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利用超快力钳光谱技术解析行进性肌球蛋白的力-酶特性

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DOI：

10.3791/62388

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2021年7月1日

 ,  ,  , 
1National Institute of Optics, National Research Council, 2LENS, European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, 3Physics Department, University of Florence

本文内容

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摘要

本文介绍了一种针对持续性运动的肌球蛋白-5分子马达进行超快力钳实验的完整方案，该方案可轻松拓展应用于其他类型的持续性分子马达研究。本方案详细描述了从实验装置的搭建、样品制备，到数据采集与分析的全部必要步骤。

摘要

超快力钳光谱技术（UFFCS）是一种基于激光镊子的单分子技术，能够在负载条件下以 unprecedented 的时间分辨率研究传统和非传统肌球蛋白的化学力学特性。特别是，该技术能够在肌动蛋白-肌球蛋白键形成后立即在恒定力条件下探测肌球蛋白马达，结合高速力反馈（200 kHz），已证明 UFFCS 是研究负载依赖性快速动力学（如肌球蛋白工作行程）的有力工具。此外，UFFCS 还可用于研究施加力的强度和方向如何影响过程性和非过程性肌球蛋白-肌动蛋白相互作用。

通过遵循本方案，可对持续性运动的肌球蛋白-5分子马达及多种非常规肌球蛋白进行超快力钳实验。经过适当调整，该方案也可轻松拓展用于研究其他类型的持续性运动马达，如驱动蛋白和动力蛋白。本方案涵盖了从实验装置搭建、样品制备、校准程序到数据采集与分析的全部必要步骤。

引言

近几十年来，由于光镊能够同时操控并测量单个分子的构象变化和酶促动力学，这一技术已成为阐明蛋白质相互作用的力化学机制的有力工具1,2。特别是，光镊能够施加并测量细胞内分子马达所作用范围内的力，同时具备测量亚纳米级构象变化的能力，使其成为揭示马达蛋白的化学机械特性及其机械调控机制的独特单分子工具。

超快力钳光谱法（UFFCS）是一种基于光镊的单分子力谱技术，采用三珠几何构型（图1a）开发，用于研究分子马达在负载条件下的快速动力学过程3,4。UFFCS将施加力至马达蛋白的时间延迟减少到光镊的物理极限，即系统的机械弛豫时间，从而可在肌球蛋白运动开始后迅速施加力（几十微秒内）3。该技术已被用于研究快速骨骼肌3和心肌肌球蛋白5中的早期机械事件，揭示了动力冲程、弱结合态与强结合态的负载依赖性，以及生化事件（Pi释放）与机械事件（动力冲程）发生的顺序。

三珠几何结构通常用于研究非过程性马达分子，而单珠几何结构结合力钳技术则常用于研究如肌球蛋白Va等过程性非常规肌球蛋白6。然而，对于过程性肌球蛋白，也有若干理由更倾向于采用三珠UFFCS检测方法。首先，在肌动蛋白与肌球蛋白结合后立即施加负载，可实现对力生成早期事件的测量，这一点与非过程性马达分子类似。此外，在过程性马达分子的情况下，该方法还能在恒定负载条件下精确测量马达在整个运动过程中的运行长度和持续时间（图1b）。再者，由于力反馈速率较高，系统可在位置快速变化期间（例如肌球蛋白的工作冲程）保持力的恒定，从而确保马达步进过程中负载的稳定性。系统的高时间分辨率使得亚毫秒级相互作用得以检测，为研究肌球蛋白与肌动蛋白之间的弱结合提供了可能。最后，该检测构型可确保力沿肌动蛋白丝方向施加，力的横向和垂直分量可忽略不计。这一点尤为重要，因为已有研究表明，垂直方向的力分量会显著影响马达动力学的负载依赖性7,8。通过使用该技术，我们能够对过程性肌球蛋白-5B施加一系列辅助性和抵抗性负载，并直接测量其在广泛力范围内的过程性负载依赖性4。

