基于乙型肝炎病毒（HBV）衍生的肽阵列，可同时评估HBV特异性的CD4 T细胞应答并鉴定HBV特异性的CD4 T细胞表位。
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摘要
摘要
CD4 T细胞在慢性乙型肝炎的发病机制中发挥重要作用。作为一种多功能的细胞群体，CD4 T细胞可根据其分泌的细胞因子被划分为不同的功能亚群：例如，CD4辅助性T细胞1（Th1）分泌IFN-γ，CD4辅助性T细胞2（Th2）分泌IL-4和IL-13，CD4滤泡辅助性T细胞（Tfh）分泌IL-21，CD4辅助性T细胞17（Th17）分泌IL-17。通过乙型肝炎病毒（HBV）来源的多肽刺激后，基于细胞因子分泌情况分析HBV特异性CD4 T细胞，不仅可以了解HBV特异性CD4 T细胞应答的强度，还能揭示其功能亚群特征。一些新兴方法，如转录组学和代谢组学分析，可进一步提供关于HBV特异性CD4 T细胞的更详细功能信息。这些方法通常需要利用多肽-主要组织相容性复合物II类（MHC-II）多聚体来分离具有活性的HBV特异性CD4 T细胞，但目前关于HBV特异性CD4 T细胞表位的信息仍较为有限。基于一种HBV来源的多肽矩阵，已建立一种方法，可同时利用慢性HBV感染患者的外周血单个核细胞样本评估HBV特异性CD4 T细胞应答并鉴定HBV特异性CD4 T细胞表位。
引言
目前，分析抗原特异性T细胞主要有三种方法。第一种方法基于T细胞受体与肽段（表位）之间的相互作用。抗原特异性T细胞可直接使用肽段-主要组织相容性复合物（MHC）多聚体进行染色。该方法的优点是能够获得有活力的抗原特异性T细胞，适用于后续的转录组学/代谢组学分析。该方法的局限性在于无法提供针对特定抗原的完整T细胞应答信息，因为它依赖于已验证的表位肽段，而目前针对特定抗原所鉴定出的表位数量仍然有限。与乙型肝炎病毒（HBV）特异性的CD8 T细胞表位相比，目前已鉴定的HBV特异性CD4 T细胞表位较少1,2，因此该方法目前在分析HBV特异性CD4 T细胞方面应用受限。
第二种方法基于抗原肽刺激后一系列活化诱导标志物的上调3。常用的标志物包括CD69、CD25、OX40、CD40L、PD-L1、4-1BB4。目前该方法已用于分析疫苗接种个体5,6、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染患者7以及严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染患者8,9中的抗原特异性T细胞应答。与基于肽-MHC多聚体的检测方法不同，该方法不受已验证表位的限制，并可获得可用于下游分析的活细胞。该方法的一个局限性在于无法提供抗原特异性T细胞的细胞因子谱信息。此外，某些非抗原特异性的活化细胞也可能表达这些活化诱导标志物，从而在分析中产生背景信号，尤其当目标抗原特异性T细胞较为稀少时，这一问题更为突出。目前，该方法在乙型肝炎病毒（HBV）特异性CD4 T细胞中的应用仍较为有限4。该方法是否能够可靠地用于分析HBV特异性CD4 T细胞，仍有待进一步研究。
第三种方法基于抗原肽刺激后细胞因子的分泌。与基于活化诱导标志物的分析方法类似，该方法不受已验证表位的限制。此方法可直接揭示抗原特异性T细胞的细胞因子谱型。该方法的灵敏度低于基于活化诱导标志物的方法，因其依赖于抗原特异性T细胞分泌的细胞因子，且通常检测的细胞因子种类有限。目前，该方法已广泛应用于乙型肝炎病毒（HBV）特异性T细胞的分析。由于通过直接体外肽段刺激几乎无法检测到分泌细胞因子的HBV特异性T细胞10,11，因此通常在体外经肽段刺激扩增10天后，再分析HBV特异性T细胞的细胞因子谱型12,13,14,15,16。采用矩阵形式排列肽库已被用于促进抗原特异性表位的鉴定17,18。结合肽库矩阵与细胞因子分泌分析，已建立一种可同时评估HBV特异性CD4 T细胞应答并鉴定HBV特异性CD4 T细胞表位的方法16。本方案详细描述了该方法的操作流程，并以HBV核心抗原作为示例进行演示。
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方案
已获得参与本研究的每位患者的书面知情同意。本研究方案遵循1975年《赫尔辛基宣言》的伦理准则，并已事先获得西南医院医学伦理委员会的批准。
1. HBV来源的肽阵列设计
- 从NCBI数据库下载乙型肝炎病毒（HBV）核心抗原的氨基酸序列（GenBank: AFY98989.1）。
