利用超快力钳光谱技术解析行进性肌球蛋白的力-酶特性

摘要

本文介绍了一种针对持续性运动的肌球蛋白-5分子马达进行超快力钳实验的完整方案，该方案可轻松拓展应用于其他类型的持续性分子马达研究。本方案详细描述了从实验装置的搭建、样品制备，到数据采集与分析的全部必要步骤。

摘要

超快力钳光谱技术（UFFCS）是一种基于激光镊子的单分子技术，能够在负载条件下以 unprecedented 的时间分辨率研究传统和非传统肌球蛋白的化学力学特性。特别是，该技术能够在肌动蛋白-肌球蛋白键形成后立即在恒定力条件下探测肌球蛋白马达，结合高速力反馈（200 kHz），已证明 UFFCS 是研究负载依赖性快速动力学（如肌球蛋白工作行程）的有力工具。此外，UFFCS 还可用于研究施加力的强度和方向如何影响过程性和非过程性肌球蛋白-肌动蛋白相互作用。

通过遵循本方案，可对持续性运动的肌球蛋白-5分子马达及多种非常规肌球蛋白进行超快力钳实验。经过适当调整，该方案也可轻松拓展用于研究其他类型的持续性运动马达，如驱动蛋白和动力蛋白。本方案涵盖了从实验装置搭建、样品制备、校准程序到数据采集与分析的全部必要步骤。

引言

近几十年来，由于光镊能够同时操控并测量单个分子的构象变化和酶促动力学，这一技术已成为阐明蛋白质相互作用的力化学机制的有力工具^1,2。特别是，光镊能够施加并测量细胞内分子马达所作用范围内的力，同时具备测量亚纳米级构象变化的能力，使其成为揭示马达蛋白的化学机械特性及其机械调控机制的独特单分子工具。

超快力钳光谱法（UFFCS）是一种基于光镊的单分子力谱技术，采用三珠几何构型（图1a）开发，用于研究分子马达在负载条件下的快速动力学过程^3,4。UFFCS将施加力至马达蛋白的时间延迟减少到光镊的物理极限，即系统的机械弛豫时间，从而可在肌球蛋白运动开始后迅速施加力（几十微秒内）³。该技术已被用于研究快速骨骼肌³和心肌肌球蛋白⁵中的早期机械事件，揭示了动力冲程、弱结合态与强结合态的负载依赖性，以及生化事件（Pi释放）与机械事件（动力冲程）发生的顺序。

三珠几何结构通常用于研究非过程性马达分子，而单珠几何结构结合力钳技术则常用于研究如肌球蛋白Va等过程性非常规肌球蛋白⁶。然而，对于过程性肌球蛋白，也有若干理由更倾向于采用三珠UFFCS检测方法。首先，在肌动蛋白与肌球蛋白结合后立即施加负载，可实现对力生成早期事件的测量，这一点与非过程性马达分子类似。此外，在过程性马达分子的情况下，该方法还能在恒定负载条件下精确测量马达在整个运动过程中的运行长度和持续时间（图1b）。再者，由于力反馈速率较高，系统可在位置快速变化期间（例如肌球蛋白的工作冲程）保持力的恒定，从而确保马达步进过程中负载的稳定性。系统的高时间分辨率使得亚毫秒级相互作用得以检测，为研究肌球蛋白与肌动蛋白之间的弱结合提供了可能。最后，该检测构型可确保力沿肌动蛋白丝方向施加，力的横向和垂直分量可忽略不计。这一点尤为重要，因为已有研究表明，垂直方向的力分量会显著影响马达动力学的负载依赖性^7,8。通过使用该技术，我们能够对过程性肌球蛋白-5B施加一系列辅助性和抵抗性负载，并直接测量其在广泛力范围内的过程性负载依赖性⁴。

