利用超快力钳光谱技术解析行进性肌球蛋白的力-酶特性

摘要

本文介绍了一种针对持续性运动的肌球蛋白-5分子马达进行超快力钳实验的完整方案，该方案可轻松拓展应用于其他类型的持续性分子马达研究。本方案详细描述了从实验装置的搭建、样品制备，到数据采集与分析的全部必要步骤。

摘要

超快力钳光谱技术（UFFCS）是一种基于激光镊子的单分子技术，能够在负载条件下以 unprecedented 的时间分辨率研究传统和非传统肌球蛋白的化学力学特性。特别是，该技术能够在肌动蛋白-肌球蛋白键形成后立即在恒定力条件下探测肌球蛋白马达，结合高速力反馈（200 kHz），已证明 UFFCS 是研究负载依赖性快速动力学（如肌球蛋白工作行程）的有力工具。此外，UFFCS 还可用于研究施加力的强度和方向如何影响过程性和非过程性肌球蛋白-肌动蛋白相互作用。

通过遵循本方案，可对持续性运动的肌球蛋白-5分子马达及多种非常规肌球蛋白进行超快力钳实验。经过适当调整，该方案也可轻松拓展用于研究其他类型的持续性运动马达，如驱动蛋白和动力蛋白。本方案涵盖了从实验装置搭建、样品制备、校准程序到数据采集与分析的全部必要步骤。

引言

近几十年来，由于光镊能够同时操控并测量单个分子的构象变化和酶促动力学，这一技术已成为阐明蛋白质相互作用的力化学机制的有力工具^1,2。特别是，光镊能够施加并测量细胞内分子马达所作用范围内的力，同时具备测量亚纳米级构象变化的能力，使其成为揭示马达蛋白的化学机械特性及其机械调控机制的独特单分子工具。

超快力钳光谱法（UFFCS）是一种基于光镊的单分子力谱技术，采用三珠几何构型（图1a）开发，用于研究分子马达在负载条件下的快速动力学过程^3,4。UFFCS将施加力至马达蛋白的时间延迟减少到光镊的物理极限，即系统的机械弛豫时间，从而可在肌球蛋白运动开始后迅速施加力（几十微秒内）³。该技术已被用于研究快速骨骼肌³和心肌肌球蛋白⁵中的早期机械事件，揭示了动力冲程、弱结合态与强结合态的负载依赖性，以及生化事件（Pi释放）与机械事件（动力冲程）发生的顺序。

三珠几何结构通常用于研究非过程性马达分子，而单珠几何....

方案

1. 光学装置

注意：实验装置由具有纳米级指向稳定性和<1% 激光强度波动的双光镊组成。在典型捕获刚度（0.1 pN/nm）和张力（1 pN 至数十 pN）条件下，可确保哑铃状微粒达到纳米级稳定性。图2展示了光学装置的详细示意图。

1. 光镊的设计与构建 ^9,10,11。
   1. 根据图2所示的示意图，将实验装置的所有组件放置在光学平台上。请注意，光学平台配备有主动隔振装置，以最大限度减少机械振动。此外，显微镜结构安装在弹性隔振器上，以吸收声学噪声和机械共振。
   2. 在激光源附近插入一个光学隔离器（图2中的“OI”），以避免由于光反馈引起的随机振幅波动。
   3. 将整个光路密封在一个封闭箱体内，以减少可能影响激光指向稳定性的气流和湍流。
   4. 通过使用偏振分束器（PBS），将主激光源（Nd:YAG激光器，波长1,064 nm，见图2）分成两条具有正交偏振的光路，从而构建双光镊系....