如图1a所示，在该系统中，一条肌动蛋白丝被悬挂在双光镊捕获的两个聚苯乙烯小球之间（即"哑铃"结构）。通过快速反馈系统，对肌动蛋白丝施加一个不平衡的净力 F = F1 - F2，使肌动蛋白丝以恒定速度单向移动，直至到达用户定义的反转点，此时净力方向反转。当马达蛋白未与肌动蛋白丝相互作用时，哑铃结构可在底座小球（其上附着单个马达蛋白）范围内自由地以三角波形式来回移动（图1b，底部图示）。一旦马达蛋白与肌动蛋白丝发生相互作用，哑铃所承受的力便迅速传递至马达蛋白，马达随即在相互作用时刻反馈系统所施加的力的大小和方向下，通过步进行动推动肌动蛋白丝移动，直至肌球蛋白从肌动蛋白上解离。由于马达步进所产生的位移依赖于被捕获肌动蛋白丝的极性，根据所施加力的方向，负载可表现为辅助性（即与马达位移方向一致，推动马达前进，见图1b上部图示中的“push”），或表现为抵抗性（即与马达位移方向相反，阻碍马达前进，见图1b上部图示中的“pull”），从而可研究施加负载的强度和方向性对马达过程性化学机械调控的影响。

在接下来的章节中，将全面描述使用超快力钳光谱技术在不同负载条件下测量肌动蛋白-肌球蛋白-5B 相互作用的所有步骤，包括：1）光学装置的搭建、光阱的对准与校准程序；2）所有组分的制备及其在样品腔中的组装；3）测量过程；4）代表性数据及数据分析，以提取重要的物理参数，例如马达蛋白的运行长度、步长和速度。

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方案

1. 光学装置

注意：实验装置由具有纳米级指向稳定性的双光镊组成 < 1% 的激光强度波动。在此条件下，哑铃状粒子在典型的捕获刚度（0.1 pN/nm）和张力（1 pN 至数十 pN）下，其稳定性可保证在纳米级别。 图2 展示了光学装置的详细示意图。