- 从多肽合成服务供应商处购买HBV核心抗原衍生的多肽（一组包含35条15-mer多肽，每条多肽与相邻多肽重叠10个氨基酸残基，纯度>90%，每条多肽4 mg）。
- 建立一个6×6的方形多肽矩阵，矩阵中每个位置仅包含1条多肽。共形成12个多肽混合池：6个行多肽池和6个列多肽池，每个池中含有5-6条多肽16。矩阵中的行多肽池和列多肽池代表HBV核心抗原的两种独立组合形式。
- 将所购多肽中约3/4的部分，按照矩阵中的同一行或同一列，分别混合成12个独立的多肽混合池，通过将每条多肽共同溶解于二甲基亚砜（DMSO）中实现（每条多肽浓度为2 µg/µL）。储存于-80 °C，用于分析HBV特异性CD4 T细胞应答。
- 将剩余的多肽分别单独溶解（浓度为10 µg/µL），储存于-80 °C，用于表位鉴定。
2. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离
- 从慢性 HBV 感染患者中采集 5 mL 静脉血。
注意：血液体积应根据肽库数量，外加 1 个背景对照和 1 个阳性对照，进行粗略估算。分析 1 个肽库需要 3 × 105 个 PBMCs。平均而言，每 1 mL 血液可获得 1 × 106 个 PBMCs。 - 采用 Ficoll 密度梯度离心法（800 × g，20 分钟）从血液中分离 PBMCs，并将分离得到的 PBMCs 冻存于液氮中以备后续使用。
- 使用巴斯德吸管收集透明 Ficoll 层与红细胞层之间的粒细胞。根据试剂盒生产商的说明书，使用基因组 DNA 纯化试剂盒从粒细胞中提取基因组 DNA。
- 将 DNA 样本送至基因分型服务提供商，以确定 HLA-DRB1 基因型。
3. 使用 HBV 肽矩阵体外扩增 PBMC
- 解冻PBMCs。
- 预热 RPMI 1640 培养基，添加 1:10,000 的苯并核酸酶（25 U/mL） 37 °C 在水浴中。
注意：苯并核酸酶有助于在解冻过程中减少细胞聚团。每个样本需要 20 mL 含苯并核酸酶的 RPMI 1640 培养基。计算解冻所有样本所需的培养基总量，并单独分装一份培养基37 °C) 加入1:10,000的Benzonase（25 U/mL）。每次解冻样品不超过5个。 - 从液氮中取出样品，并在水浴中快速解冻冻存管（37 °C).
- 将解冻的细胞悬液转移至15 mL离心管中。加入1 mL Benzonase RPMI 1640（37 °C）逐滴加入管中。缓慢加入6 mL Benzonase RPMI 1640（37 °C) 加入离心管中，用另外 2 mL Benzonase RPMI 1640 冲洗冻存管37 °C) 以收集所有细胞。尽快对剩余样品进行相同操作。
注意：缓慢稀释冻存样品是保持解冻后细胞活力的关键。 - 离心（400 × g，10 分钟），弃去上清液，轻敲离心管使沉淀松散。
- 轻轻将沉淀重悬于1 mL温热的Benzonase RPMI 1640培养基中，轻柔混匀，随后将细胞通过滤膜过滤 70 µm 如有需要（即存在可见的团块时），使用细胞筛。
- 分装一份 10 µL 悬浮后用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释，加入台盼蓝（0.04%），加载至血细胞计数板，静置1分钟，计数活细胞数量（未染色细胞）。
- 加入9 mL Benzonase RPMI 1640（37 °C将样品加入离心管中，离心（400 × g，10 分钟），弃去上清液，通过轻敲管壁使沉淀松散。
- 预热 RPMI 1640 培养基，添加 1:10,000 的苯并核酸酶（25 U/mL） 37 °C 在水浴中。
- 用含 25 mM HEPES、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、100 U/mL 青霉素的 RPMI 1640 培养基重悬 PBMC 100 μg/mL 链霉素和10%人AB血清（完全培养基）。调整细胞密度至1.5 × 106 细胞/mL。将PBMC以3 × 10⁵个细胞/孔的密度接种于96孔板（平底）中。5 细胞/孔
- 加入HBV来源的肽段混合物（2 μg/mL 每个单肽分别加入到各孔中。对于背景对照孔和阳性对照孔，加入等量的溶剂（DMSO， 1 μL/mL。加入10 U/mL IL-2和10 ng/mL IL-7。于 37 °C 和5% CO2.
