培养介质，辅以 1 μL/mL 的 DMSO。对于正控井，添加完整的培养基，辅以 1 μL/mL 的 DMSO、150 ng/mL 的磷 12-肌酸酯 （PMA） 和 1 μmol/L 的离子霉素。
      注:高剂量的DMSO将阻止T细胞的细胞因子分泌（对TNF-α最为重要）。不建议剂量高于 5 μL/mL 的 DMSO。一般来说，我们实验中的 DMSO 剂量不超过 1 μL/mL。
    3. 在 37 °C 和 5% CO2 6 h 下孵育。
    4. 孵化1小时后，在培养中加入莫嫩辛（1.37微克/兆升）。
  2. 流细胞学
    1. 经过6小时的孵化。离心后取出超高纳坦（550 × 克，3 分钟），用 200 μL 的 DPBS（550 × g，3 分钟）、污渍表面标记（CD3、CD4 和 CD8）和可行性标记（使用可修复可行性染料）在 4 °C 冰箱中清洗细胞一次，持续 30 分钟。
    2. 用 200 μL 的 DPBS 洗一次（550 ×克，3 分钟）。固定和渗透细胞，并在4°C冰箱中染色细胞因子（TNF-α和IFN-γ），持续45分钟。
    3. 在细胞内染色的最后清洗后，在 150 μL 的流动细胞学缓冲区 （DPBS = 0.5% BSA） 中重新悬浮细胞。
    4. 获取流细胞计的流细胞学数据。
  3. 流细胞学结果分析
    1. 正井的定义:如果细胞因子分泌T细胞的频率至少是背景控制井的两倍（图1），请考虑一个正阳性。
    2. 根据以下公式，计算每个细胞因子分析的响应率（图2）:
      figure-protocol-1
      注:矩阵中的排肽池和柱肽池代表HBV核心抗原的2种不同形态，因此最终响应率应除以2。