  1. 光镊的设计与构建 9,10,11.
    1. 根据示意图将装置的所有组件放置在光学平台上 图2请注意，光学平台包含主动隔振器，以最大限度减少机械振动。此外，显微镜结构安装在弹性隔振器上，以吸收声学噪声和机械共振。
    2. 在激光源附近插入一个光学隔离器（"OI" 在 图2)，以避免因光学反馈导致的随机振幅波动。
    3. 将整个光路密封在封闭箱体内，以减少可能影响激光指向稳定性的气流和湍流。
    4. 通过将主激光源（Nd:YAG激光器，1,064 nm波长）分束来构建双光镊系统 图2) 利用偏振分束器（PBS）分成两束具有正交偏振的光路。应避免使用时分复用光阱，因为它会在张力作用下引起哑铃形微粒的振荡12.
    5. 使用两个声光偏转器（AODs） 图2) 由直接数字频率合成器（DDS）驱动，以实现对两个光镊的精细快速移动，并通过现场可编程门阵列（FPGA）板的数字输出直接控制DDS，从而精确调节肌动蛋白张力（参见 图2).
      ​注意：整体反馈响应时间必须 <10 µs 在测量过程中（包括无结合状态、肌球蛋白相互作用及运动过程），快速校正并维持双光镊上的恒定力。为此，位置探测器必须具备 >= 100 kHz 带宽，且数据必须以 >= 200 kHz 采样率。对每个采集的数据点（5 µs 采集时间），FPGA 会计算针对两个陷阱的成比例校正，并将结果发送至驱动两个声光偏转器（AOD）的直接数字频率合成器（DDS）。AOD 的响应时间必须低于 5 µs 以满足所需的反馈响应时间。
    6. 为实现对捕获微珠位置的纳米级检测，将两个四象限光电二极管探测器（QPD）置于 图2) 位于聚光镜的后焦平面。将四象限光电探测器（QPDs）精确对准与聚光镜后焦平面共轭的平面，以及将声光偏转器（AODs）对准与物镜后焦平面共轭的平面，可确保QPDs信号不受AODs频率的影响。
    7. 将AOD安装在带有千分尺驱动的线性平移台上，并移动平移台，直至晶体边缘接近激光光束。随后，将物镜替换为一个安装在螺纹物镜座上且中心对准的虹膜光阑，并调节其孔径，使其与物镜后孔径大小相匹配。
    8. 将平移装置向激光束方向移动，直至在光圈后方可观察到压电晶体遮挡的部分光束，然后将平移装置略微回退，使光束重新完全充满光圈孔径。
    9. 重复步骤 1.1.7–1.1.8 处理第二个声光偏转器（AOD）。通过快速移动固定在盖玻片表面小球上的光束，测量四象限光电探测器（QPD）的时间延迟，以检测反馈回路的响应时间。13.
      ​注意：上述三个步骤（1.1.7–1.1.9）可实现AOD晶体的精确对准，对于优化光束偏转及反馈的时间响应至关重要。13.
  2. 使用光电二极管测量显微镜入口处捕获激光的光强波动，其波动幅度必须低于1%。注意，光电二极管的带宽必须大于成像速率。
  3. 检查两个光阱的指向稳定性。
    1. 在磷酸盐缓冲液（PB）中稀释二氧化硅珠粒以进行制备 20 µL 硅胶珠的1.2 µm，10% 固含量）溶于 1 mL 丙酮中，超声处理 30 秒，短暂涡旋混匀，然后在 19,000 x g 条件下离心 2 分钟 g.
    2. 去除上清液，加入1 mL丙酮重悬，重复洗涤一次。用1 mL 50 mM PB重悬，洗涤2次。最后用 100 µL 50 mM PB 的
    3. 使用双面胶带将盖玻片粘附到显微镜载玻片上，利用二氧化硅微珠进行光镊校准（约 60 µm 厚）以构建流室。向室中加入1 mg/mL BSA（牛血清白蛋白）并静置3分钟。
    4. 将二氧化硅微球以1:1000的比例稀释于PB缓冲液中并流经样品室。使用装有硅脂的注射器小心密封样品室。在每个光镊中捕获单个微球，并应用功率谱方法。14 进行校准。
    5. 在室温下，将二氧化硅珠溶于戊酸乙酯中制备 20 µL 二氧化硅珠（silica beads）1.2 µm 直径，10% 固体）溶于 1-1.5 mL 丙酮中，涡旋并超声处理 30 秒。
    6. 在 18,500 x g 条件下离心 g 2分钟。弃去上清液，加入1 mL丙酮重悬，重复洗涤一次。加入1 mL戊酸戊酯重悬，随后用戊酸戊酯再重复洗涤（离心及重悬）2次。将沉淀物重悬于 100 µL 1% 硝酸纤维素 900 µL 戊酸乙酯。储存于 4 °C 2个月。
    7. 取一片 24 x 24 mm 的玻璃盖玻片，用浸有纯乙醇的纸小心擦拭清洁。然后用洁净的镊子夹住盖玻片，再用纯乙醇直接冲洗一次。在氮气 gentle 气流下使其干燥。如有需要，可重复此操作，以去除玻璃表面所有可见残留物。
    8. 取二氧化硅珠原液，涡旋混匀后短暂超声处理约30秒。
    9. 清洁第二块盖玻片（24 × 60 mm）后，用其进行涂片 2 µL 在盖玻片的一侧表面加入二氧化硅珠溶液，并等待其干燥。
    10. 仔细清洁将用于构建流动室的显微镜载玻片（26 × 76 mm）。
    11. 裁剪两条双面胶带（约3 mm宽，60-100 µm 厚）并将其附着在载玻片的一侧，如图所示 图3.
    12. 使用洁净的镊子合上腔室（约 20 µL 最终体积）：将包被的盖玻片（1.3.9）与粘性胶带线条接触，使硝酸纤维素+微珠层朝向腔室内部，如图所示 图 3a用50 mM磷酸缓冲液填充流室，并用硅脂密封。
    13. 在明场显微镜下观察单个二氧化硅微珠 >使用配备电荷耦合器件（CCD）或互补金属氧化物半导体（CMOS）相机的200倍放大倍率 >1.4 兆像素。使用反馈软件移动压电平台（精度达到或优于纳米级），以补偿热漂移。10.
    14. 将左侧捕获阱的中心与小球的中心重叠（QPD 的 x-y 信号水平应与校准值一致）。然后测量该捕获阱的位置噪声及其位置信号的标准差。
    15. 对右侧捕获装置重复上一步骤15.
  4. 陷阱位置校准：MHz 到 nm
    1. 制备一个流动腔，其中盖玻片表面附着二氧化硅微珠（1.3.5-1.3.12），并加入悬浮的聚苯乙烯微珠（使用 α-肌动蛋白结合珠粒，制备方法见下文第2.1节。
    2. 将石英珠对焦于盖玻片表面，位置略偏离中心（约~5 µm) 从视野（FOV）中心开始，获取该视野的图像。移动微珠以 10 µm 使用压电载物台将视野移向视场中心，并采集第二幅图像。利用质心算法或类似方法计算两幅图像中微珠的中心位置，计算两个微珠之间的像素距离，从而获得明场相机的纳米/像素校准值。
    3. 在单个光阱中捕获一个悬浮微粒。随后，通过声光偏转器（AOD）以小步长（0.2 MHz）移动光阱，并在每一步采集微粒图像及对应的AOD频率。采用之前使用的质心算法计算微粒在视场中的位置，并利用上一步获得的nm/像素校准系数将其转换为纳米单位。
    4. 对频率-位置数据进行线性拟合，并计算校准常数，单位为 nm/MHz。
    5. 对第二个光镊重复校准
  5. 陷阱功率与刚度校准（MHz 对 W），QPD（MHz 对 pN/nm）
    1. 制备一个流动腔，其中盖玻片表面附着二氧化硅微珠（1.3.5-1.3.12），并加入悬浮的聚苯乙烯微珠（使用 α-肌动蛋白结合珠（按以下第2.1节方法制备），用一个光镊捕获单个微粒。随后通过声光偏转器（AOD）以小步长（0.2 MHz）逐步移动两个光镊，同时利用四象限光电探测器（QPD）记录微粒在两个光镊中的布朗运动及对应的AOD频率。
    2. 在每个位置计算探测器上的平均功率，并通过将洛伦兹函数拟合到记录的布朗运动功率谱来获得捕获刚度和QPD校准常数β13.