- 第3天，向培养基中添加50 U/mL的IL-2和10 ng/mL的IL-7。
注意：在第1天至第3天期间，不会观察到明显的T细胞增殖。由于B细胞、NK细胞、NKT细胞和单核细胞等非T细胞的死亡，总细胞数量通常会减少1/3至1/2。 - 第7天，用含有肽的新鲜培养基替换一半的培养基4 μg/mL），IL-2（100 U/mL）和IL-7（20 ng/mL）。
注意：为避免扰动底部的细胞，应使用移液器轻轻操作，移取约 90 μL 从培养基顶部小心吸出培养基。在第3天至第7天期间，可观察到T细胞显著增殖，增殖的T细胞通常聚集形成细胞簇。 - 第10天，轻轻吹打每孔细胞培养物7–9次以分散细胞团，计数活细胞数量，并将2×10⁶个细胞5 将每个孔中的细胞加入96孔圆底培养板，用于乙型肝炎病毒特异性CD4 T细胞反应分析。
- 继续培养其余细胞至第12天用于表位鉴定，调整培养基体积至 100 μL （弃去过多的培养基），并向培养物中补充 100 μL 含肽的新鲜完全培养基4 μg/mL），IL-2（100 U/mL）和 IL-7（20 ng/mL）。
注意：第7天至第10天期间，T细胞将持续旺盛增殖。若培养基变黄，则按步骤3.5更换培养基。通常情况下，细胞数量将超过6×105 第10天时，每个孔的细胞数量通常相近，在3个孔中计数细胞数量，并取平均值作为所有孔细胞数量的估计值。
4. 通过胞内流式细胞术分析 HBV 特异性 CD4 T 细胞应答
- 使用肽库刺激PBMCs
- 将细胞转移至96孔板（圆底），在板中用550 × g离心3分钟，洗涤3次。每次洗涤使用200 µL培养基（前两次使用RPMI 1640培养基，最后一次使用完全培养基）。弃去上清液。
注意：通过反复洗涤去除培养物中残留的细胞因子，可有效降低胞内流式细胞术分析的背景信号。 - 对于用特定肽库刺激的每孔细胞，加入200 µL完全培养基，并补充相应的肽库（每种单一肽浓度为2 µg/mL）。对于背景对照孔，加入含1 µL/mL DMSO的完全培养基。对于阳性对照孔，加入含1 µL/mL DMSO、150 ng/mL佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）和1 µmol/L离子霉素的完全培养基。
注意：高浓度DMSO会抑制T细胞的细胞因子分泌（对TNF-α影响最显著）。不建议使用超过5 µL/mL的DMSO。通常，本实验中DMSO的用量不超过1 µL/mL。 - 在37 °C、5% CO2条件下孵育6小时。
- 孵育1小时后，向培养物中加入莫能菌素（终浓度1.37 µg/mL）。
- 将细胞转移至96孔板（圆底），在板中用550 × g离心3分钟，洗涤3次。每次洗涤使用200 µL培养基（前两次使用RPMI 1640培养基，最后一次使用完全培养基）。弃去上清液。
- 流式细胞术检测
- 孵育6小时后，离心（550 × g，3分钟）弃去上清液，用200 µL DPBS洗涤细胞一次（550 × g，3分钟），然后在4 °C冰箱中孵育30分钟，进行表面标志物（CD3、CD4和CD8）及活率标志物（使用可固定活力染料）染色。
- 用200 µL DPBS洗涤一次（550 × g，3分钟）。固定并透化细胞，在4 °C冰箱中孵育45分钟，进行胞内细胞因子（TNF-α和IFN-γ）染色。
- 完成胞内染色后的最终洗涤步骤后，将细胞重悬于150 µL流式细胞术缓冲液（DPBS + 0.5% BSA）中。
- 在流式细胞仪上获取数据。
- 流式细胞术结果分析
- 阳性孔的定义：若某孔中分泌细胞因子的T细胞频率至少为背景对照孔的两倍，则视为阳性孔（图1）。
- 根据以下公式计算每种分析细胞因子的反应率（图2）：
注意：矩阵中的行肽库和列肽库代表两种不同的HBV核心抗原组合形式，因此最终反应率应除以2。
5. HBV特异性HLA-DR限制性CD4 T细胞表位的鉴定
- 解冻并维持同种异体B淋巴母细胞样细胞系（BLCLs）在T-75培养瓶中的生长（5-20 ×106 个细胞，20 mL完全培养基）。