如图1a所示，在该系统中，一条肌动蛋白丝被悬挂在双光镊捕获的两个聚苯乙烯小球之间（即"哑铃"结构）。通过快速反馈系统，对肌动蛋白丝施加一个不平衡的净力 F = F₁ - F₂，使肌动蛋白丝以恒定速度单向移动，直至到达用户定义的反转点，此时净力方向反转。当马达蛋白未与肌动蛋白丝相互作用时，哑铃结构可在底座小球（其上附着单个马达蛋白）范围内自由地以三角波形式来回移动（图1b，底部图示）。一旦马达蛋白与肌动蛋白丝发生相互作用，哑铃所承受的力便迅速传递至马达蛋白，马达随即在相互作用时刻反馈系统所施加的力的大小和方向下，通过步进行动推动肌动蛋白丝移动，直至肌球蛋白从肌动蛋白上解离。由于马达步进所产生的位移依赖于被捕获肌动蛋白丝的极性，根据所施加力的方向，负载可表现为辅助性（即与马达位移方向一致，推动马达前进，见图1b上部图示中的“push”），或表现为抵抗性（即与马达位移方向相反，阻碍马达前进，见图1b上部图示中的“pull”），从而可研究施加负载的强度和方向性对马达过程性化学机械调控的影响。

在接下来的章节中，将全面描述使用超快力钳光谱技术在不同负载条件下测量肌动蛋白-肌球蛋白-5B 相互作用的所有步骤，包括：1）光学装置的搭建、光阱的对准与校准程序；2）所有组分的制备及其在样品腔中的组装；3）测量过程；4）代表性数据及数据分析，以提取重要的物理参数，例如马达蛋白的运行长度、步长和速度。

方案

1. 光学装置

注意：实验装置由具有纳米级指向稳定性和<1% 激光强度波动的双光镊组成。在典型捕获刚度（0.1 pN/nm）和张力（1 pN 至数十 pN）条件下，可确保哑铃状微粒达到纳米级稳定性。图2展示了光学装置的详细示意图。