2. 样品制备

  1. 制备α-肌动蛋白结合的荧光微球
    1. 进行偶联16：取氨基功能化的聚苯乙烯微球（直径1 µm，2.5%固含量），用500 μL蒸馏水洗涤两次，重悬于500 μL PBS（pH 7.0）中。加入1 mM HaloTag琥珀酰亚胺酯O2配体，室温孵育1小时。用500 μL PBS洗涤三次，重悬于100–200 µM HaloTag α-肌动蛋白溶液中。37 °C孵育1小时，再用500 μL PBS洗涤三次（微球可在1.5周内使用，或在液氮中速冻后于−80 °C保存）。
    2. 标记：将200 µL微球溶液与罗丹明-BSA在终浓度5 µg/mL条件下孵育10分钟。用50 mM PB缓冲液洗涤三次，重悬于500 µL 50 mM PB缓冲液中。此溶液可分装后于−80 °C保存数月。
  2. 按先前所述方法表达并纯化生物素化的Myosin-5B4,17。
  3. 聚合并标记F-肌动蛋白13：
    1. F-肌动蛋白聚合：将69 µL超纯水、10 µL 10倍肌动蛋白聚合缓冲液（100 mM Tris HCl，20 mM MgCl2，500 mM KCl，10 mM ATP，50 mM 碳酸胍，pH 7.5）、20 µL 10 mg/mL G-肌动蛋白和1 µL 1 M 二硫苏糖醇（DTT）混合。冰上静置超过1小时。
    2. 用罗丹明标记F-肌动蛋白（激发/发射波长：546/575 nm）：取25 µL已聚合的F-肌动蛋白，加入19.5 µL超纯水、2.5 µL 10倍肌动蛋白聚合缓冲液（100 mM Tris HCl，20 mM MgCl2，500 mM KCl，10 mM ATP，50 mM 碳酸胍，pH 7.5）、1 µL 1 M DTT和2 µL 250 µM 罗丹明鬼笔环肽。冰上过夜孵育。用于捕获实验时，罗丹明标记的F-肌动蛋白可在冰上保存并在一周内使用。
  4. 样品组装
    1. 取流动池（1.3.5–1.3.12），加入1 mg/mL生物素化BSA孵育5分钟。用AB缓冲液（25 mM MOPS，25 mM KCl，4 mM MgCl2，1 mM EGTA，1 mM DTT，pH 7.2）洗涤后，加入1 mg/mL链霉亲和素孵育5分钟，再次用AB缓冲液洗涤。在M5B缓冲液（10 mM MOPS pH 7.3，0.5 M NaCl，0.1 mM EGTA，3 mM NaN3）中加入3 nM生物素化的Myosin-5B重酶解肌球蛋白，并加入2 µM钙调蛋白（CaM），孵育5分钟。用三倍体积含2 µM CaM的AB缓冲液补充1 mg/mL生物素化BSA洗涤，再孵育3分钟。
    2. 在孵育过程中配制反应混合液（RM）：在成像缓冲液（IB：含1.2 µM葡萄糖氧化酶、0.2 µM过氧化氢酶、17 mM葡萄糖、20 mM DTT、2 µM CaM以及实验所需浓度ATP的AB缓冲液）中加入0.005% α-肌动蛋白功能化的微球（见第2.1节）和1 nM罗丹明标记的F-肌动蛋白（见第2.3节）。
    3. 用反应混合液洗涤流动池，并用硅脂密封。样品现已准备就绪，可在显微镜下观察。