5. 识别HBV特异性HLA-DR受限CD4 T细胞表位

  1. 在T-75烧瓶（5-20×106 细胞，20ml的完整培养介质）中解冻并保持致病性B淋巴细胞细胞系（BLCL）。
    注:为了保证BLCL的良好状态，这一步骤应在患者PBMC解冻前2周启动。根据基因型结果，患者应与 BLCL 共享相同的 HLA-DRB1 等位基因。
  2. 筛选候选肽以进行鉴定 （图3）
    1. 根据第 10 天的 T 细胞响应率结果，筛选出 2 个响应率最高的肽池（1 排肽池和 1 列肽池）。
    2. 如果含有这种肽的其他肽池在T细胞反应分析中也显示积极结果，则将这两个池中的肽设置为候选肽。使用与其他肽池一起扩展的 PBMC 进行表位识别。
  3. 用肽脉动 BLCL
    1. 在第12天，计算可行BLCL的数量，将细胞转移到15mL离心机管，离心机（350×克，10分钟），并取出超高纳特。将细胞颗粒重新用于完整的培养基介质，将 6quot BLCL 重新放到 96 井板（圆形底部），在 4×104 细胞/井中恢复 80 μL 完整培养介质。
    2. 加入单肽（10 μg/mL），在37 °C和5%CO2 2 2h下孵育。设置 2 背景控制:肽与 HLA-DR 阻滞脉动（预处理与抗 HLA-DR （10 μg/mL） 为 1 小时）;DMSO （1 μL/mL） 脉动。每口井中完整培养介质的最终体积为 100 μL。
    3. 加入米霉素 C （100 μg/mL），在 37 °C 和 5% CO2 下孵育 1 小时。
    4. 用 200 μL 的 RPMI 1640 （550 × g， 3 分钟） 在盘子中洗 3 次，去除未脉冲肽和粒霉素 C。对于第一次洗涤，补充孵化培养与100微升的RPMI 1640。
    5. 在 120 μL 的完整培养介质中重新悬念细胞。
  4. 刺激PCMCs与肽脉冲BLCL。
    1. 在第 12 天，将 PBMC 转移到 96 井板（圆形底部）。
    2. 在盘子中取出离心后的超高离心剂（550 × 克，3 分钟），用 200 μL 的 RPMI 1640 （550 × g， 3 分钟）洗两次。
      注:通过反复清洗去除培养物中的残余细胞因子和肽是减少细胞内流动细胞学分析背景的关键步骤。特别是对于残留肽，它会与BLCL结合，并显著增加背景。
    3. 每口井的重复 PC 具有 210 μL 的完整文化介质。
    4. 对于选择表位识别的 PBMC 油井，将阿利库特（每口 70 μL）与肽脉冲 BLCL（3 口井，包括 2 个背景控制）混合。
      注:在第12天，扩大的多肽池数量通常会达到每口油井5-7×105 以上，因此全氟辛基酚/BLCL的比例约为6/1至4/1。
    5. 在 37 °C 和 5% CO2 6 h 下孵育。
    6. 孵化1小时后，在培养中加入莫嫩辛（1.37微克/兆升）。每口井中完整培养介质的最终体积为 200 μL。
  5. 流细胞学
    1. 重复与第 4.2 步相同的操作。
  6. 流细胞学结果分析
    1. 如果用这种肽脉冲 BLC 孵育的 PBMC 显示细胞因子分泌 CD4 T 细胞的频率至少是使用背景控制孵育的 PBMC 的两倍（肽与 HLA-DR 预阻塞一起脉动;则验证肽为 HLA-DR 受限 CD4 T 细胞的表位DMSO脉动） （图4）。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞因子分泌CD4 T细胞的频率计算为单个生产者和双生产者的总和。 图1显示，TNF-α分泌CD4 T细胞的频率和IFN-γ在背景控制（DMSO）中分泌CD4 T细胞的频率分别为0.154%和0.013%。TNF-α分泌CD4 T细胞的频率和IFN-γ分泌CD4 T细胞的频率分别为0.206和0.017，因此TNF-α分泌CD4 T细胞反应和IFN-γ分泌CD4 T细胞反应的频率均为负数。TNF-α分泌CD4 T细胞的频率和IFN-γ分泌CD4 T细胞的频率分别为2.715%和0.973%，因此TNF-α分泌CD4 T细胞反应和IFN-γ分泌CD4 T细胞反应均被认为是阳性的。

图 2所示，正井呈灰色背景。在计算 HBV 特定 TNF-α分泌 CD4 T 细胞响应速率时，应包括肽池 Core01、Core02、Core04、Core05、Core06、Core07、Core08、Core09 和 Core10 的数据。在计算 HBV 特定 IFN-γ分泌 CD4 ...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本协议中最关键的步骤如下: 1） 足够高生存能力的 PBMC 开始 PC 扩展:2） 适当的 PBMC 扩展环境;3） 在表位识别之前，完全去除 PBMC 培养中的残留肽池。

此协议中的所有分析都取决于 CD4 T 细胞的强劲增殖。一般来说，10天扩展后的PC数量将是初始数量的2-3倍。PBMC 的细胞数和生存能力是 PBMC 扩展的两个关键因素。如果目的只是分析HBV特异性CD4 T细胞而没有表位识别，则合理减少初始PC数量，尤其是在血液样本量有限的情况下。虽然，根据我们的经验，如果 PBMC 的启动数量低于 1.5 × 10 5 个单元格/井，则几乎无法获得成功的 PBMC 扩展。使用新的 PBMC 进行扩展时，电池的生存能力不会成为问题。在使用冷冻保存的 PBMC 进行扩展时，应非常小心地进行 PBMC 的低温保存和解冻，以保持 PBMC 的生存能力。