1. 光镊的设计与构建 ^9,10,11。
   1. 根据图2所示的示意图，将实验装置的所有组件放置在光学平台上。请注意，光学平台配备有主动隔振装置，以最大限度减少机械振动。此外，显微镜结构安装在弹性隔振器上，以吸收声学噪声和机械共振。
   2. 在激光源附近插入一个光学隔离器（图2中的“OI”），以避免由于光反馈引起的随机振幅波动。
   3. 将整个光路密封在一个封闭箱体内，以减少可能影响激光指向稳定性的气流和湍流。
   4. 通过使用偏振分束器（PBS），将主激光源（Nd:YAG激光器，波长1,064 nm，见图2）分成两条具有正交偏振的光路，从而构建双光镊系统。应避免使用时间共享光阱，因为它们会在张力作用下引起哑铃状结构的振荡¹²。
   5. 使用两个声光偏转器（图2中的AOD）并由直接数字频率合成器（DDS）驱动，以实现对两个光阱的精细且快速移动，并通过现场可编程门阵列（FPGA）板的数字输出直接控制DDS，从而精确调节肌动蛋白张力（见图2）。
      ​注意：整体反馈响应时间必须<10 µs，以便在测量过程中（包括未结合状态、肌球蛋白相互作用和运动）快速校正并保持两个光阱上的力恒定。为此，位置探测器必须具有>= 100 kHz的带宽，数据采集速率必须达到>= 200 kHz。对于每个采集的数据点（5 µs采集时间），FPGA会计算两个光阱的比例校正值，并发送至驱动AOD的两个DDS。AOD的响应时间必须低于5 µs，以满足所需的反馈响应时间。
   6. 为了实现对被捕获微珠位置的纳米级检测，将两个四象限光电二极管探测器（图2中的QPD）置于聚光镜的后焦平面上。精确地将QPD对准与聚光镜后焦平面共轭的平面，以及将AOD对准与物镜后焦平面共轭的平面，可确保QPD信号不受AOD频率的影响。
   7. 将AOD安装在带有微米驱动的线性平移台上，并移动平移台，直到晶体边缘接近激光束。然后，用一个中心位于螺纹物镜座上的光阑替换物镜，并调节其孔径以匹配物镜后孔径的尺寸。
   8. 将平移台向激光束方向移动，直到被压电晶体遮挡的部分光束在光阑后可见；然后将平移台略微向后转动，使光束再次完全充满光阑孔径。
   9. 对第二个AOD重复步骤1.1.7–1.1.8。通过快速移动粘附在盖玻片表面的微珠上的光束并测量QPD的滞后时间，检查反馈回路的响应时间¹³。
      ​注意：上述三个步骤（1.1.7–1.1.9）实现了AOD晶体的精细对准。这些步骤对于优化光束偏转和反馈的时间响应至关重要¹³。
2. 使用光电二极管测量显微镜入口处捕获激光的强度波动，其波动必须低于1%。请注意，光电二极管的带宽必须大于成像速率。
3. 检查两个光阱的指向稳定性。
   1. 通过将20 µL二氧化硅微珠（1.2 µm，10%固含量）稀释于1 mL丙酮中，超声处理30秒，短暂涡旋混合，并在19,000 x g下离心2分钟，制备磷酸盐缓冲液（PB）中的二氧化硅微珠。
   2. 去除上清液，用1 mL丙酮重悬，并重复洗涤一次。再用1 mL 50 mM PB重悬，洗涤两次。最后用100 µL 50 mM PB重悬。
   3. 使用双面胶带（厚度约60 µm）将盖玻片粘附在显微镜载玻片上，构建一个流动室，进行二氧化硅微珠的光镊校准。向室内注入1 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液，静置3分钟。
   4. 将二氧化硅微珠在PB中的1:1000稀释液注入流动室。使用填充了硅脂的注射器小心密封流动室。在每个光阱中捕获单个微珠，并应用功率谱方法¹⁴进行校准。
   5. 通过将20 µL二氧化硅微珠（直径1.2 µm，10%固含量）溶解于1–1.5 mL丙酮中，在戊酸戊酯（室温）中制备二氧化硅微珠，涡旋混合并超声处理30秒。
   6. 在18,500 x g下离心2分钟。弃去上清液，用1 mL丙酮重悬，重复洗涤一次。再用1 mL戊酸戊酯重悬，并在戊酸戊酯中重复洗涤（离心和重悬）两次。将沉淀物用100 µL 1%硝化纤维素和900 µL戊酸戊酯重悬。4 °C保存2个月。
   7. 取一块24 x 24 mm的玻璃盖玻片，用浸有纯乙醇的纸巾仔细清洁。然后，用洁净的镊子夹持盖玻片，再次直接用纯乙醇冲洗。在温和的氮气流下使其干燥。如有必要，重复此操作以去除玻璃表面所有可见残留物。
   8. 取二氧化硅微珠储备液，涡旋混合并短暂超声处理约30秒。
   9. 清洁另一块盖玻片（24 x 60 mm）后，用其将2 µL二氧化硅微珠溶液涂布在盖玻片的一侧表面，并等待其干燥。
   10. 仔细清洁将用于构建流动室的显微镜载玻片（26 x 76 mm）。
   11. 切割两条双面胶带（宽约3 mm，厚60–100 µm），并将其粘贴在显微镜载玻片的一侧，如图3所示。
   12. 使用洁净的镊子，将已涂覆的盖玻片（1.3.9）与双面胶带接触，封闭流动室（最终体积约20 µL），使硝化纤维素+微珠层朝向流动室内部，如图3a所示。用50 mM磷酸盐缓冲液填充流动室，并用硅脂密封。
   13. 使用电荷耦合器件（CCD）或互补金属氧化物半导体（CMOS）相机（>1.4百万像素），在明场显微镜下以>200倍放大倍数成像单个二氧化硅微珠。使用反馈软件移动压电载物台（纳米级精度或更高），以补偿热漂移¹⁰。
   14. 将左侧光阱的中心与微珠中心重合（QPD的x-y信号水平应与校准值一致）。然后测量该光阱的位置噪声及其位置信号的标准偏差。
   15. 对右侧光阱重复上一步骤¹⁵。
4. 光阱位置校准：MHz 转换为 nm
   1. 制备一个流动室，其中盖玻片表面附着二氧化硅微珠（1.3.5–1.3.12），并含有悬浮的聚苯乙烯微珠（使用如下第2.1节制备的α-辅肌动蛋白偶联微珠）。
   2. 将盖玻片表面的一个二氧化硅微珠聚焦，使其略微偏离视场中心（约5 µm），并采集视场图像。使用压电载物台将微珠向视场中心移动10 µm，并采集第二幅图像。使用质心算法或类似方法计算两幅图像中微珠的中心位置，并计算两微珠之间的像素距离，从而获得明场相机的nm/像素校准系数。
   3. 在一个光阱中捕获单个悬浮微粒。然后，使用AOD以小步长（0.2 MHz）移动光阱，并在每一步采集微粒图像及对应的AOD频率。使用前述质心算法计算微粒在视场中的位置，并利用上一步获得的nm/像素校准系数将其转换为nm。
   4. 对频率-位置数据进行线性拟合，计算校准常数（单位：nm/MHz）。
   5. 对第二个光阱重复校准过程。
5. 光阱功率与刚度校准（MHz 与 W），QPD（MHz 与 pN/nm）
   1. 制备一个流动室，其中盖玻片表面附着二氧化硅微珠（1.3.5–1.3.12），并含有悬浮的聚苯乙烯微珠（使用如下第2.1节制备的α-辅肌动蛋白偶联微珠），并在一个光阱中捕获单个微粒。然后通过AOD以小步长（0.2 MHz）移动两个光阱，并使用QPD记录两个光阱中微粒的布朗运动及其对应的AOD频率。
   2. 计算每个位置探测器上的平均功率，并通过将记录的布朗运动功率谱拟合为洛伦兹函数，获得光阱刚度和QPD校准常数beta¹³。