3. 测量

  1. 组装哑铃结构。
    1. 通过长程位移装置移动样品，寻找悬浮的 α-肌动蛋白结合珠，开启一个光镊并捕获其中一个珠子。
    2. 当第一个光镊捕获珠子后，移动位移装置，使被捕获的珠子靠近盖玻片表面，以避免同时捕获多个珠子，然后在第二个光镊中捕获另一个珠子。
    3. 通过调节声光偏转器（AOD）声波的功率，将两个光镊调节至相同的刚度。刚度通常设定在 0.03 至 0.14 pN/nm 之间。刚度越小，力噪声越低，特别是在低力条件下。
    4. 然后翻转电动镜 M（图 2），切换至荧光显微镜模式，并通过长程位移装置移动样品，寻找溶液中悬浮的肌动蛋白丝13。优先选择较长的丝（>5 µm），因为过程性肌球蛋白会推动其移动数微米后才解离。
    5. 移动样品，使其中一个被捕获的珠子接近肌动蛋白丝的一端，直至两者结合。然后，将两个珠子之间的距离调整至接近肌动蛋白丝的长度，并通过移动载物台向未结合的第二个珠子方向产生流体流动。肌动蛋白丝将被流动拉伸并最终与第二个珠子结合13。这种珠-肌动蛋白-珠复合物称为“哑铃”结构。
  2. 建立肌动蛋白-肌球蛋白接触。
    1. 缓慢将两个光镊拉开，对肌动蛋白丝预加张力至约 3 pN，并通过改变两个 AOD 中其中一个的频率，使一个光镊以三角波形式振荡，检测哑铃结构的刚性，并通过其位置信号验证运动是否传递至后随珠子。
    2. 移动载物台，将哑铃结构移近一个固定在基底上的二氧化硅珠，通过略微调节被捕获珠子中心的位置至低于二氧化硅珠直径的高度，使肌动蛋白丝与附着在珠子表面的蛋白接触。然后将二氧化硅珠的中心定位在两个被捕获珠子之间。
  3. 力钳制与纳米级稳定反馈：
    1. 开启超快力钳制模式，设定力为 2–3 pN，振荡幅度为 200 nm，并沿垂直于肌动蛋白丝的方向，以约 20–30 nm 的离散步长扫描基底珠。在每个位置等待相互作用发生（数秒），若未观察到相互作用则继续前进。当蛋白-丝相互作用建立后，寻找相互作用最频繁的位置。
    2. 确保当过程性肌球蛋白向肌动蛋白丝的一端（通常为 + 端）移动时，连接在 + 端的被捕获珠子朝向二氧化硅珠移动。移动载物台朝向肌动蛋白丝的 - 端，使得在肌球蛋白未结合时，二氧化硅珠尽可能靠近连接在肌动蛋白丝 - 端的被捕获珠子，并启动纳米级稳定反馈。这样做可最大程度降低连接在肌动蛋白丝 + 端的被捕获珠子撞击二氧化硅珠的概率。
  4. 记录数据。

4. 数据分析4

注意：所描述的分析方法可根据哑铃速度的变化（由肌球蛋白步进行为引起）来检测和测量持续性运行及快速步进事件。对持续性运行的分析是基于文献3,4,13中所述的非持续性分子马达的数据分析方法进行的。

  1. 设定速度变化的阈值，以实现对步进事件的检测。由于在此情况下预期存在前向和后向步进，因此两个方向上跨越阈值均被视为有效步进事件。
  2. 将每个步长分配到相应的运行中：如果两个连续步长之间的时间间隔短于 3 ms，且步长的幅度满足 < 90 nm，将步骤归为同一次运行，否则将步骤归为不同的运行4.
  3. 辅助力的正确运行长度4.
    1. 通过测量得到的平均运行长度值计算真实运行长度值 RL，以获得辅助力作用下的正确运行长度 <RLm> 由以下公式，其中 D 是振荡范围：
      figure-protocol-1
      注：该方程推导的详细信息可参见参考文献4.