结果

代表性数据包括随时间变化的位置记录，如图所示 图4在位置记录中可观察到两种类型的位移。首先，当肌球蛋白马达未与肌动蛋白丝相互作用时，被捕获的微珠在溶液黏滞拖拽力作用下以恒定速度移动，表现出在线性位移基础上叠加的振荡，该振荡范围由操作者设定，呈三角波形。³ （不可见） 图4 由于时间尺度较长）。其次，一旦肌球蛋白马达与丝状物相互作用，运动丝所携带的力会迅速传递至该蛋白质，系统速度骤降至零（图中红线所示） 图4）且在恒定力作用下持续发生步进事件，直至运行结束。如图所示 图5 力的方向由反馈系统从正向切换到负向（反之亦然），当微珠到达用户设定的振荡范围边缘时，反馈系统即切换施加力的方向。在某些情况下，当肌球蛋白结合并朝正方向移动微丝时，会推动微珠趋向振荡范围的（上）边缘。若此情况发生在辅助力条件下（即力的方向与正向位移一致，推.......

讨论

尽管单分子技术（如三珠检测法）在技术上具有挑战性且通量较低，但UFFCS得益于数据的高信噪比，显著提升了分子相互作用的检测能力。UFFCS可用于研究马达蛋白的载荷依赖性，其主要优势在于：当马达与丝状结构结合时，能够迅速施加力，从而探测力产生过程中的早期及极快速事件，以及在受控力条件下的弱结合状态；在整个运动过程中保持力的恒定，并能够完全控制力的方向性，以探究马达蛋白对力的依赖性。关于最后一点，我们在此使用的三珠几何构型在沿丝状结构方向施加和测量力方面非常高效，可最大限度地减少横向或垂直方向分量的干扰。然而，当马达蛋白预期会主动产生横向或垂直方向的力，甚至扭矩时，其他构型（如单珠几何构型）则更为合适^2,7,18。此外，得益于其出色的空间和 时间分辨率，UFFCS成为理解分子相互作用基本机制的独特工具，而这些机制在传统单分子技术中往往难以揭示。事实上，UFFCS使研究人员得以探究辅助力和阻力如何调控myosin-5B的机械响应，从而为理解其在细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脂肪族胺乳胶微球	ThermoFisher	A37362	1.0-μm 直径，2%（w/v）
丙酮	Sigma	32201
肌动蛋白聚合缓冲液	细胞骨架	BSA02	10X
声光偏转器（AODs）	AA光电电子	DTS-XY 250	激光束偏转器
ATP	Sigma	A7699
生物素标记的BSA	赛默飞世尔科技	29130
BSA	Sigma	B4287
猪脑钙调蛋白（CaM）	默克密理博	208783
牛肝过氧化氢酶	Sigma	C40
聚光镜	Olympus	奥林巴斯U-AAC，平场消色差，消色差	NA 1.4，油镜
磷酸肌酸二钠盐四水合物	Sigma	27920
兔肌肉肌酸磷酸激酶	Sigma	C3755
DDs	AA 光电	AA.DDS.XX	双通道数字合成器
DL-二硫苏糖醇（DTT）>	Sigma	43819
EGTA	Sigma	E4378
G-肌动蛋白	细胞骨架	AKL99
葡萄糖	Sigma	G7528
来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶	Sigma	G7141
HaloTag 琥珀酰亚胺酯 O2 配体	Promega	P1691
高真空硅脂，重型	默克密理博	107921
KCl	Sigma	P9541
KH2PO4/K2HPO4	Sigma	P5379/ P8281
Labview	国家仪器公司	8.1 版本	数据采集
Labview FPGA 模块	国家仪器公司	8.1 版本	快速力钳
Matlab	MathWorks	2016	数据分析
MgCl2	Fluka	63020
显微镜物镜	尼康	Plan-Apo 60X	数值孔径 1.2，工作距离 0.2 毫米，水浸
MOPS	Sigma	M1254
硝酸纤维素	Sigma	N8267	0.45 孔径
戊酸乙酯溶液	Sigma	46022
纯乙醇	Sigma	2860
QPDs	UDT	DLS-20	D 位置检测器
罗丹明 BSA	分子探针	A23016
罗丹明鬼笔环肽	Sigma	P1951
二氧化硅珠	邦斯拉布斯	SS04N	1.21 毫米，10% 固含量
叠氮化钠	Sigma	S2002
链霉亲和素蛋白	Sigma	189730