2. 样品制备

1. 制备α-肌动蛋白结合的荧光微球
   1. 进行偶联¹⁶：取氨基功能化的聚苯乙烯微球（直径1 µm，固含量2.5%），用500 μL蒸馏水洗涤两次，重悬于500 μL PBS（pH 7.0）中。加入1 mM HaloTag琥珀酰亚胺酯O₂配体，在室温下孵育1小时。用500 μL PBS洗涤三次，重悬于100–200 µM HaloTag α-actinin溶液中。37 °C孵育1小时，再用500 μL PBS洗涤三次（微球可在1.5周内使用，或在液氮中速冻后于−80 °C保存）。
   2. 标记：将200 µL微球溶液与终浓度为5 µg/mL的Rhodamine-BSA在室温下孵育10分钟。用50 mM PB洗涤三次，重悬于500 µL 50 mM PB中（可分装后于-80 °C保存数月）。
2. 表达并纯化生物素化的Myosin-5B，方法如前所述^4,17。
3. 聚合并标记F-肌动蛋白¹³：
   1. F-肌动蛋白聚合：将69 µL超纯水、10 µL 10倍肌动蛋白聚合缓冲液（100 mM Tris HCl，20 mM MgCl₂，500 mM KCl，10 mM ATP，50 mM 硫脲碳酸盐，pH 7.5）、20 µL 10 mg/mL G-肌动蛋白和1 µL 1 M DL-二硫苏糖醇（DTT）混合。冰上静置超过1小时。
   2. 用罗丹明标记F-肌动蛋白（激发/发射波长：546/575 nm）：取25 µL已聚合的F-肌动蛋白，加入19.5 µL超纯水、2.5 µL 10倍肌动蛋白聚合缓冲液（100 mM Tris HCl，20 mM MgCl₂，500 mM KCl，10 mM ATP，50 mM 硫脲碳酸盐，pH 7.5）、1 µL 1 M DTT和2 µL 250 µM 罗丹明鬼笔环肽。冰上避光孵育过夜。用于捕获实验时，罗丹明标记的F-肌动蛋白可在冰上保存并在一周内使用。
4. 样品组装
   1. 取流动池（1.3.5–1.3.12），加入1 mg/mL生物素化BSA孵育5分钟。用AB缓冲液（25 mM MOPS，25 mM KCl，4 mM MgCl₂，1 mM EGTA，1 mM DTT，pH 7.2）洗涤后，加入1 mg/mL链霉亲和素孵育5分钟，再次用AB缓冲液洗涤。在M5B缓冲液（10 mM MOPS pH 7.3，0.5 M NaCl，0.1 mM EGTA，3 mM NaN₃）中加入3 nM生物素化的Myosin-5B重酶解肌球蛋白和2 µM钙调蛋白（CaM），孵育5分钟。用三倍体积含2 µM CaM的AB缓冲液配制的1 mg/mL生物素化BSA洗涤，再孵育3分钟。
   2. 在孵育的同时配制反应混合液（RM）：在成像缓冲液（IB：含1.2 µM葡萄糖氧化酶、0.2 µM过氧化氢酶、17 mM葡萄糖、20 mM DTT、2 µM CaM以及实验所需浓度ATP的AB缓冲液）中加入0.005% α-肌动蛋白功能化的微球（第2.1节）和1 nM罗丹明F-肌动蛋白（第2.3节）。
   3. 用RM洗涤流动池，并用硅脂密封。样品现已准备好用于显微镜观察。