注意：为确保BLCLs处于良好状态，应在解冻患者外周血单个核细胞（PBMCs）前2周开始此步骤。BLCLs在HLA-DRB1等位基因上必须为纯合子。根据基因分型结果，患者应与BLCLs共享相同的HLA-DRB1等位基因。 - 候选肽段的筛选以进行表位鉴定（图3）
- 根据第10天T细胞反应率的结果，筛选出反应率最高的2个肽段混合物（1个行肽段池和1个列肽段池）。
- 若某肽段所在的另一个肽段池在T细胞反应分析中也呈阳性，则将该肽段列为候选肽段。后续使用由另一个肽段池扩增的PBMCs进行表位鉴定。
- 用肽段致敏BLCLs
- 在第12天，计数活BLCLs数量，将细胞转移至15 mL离心管中，离心（350 × g，10分钟），弃上清。用完全培养基重悬细胞沉淀，并将BLCLs以每孔4×104 个细胞、80 µL完全培养基的体积分装至96孔圆底培养板中。
- 加入单一肽段（10 µg/mL），在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。设置2个背景对照：使用HLA-DR阻断剂进行肽段致敏（预先用抗HLA-DR抗体处理1小时，浓度为10 µg/mL）；DMSO（1 µL/mL）致敏。每孔完全培养基的终体积为100 µL。
- 加入丝裂霉素C（100 µg/mL），在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。
- 在培养板中用200 µL RPMI 1640洗涤3次（550 × g，3分钟），以去除未结合的肽段和丝裂霉素C。第一次洗涤时，在培养体系中补充100 µL RPMI 1640。
- 用120 µL完全培养基重悬细胞。
- 用致敏BLCLs刺激PBMCs
- 在第12天，将PBMCs转移至96孔圆底培养板中。
- 在培养板中离心（550 × g，3分钟）后弃上清，并用200 µL RPMI 1640在板内洗涤两次（550 × g，3分钟）。
注意：通过反复洗涤去除培养基中残留的细胞因子和肽段，是降低胞内流式细胞术分析背景信号的关键步骤。特别是残留肽段会与BLCLs结合，显著增加背景信号。 - 每孔用210 µL完全培养基重悬PBMCs。
- 对于用于表位鉴定的PBMCs孔，将分装的PBMCs（每份70 µL）与致敏BLCLs混合（共3孔，包括2个背景对照孔）。
注意：在第12天，经肽段池扩增的PBMCs数量通常可达每孔5-7×105以上，因此PBMCs与BLCLs的比例约为6:1至4:1。 - 在37 °C、5% CO2条件下孵育6小时。
- 孵育1小时后，向培养体系中加入莫能菌素（Monensin，1.37 µg/mL）。每孔完全培养基的终体积为200 µL。
- 流式细胞术检测
- 重复步骤4.2中的相同操作。
- 流式细胞术结果分析
- 若与致敏BLCLs共孵育的PBMCs中，分泌细胞因子的CD4 T细胞频率至少是背景对照组（即经HLA-DR预阻断或DMSO致敏的BLCLs）的两倍，则可确认该肽段为HLA-DR限制性的CD4 T细胞表位（图4）。
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结果
分泌细胞因子的CD4 T细胞频率计算为单分泌细胞和双分泌细胞之和。如图1所示，背景对照（DMSO）中分泌TNF-α的CD4 T细胞频率和分泌IFN-γ的CD4 T细胞频率分别为0.154%和0.013%。针对Core11肽库特异性的分泌TNF-α的CD4 T细胞频率和分泌IFN-γ的CD4 T细胞频率分别为0.206%和0.017%，因此该肽库诱导的TNF-α分泌型CD4 T细胞反应和IFN-γ分泌型CD4 T细胞反应均被判定为阴性。针对Core09肽库特异性的分泌TNF-α的CD4 T细胞频率和分泌IFN-γ的CD4 T细胞频率分别为2.715%和0.973%，因此该肽库诱导的TNF-α分泌型CD4 T细胞反应和IFN-γ分泌型CD4 T细胞反应均被判定为阳性。
如图2所示，阳性孔以灰色背景表示。在计算乙型肝炎病毒（HBV）核心特异性TNF-α分泌型CD4 T细胞反应率时，应纳入肽库Core01、Core02、Core04、Core05、Core06、Core0...