在HBV特异性T细胞的功能分析中，IL-12通常用于PCMCs的扩展，以提高CD8 T细胞的功能。由于IL-12可诱导CD4 T细胞向CD4 T卵泡...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了中国国家自然科学基金（81930061）、重庆市自然科学基金（cstc2019jy-bshX0039、cstc2019jcyj-zdxmX0004）和中国钥匙的支持
传染病专科项目（2018ZX10723203）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
白蛋白牛 V （BSA）BeyotimeST023
APC 偶联的抗人 TNF-&α;eBioscience17-7349-82避光保存
Benzonase 核酸酶Sigma-AldrichE1014限制细胞聚集
B 淋巴母细胞样细胞系 （BLCLs）HUTCHINSON 癌症研究中心HLA-DRB1*0803 纯合子
B 淋巴母细胞样细胞系 （BLCLs）FRED HUTCHINSON 癌症研究中心HLA-DRB1*1202 纯合子
细胞培养瓶 （T75）康宁430641
细胞培养板（96 孔，平底）康宁3599平底
细胞培养板（96 孔，圆底）康宁3799圆底
细胞过滤器康宁CLS43175170 μm，白色，无菌
离心管 （15 mL）KIRGENKG2611无菌
离心管 （50 mL）康宁430829无菌
离心机，Eppendorf5804R
离心机， ThermoST16R
离心机，Legend Micro 21R
冷冻离心机Cytofix/Cytoperm 试剂盒（转录因子缓冲液套装）BD Biosciences 562574使用前准备溶液
二甲基亚砜 （DMSO）Sigma-AldrichD2650在室温下保存以防止结晶
Dulbecco'磷酸盐缓冲盐水制备含有 NaCl （8000 mg）、KCl （200 mg）、KH2PO4 （200 mg） 和 Na2HPO4.7H2O （2160  mg） 的 ddH2O （1000 ml）。将 PH 调整为 7.4。通过高压灭菌器灭菌。
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-03
滤芯吸头 （0.5-10）KirgenKG5131无菌
滤嘴 （100-1000）KirgenKG5333无菌
滤嘴 （1-200）KirgenKG5233无菌
FITC 偶联抗人 CD4BioLegend300506避光保存
可固定活力染料 eFluor780eBioscience65-0865-14避光
GolgiStop 蛋白转运抑制剂（含莫能菌素）BD Biosciences554724蛋白转运抑制剂
血细胞计数器品牌718620
HBV 核心抗原衍生肽中国肽
HEPESGibco15630080100 ml
人血清 ABGemini Bio-Products100-51100 ml
离子霉素Sigma-AldrichI0634
KClSangon BiotechA100395-0500
KH 2 PO 4Sangon BiotechA100781-0500
LSR流式细胞仪BD
L-谷氨酰胺Gibco25030081100 ml
微量离心管 （1.5 mL）康宁MCT-150-C前进行高压灭菌
Scientific IndustriesMicroPlate Genie
丝裂霉素 C罗氏10107409001
Na 2 HPO4.7H 2 OSangon BiotechA100348-0500
NaClSangon BiotechA100241-0500
PCR 管 （0.2 mL）KirgenKG2331
PE/Cy7 偶联的抗人 CD8BioLegend300914保护
PE 偶联的抗人 IFN-γ 的影响;eBioscience12-7319-42避光保存
青霉素 链霉素Gibco15140122100 ml
PerCP-Cy5.5 偶联抗人 CD3eBioscience45-0037-42避光
佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯 （PMA）Sigma-AldrichP1585
重组人 IL-2PeproTech200-02
重组人 IL-7PeproTech200-07
RPMI 培养基 1640GibcoC11875500BT500 ml
丙酮酸钠，100mMGibco15360070
台盼蓝染色剂 （0.4%）Gibco15250-061
超叶纯化抗人 HLA-DRBioLegend307648
Wizard 基因组 DNA纯化套件PromegaA1125
FRED IHW09126 IHW09121 孔径 冷冻冷冻 Thermo 保存 使用微孔板振荡器免受 保存

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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CD4 T HLA DR Ficoll

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