3. 测量

1. 组装哑铃结构。
   1. 通过长程平移装置移动样品，寻找悬浮的α-肌动蛋白结合珠，开启一个光镊并捕获其中一个珠子。
   2. 当第一个光镊捕获珠子后，移动平移装置将被捕获的珠子移至接近盖玻片表面的位置，以避免同时捕获多个珠子，随后在第二个光镊中捕获另一个珠子。
   3. 通过调节声光偏转器（AOD）声波的功率，使两个光镊的刚度相等。刚度通常设定在0.03至0.14 pN/nm之间。刚度越小，力噪声越低，特别是在低力条件下。
   4. 然后翻转电动镜M（图2），切换至荧光显微镜模式，并通过长程平移装置移动样品，寻找溶液中悬浮的肌动蛋白丝¹³。优先选择较长的丝（>5 µm），因为过程性肌球蛋白会推动其移动数微米后才解离。
   5. 移动样品，使其中一个被捕获的珠子接近肌动蛋白丝的一端，直至二者结合。然后，将两个珠子之间的距离调整至接近肌动蛋白丝的长度，并通过将载物台向未结合的第二个珠子方向移动，产生一个流动，使肌动蛋白丝被拉伸并最终与第二个珠子结合¹³。这种珠-肌动蛋白-珠复合体称为“哑铃”结构。
2. 建立肌动蛋白-肌球蛋白接触。
   1. 缓慢将两个光镊分开，对肌动蛋白丝预加张力至约3 pN，并通过改变两个AOD中其中一个的频率，使一个光镊以三角波形式振荡，检测哑铃结构的刚性，并通过尾随珠子的位置信号验证运动的传递情况。
   2. 移动载物台，将哑铃结构移近一个固定在表面的二氧化硅微球（基座珠），并通过略微调节被捕获珠子中心的高度至低于二氧化硅珠直径的位置，使肌动蛋白丝与附着在珠表面的蛋白接触。然后将二氧化硅珠的中心置于两个被捕获的珠子之间。
3. 力钳制与纳米级稳定反馈：
   1. 启动超快力钳制模式，设定力为2–3 pN，振荡幅度为200 nm，并以约20–30 nm的离散步长，沿垂直于肌动蛋白丝的方向扫描基座珠。在每个位置等待相互作用发生（数秒），若未观察到相互作用则继续前进。当蛋白-丝相互作用建立后，寻找相互作用最频繁的位置。
   2. 确保当过程性肌球蛋白向肌动蛋白丝的一端（通常为+端）移动时，连接在+端的被捕获珠子朝向二氧化硅珠移动。将载物台向肌动蛋白丝的-端移动，使得在肌球蛋白未结合时，二氧化硅珠尽可能靠近连接在肌动蛋白丝-端的被捕获珠子，并启动纳米级稳定反馈。这样做可最大程度减少连接在肌动蛋白丝+端的被捕获珠子撞击二氧化硅珠的概率。
4. 记录数据。

4. 数据分析⁴

注意：所描述的分析方法可根据哑铃速度的变化（由肌球蛋白步进行为引起）来检测和测量持续性运行及快速步进事件。对持续性运行的分析是基于文献^3,4,13中所述的非持续性马达的数据分析方法进行的。

1. 设定速度变化的阈值，以实现步进事件的检测。由于在此情况下预期存在前向和后向步进，因此允许在两个方向上跨越该阈值。
2. 将每个步进分配至相应的运行过程：如果两个连续步进之间的时间间隔短于 3 ms 且步进幅度 < 90 nm，则将这些步进归为同一运行；否则，将它们归为不同的运行⁴。
3. 根据辅助力对运行长度进行校正⁴。
   1. 通过以下公式计算实际运行长度 RL，对辅助力作用下的运行长度进行校正，其中 <RL_m> 为测得的平均运行长度值，D 为振荡范围：
      