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讨论
本方案中最关键的步骤如下：1）获取足量且活力高的外周血单个核细胞（PBMC），以启动PBMC扩增；2）为PBMC扩增提供适宜的培养环境；3）在进行表位鉴定前，彻底清除PBMC培养物中残留的肽段混合物。
本方案中的所有分析均依赖于CD4 T细胞的稳健增殖。通常情况下，外周血单个核细胞（PBMC）经过10天扩增后的细胞数量将达到初始数量的2至3倍。细胞数量和PBMC的活力是PBMC扩增过程中的两个关键因素。如果目的仅为分析乙型肝炎病毒（HBV）特异性CD4 T细胞而无需表位鉴定，则可以合理减少初始PBMC数量，尤其是在血样体积有限的情况下。然而，根据我们的经验，若每孔起始PBMC数量低于1.5×105个细胞，则几乎无法实现成功的PBMC扩增。使用新鲜PBMC进行扩增时，细胞活力通常不会成为问题；但在使用冻存PBMC进行扩增时，必须谨慎操作PBMC的冷冻保存与复苏过程，以维持其细胞活力。
在HBV特异性T细胞的功能分析中，通常使用IL-12扩增外周血单个核细胞（PBMCs），以增强CD8 T细胞的功能。由于IL...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（81930061）、重庆市自然科学基金（cstc2019jcyj-bshX0039，cstc2019jcyj-zdxmX0004）和中国国家重点研发计划
传染病防治科技重大专项（2018ZX10723203）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白 V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC标记的抗人TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | 避光保存 |
| 苯并核酸酶（Benzonase Nuclease） | Sigma-Aldrich | E1014 | 防止细胞聚集 |
| B淋巴母细胞系（BLCLs） | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803纯合子 |
| B淋巴母细胞系（BLCLs） | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202纯合子 |
| 细胞培养瓶（T75） | Corning | 430641 | |
| 细胞培养板（96孔，平底） | Corning | 3599 | 平底 |
| 细胞培养板（96孔，圆底） | Corning | 3799 | 圆底 |
| 细胞筛 | Corning | CLS431751 | 孔径70 μm，白色，无菌 |
| 离心管（15 mL） | KIRGEN | KG2611 | 无菌 |
| 离心管（50 mL） | Corning | 430829 | 无菌 |
| 冷冻离心机 | Eppendorf | 5804R | |
| 冷冻离心机 | Thermo | ST16R | |
| 冷冻离心机 | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm试剂盒（转录因子缓冲液套装） | BD Biosciences | 562574 | 使用前配制溶液 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2650 | 室温保存以防止结晶 |
| Dulbecco’s磷酸盐缓冲液 | 配制含NaCl（8000 mg）、KCl（200 mg）、KH2PO4（200 mg）和Na2HPO4·7H2O（2160 mg）的ddH2O（1000 ml）。调节pH至7.4，高压灭菌。 | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| 滤芯吸头（0.5–10） | Kirgen | KG5131 | 无菌 |
| 滤芯吸头（100–1000） | Kirgen | KG5333 | 无菌 |
| 滤芯吸头（1–200） | Kirgen | KG5233 | 无菌 |
| FITC标记的抗人CD4 | BioLegend | 300506 | 避光保存 |
| 可固定的活力染料eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | 避光保存 |
| 高尔基体阻断蛋白转运抑制剂（含莫能菌素） | BD Biosciences | 554724 | 蛋白转运抑制剂 |
| 血细胞计数板 | Brand | 718620 | |
| 乙型肝炎病毒核心抗原衍生肽 | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| 人AB型血清 | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| 离子霉素（Ionomycin） | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa流式细胞仪 | BD | ||
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| 微量离心管（1.5 mL） | Corning | MCT-150-C | 使用前需高压灭菌 |
| 微孔板振荡器 | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| 丝裂霉素C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4·7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR管（0.2 mL） | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7标记的抗人CD8 | BioLegend | 300914 | 避光保存 |
| PE标记的抗人IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | 避光保存 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5标记的抗人CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | 避光保存 |
| 佛波醇12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA） | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| 重组人IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| 重组人IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| 丙酮酸钠（100 mM） | Gibco | 15360070 | |
| 台盼蓝染液（0.4%） | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF纯化的抗人HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard基因组DNA纯化试剂盒 | Promega | A1125 |
参考文献
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