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结果

代表性数据包括随时间变化的位置记录，如图所示 图4在位置记录中可观察到两种位移。首先，当肌球蛋白马达未与肌动蛋白丝相互作用时，被捕获的微珠在溶液黏滞阻力作用下以恒定速度移动，表现出线性位移，并在操作者设定的三角波振荡范围内来回振荡。3 （不可见于 图4 由于时间尺度较长）。其次，一旦肌球蛋白马达与丝状物相互作用，运动丝状物所携带的力会迅速传递至该蛋白质，系统速度骤降至零（图中红线所示） 图4）并在恒定力作用下持续发生步进事件，直至结束 运行。如图所示 图5 力的方向由反馈系统从正向切换到负向（反之亦然），当微珠到达用户设定的振荡范围边缘时，反馈系统即切换力的方向。在某些情况下，当肌球蛋白结合并朝正方向移动微丝时，会推动微珠趋向振荡范围的（上）边缘。若此情况发生在辅助力（即方向朝向正向位移，推动）作用下，

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讨论

尽管单分子技术（如三珠检测法）在技术上具有挑战性且通量较低，但UFFCS得益于数据的高信噪比，显著提升了分子相互作用的检测能力。UFFCS可用于研究马达蛋白的载荷依赖性，其主要优势在于：当马达与丝状结构结合时，能够迅速施加力，从而探测力产生过程中的早期及极快速事件，以及在受控力条件下的弱结合状态；在整个运动过程中保持力的恒定，并能够完全控制力的方向性，以探究马达蛋白对力的依赖性。关于最后一点，我们在此使用的三珠几何构型在沿丝状结构方向施加和测量力方面非常高效，可最大限度地减少横向或垂直方向分量的干扰。然而，当马达蛋白预期会主动产生横向或垂直方向的力，甚至扭矩时，其他构型（如单珠几何构型）则更为合适2,7,18。此外，得益于其出色的空间和 时间分辨率，UFFCS成为理解分子相互作用基本机制的独特工具，而这些机制在传统单分子技术中往往难以揭示。事实上，UFFCS使研究人员得以探究辅助力和阻力如何调控myosin-5B的机械响应，从而为理解其在细胞...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作得到了欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议号：871124 Laserlab-Europe）、意大利大学与研究部（FIRB“未来研究”2013年项目，资助号：RBFR13V4M2）以及佛罗伦萨储蓄银行基金会的资助。A.V. Kashchuk 获得了人类前沿科学计划跨学科博士后奖学金（LT008/2020-C）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
 脂肪族胺乳胶微球ThermoFisherA373621.0-μm 直径，2%（w/v）
丙酮Sigma32201
肌动蛋白聚合缓冲液细胞骨架BSA0210X
声光偏转器（AODs）AA光电电子DTS-XY 250激光束偏转器
ATPSigmaA7699
生物素标记的BSA赛默飞世尔科技29130
BSASigmaB4287
猪脑钙调蛋白（CaM）默克密理博208783
牛肝过氧化氢酶SigmaC40
聚光镜Olympus奥林巴斯U-AAC，平场消色差，消色差NA 1.4，油镜
磷酸肌酸二钠盐四水合物Sigma27920
兔肌肉肌酸磷酸激酶SigmaC3755
DDsAA 光电AA.DDS.XX双通道数字合成器
DL-二硫苏糖醇（DTT）>Sigma43819
EGTASigmaE4378
G-肌动蛋白细胞骨架AKL99
葡萄糖SigmaG7528
来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶Sigma G7141
HaloTag 琥珀酰亚胺酯 O2 配体PromegaP1691
高真空硅脂，重型默克密理博107921
KClSigmaP9541
KH2PO4/K2HPO4SigmaP5379/ P8281
Labview国家仪器公司8.1 版本数据采集
Labview FPGA 模块国家仪器公司8.1 版本快速力钳
MatlabMathWorks2016数据分析
MgCl2Fluka63020
显微镜物镜尼康Plan-Apo 60X数值孔径 1.2，工作距离 0.2 毫米，水浸
MOPSSigmaM1254
硝酸纤维素SigmaN82670.45 孔径
戊酸乙酯溶液Sigma46022
纯乙醇 Sigma2860
QPDsUDTDLS-20D 位置检测器
罗丹明 BSA分子探针A23016
罗丹明鬼笔环肽 SigmaP1951
二氧化硅珠邦斯拉布斯SS04N1.21 毫米，10% 固含量
叠氮化钠 SigmaS2002
链霉亲和素蛋白 Sigma189730

参考文献

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Formal Correction: Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
Posted by JoVE Editors on 8/25/2021. Citeable Link.

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

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