      注：该公式的推导细节可参见文献⁴。

结果

代表性数据包括随时间变化的位置记录，如图所示 图4在位置记录中可观察到两种类型的位移。首先，当肌球蛋白马达未与肌动蛋白丝相互作用时，被捕获的微珠在溶液黏滞拖拽力作用下以恒定速度移动，表现出在线性位移基础上叠加的振荡，该振荡范围由操作者设定，呈三角波形。³ （不可见） 图4 由于时间尺度较长）。其次，一旦肌球蛋白马达与丝状物相互作用，运动丝所携带的力会迅速传递至该蛋白质，系统速度骤降至零（图中红线所示） 图4）且在恒定力作用下持续发生步进事件，直至运行结束。如图所示 图5 力的方向由反馈系统从正向切换到负向（反之亦然），当微珠到达用户设定的振荡范围边缘时，反馈系统即切换施加力的方向。在某些情况下，当肌球蛋白结合并朝正方向移动微丝时，会推动微珠趋向振荡范围的（上）边缘。若此情况发生在辅助力条件下（即力的方向与正向位移一致，推...

讨论

尽管单分子技术（如三珠检测法）在技术上具有挑战性且通量较低，但UFFCS得益于数据的高信噪比，显著提升了分子相互作用的检测能力。UFFCS可用于研究马达蛋白的载荷依赖性，其主要优势在于：当马达与丝状结构结合时，能够迅速施加力，从而探测力产生过程中的早期及极快速事件，以及在受控力条件下的弱结合状态；在整个运动过程中保持力的恒定，并能够完全控制力的方向性，以探究马达蛋白对力的依赖性。关于最后一点，我们在此使用的三珠几何构型在沿丝状结构方向施加和测量力方面非常高效，可最大限度地减少横向或垂直方向分量的干扰。然而，当马达蛋白预期会主动产生横向或垂直方向的力，甚至扭矩时，其他构型（如单珠几何构型）则更为合适^2,7,18。此外，得益于其出色的空间和 时间分辨率，UFFCS成为理解分子相互作用基本机制的独特工具，而这些机制在传统单分子技术中往往难以揭示。事实上，UFFCS使研究人员得以探究辅助力和阻力如何调控myosin-5B的机械响应，从而为理解其在细胞...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脂肪族胺乳胶微球	ThermoFisher	A37362	1.0-μm 直径，2%（w/v）
丙酮	Sigma	32201
肌动蛋白聚合缓冲液	细胞骨架	BSA02	10X
声光偏转器（AODs）	AA光电电子	DTS-XY 250	激光束偏转器
ATP	Sigma	A7699
生物素标记的BSA	赛默飞世尔科技	29130
BSA	Sigma	B4287
猪脑钙调蛋白（CaM）	默克密理博	208783
牛肝过氧化氢酶	Sigma	C40
聚光镜	Olympus	奥林巴斯U-AAC，平场消色差，消色差	NA 1.4，油镜
磷酸肌酸二钠盐四水合物	Sigma	27920
兔肌肉肌酸磷酸激酶	Sigma	C3755
DDs	AA 光电	AA.DDS.XX	双通道数字合成器
DL-二硫苏糖醇（DTT）>	Sigma	43819
EGTA	Sigma	E4378
G-肌动蛋白	细胞骨架	AKL99
葡萄糖	Sigma	G7528
来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶	Sigma	G7141
HaloTag 琥珀酰亚胺酯 O2 配体	Promega	P1691
高真空硅脂，重型	默克密理博	107921
KCl	Sigma	P9541
KH2PO4/K2HPO4	Sigma	P5379/ P8281
Labview	国家仪器公司	8.1 版本	数据采集
Labview FPGA 模块	国家仪器公司	8.1 版本	快速力钳
Matlab	MathWorks	2016	数据分析
MgCl2	Fluka	63020
显微镜物镜	尼康	Plan-Apo 60X	数值孔径 1.2，工作距离 0.2 毫米，水浸
MOPS	Sigma	M1254
硝酸纤维素	Sigma	N8267	0.45 孔径
戊酸乙酯溶液	Sigma	46022
纯乙醇	Sigma	2860
QPDs	UDT	DLS-20	D 位置检测器
罗丹明 BSA	分子探针	A23016
罗丹明鬼笔环肽	Sigma	P1951
二氧化硅珠	邦斯拉布斯	SS04N	1.21 毫米，10% 固含量
叠氮化钠	Sigma	S2002
链霉亲和素蛋白	Sigma	189730