本文介绍了一种针对持续性运动的肌球蛋白-5分子马达进行超快力钳实验的完整方案，该方案可轻松拓展应用于其他类型的持续性分子马达研究。本方案详细描述了从实验装置的搭建、样品制备，到数据采集与分析的全部必要步骤。
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摘要
摘要
超快力钳光谱技术（UFFCS）是一种基于激光镊子的单分子技术，能够在负载条件下以 unprecedented 的时间分辨率研究传统和非传统肌球蛋白的化学力学特性。特别是，该技术能够在肌动蛋白-肌球蛋白键形成后立即在恒定力条件下探测肌球蛋白马达，结合高速力反馈（200 kHz），已证明 UFFCS 是研究负载依赖性快速动力学（如肌球蛋白工作行程）的有力工具。此外，UFFCS 还可用于研究施加力的强度和方向如何影响过程性和非过程性肌球蛋白-肌动蛋白相互作用。
通过遵循本方案，可对持续性运动的肌球蛋白-5分子马达及多种非常规肌球蛋白进行超快力钳实验。经过适当调整，该方案也可轻松拓展用于研究其他类型的持续性运动马达，如驱动蛋白和动力蛋白。本方案涵盖了从实验装置搭建、样品制备、校准程序到数据采集与分析的全部必要步骤。
引言
近几十年来，由于光镊能够同时操控并测量单个分子的构象变化和酶促动力学，这一技术已成为阐明蛋白质相互作用的力化学机制的有力工具1,2。特别是，光镊能够施加并测量细胞内分子马达所作用范围内的力，同时具备测量亚纳米级构象变化的能力，使其成为揭示马达蛋白的化学机械特性及其机械调控机制的独特单分子工具。
超快力钳光谱法（UFFCS）是一种基于光镊的单分子力谱技术，采用三珠几何构型（图1a）开发，用于研究分子马达在负载条件下的快速动力学过程3,4。UFFCS将施加力至马达蛋白的时间延迟减少到光镊的物理极限，即系统的机械弛豫时间，从而可在肌球蛋白运动开始后迅速施加力（几十微秒内）3。该技术已被用于研究快速骨骼肌3和心肌肌球蛋白5中的早期机械事件，揭示了动力冲程、弱结合态与强结合态的负载依赖性，以及生化事件（Pi释放）与机械事件（动力冲程）发生的顺序。
三珠几何结构通常用于研究非过程性马达分子，而单珠几何....
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方案
1. 光学装置
注意：实验装置由具有纳米级指向稳定性的双光镊组成， < 1% 的激光强度波动。在这些条件下，哑铃形样品在典型的捕获刚度（0.1 pN/nm）和张力（1 pN 至数十 pN）下，可保证达到纳米级的稳定性。 图2 展示了光学装置的详细示意图。
- 光镊的设计与构建 9,10,11.
- 根据示意图将装置的所有组件放置于光学平台上 图2请注意，光学平台配有主动隔振器，以最大限度减少机械振动。此外，显微镜结构安装在弹性隔振器上，以吸收声学噪声和机械共振。
- 在激光源附近插入一个光学隔离器（“OI”在 图2），以避免因光学反馈导致的随机振幅波动。
- 将整个光路密封在封闭箱体内，以减少气流和湍流对激光指向稳定性的影响。
- 通过将主激光源（Nd:YAG激光器，1,064 nm波长）分束，构建双光镊系统 图2) 利用偏振分束器（PBS）将其分为两束具有正交偏....
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结果
代表性数据包括随时间变化的位置记录，如图所示 图4在位置记录中可观察到两种位移。首先，当肌球蛋白马达未与肌动蛋白丝相互作用时，被捕获的微珠在溶液黏性阻力作用下以恒定速度移动，表现出在线性位移，该位移在操作者设定的三角波振荡范围内波动。3 （不可见于 图4 由于时间尺度较长）。其次，一旦肌球蛋白马达与细丝相互作用，运动细丝所携带的力会迅速传递给蛋白质，系统速度骤降至零（图中红线所示 图4）并在恒定力作用下持续发生步进事件直至运行结束。如图所示 图5 力的方向由反馈系统在正方向和负方向之间切换（反之亦然），当微珠到达用户设定的振荡范围边界时，反馈系统即切换力的方向。在某些情况下，当肌球蛋白结合并朝正方向移动微丝时，会推动微珠向振荡范围的（上方）边界移动。若此时作用力为辅助力（即方向朝向正向位移，推动）
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讨论
尽管单分子技术（如三珠检测法）在技术上具有挑战性且通量较低，但UFFCS得益于数据的高信噪比，显著提升了分子相互作用的检测能力。UFFCS可用于研究马达蛋白的载荷依赖性，其主要优势在于：当马达与丝状结构结合时，能够迅速施加力，从而探测力产生过程中的早期及极快速事件，以及在受控力条件下的弱结合状态；在整个运动过程中保持力的恒定，并能够完全控制力的方向性，以探究马达蛋白对力的依赖性。关于最后一点，我们在此使用的三珠几何构型在沿丝状结构方向施加和测量力方面非常高效，可最大限度地减少横向或垂直方向分量的干扰。然而，当马达蛋白预期会主动产生横向或垂直方向的力，甚至扭矩时，其他构型（如单珠几何构型）则更为合适2,7,18。此外，得益于其出色的空间和 时间分辨率，UFFCS成为理解分子相互作用基本机制的独特工具，而这些机制在传统单分子技术中往往难以揭示。事实上，UFFCS使研究人员得以探究辅助力和阻力如何调控myosin-5B的机械响应，从而为理解其在细胞.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本工作得到了欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议号：871124 Laserlab-Europe）、意大利大学与研究部（FIRB“未来研究”2013年项目，资助号：RBFR13V4M2）以及佛罗伦萨储蓄银行基金会的资助。A.V. Kashchuk 获得了人类前沿科学计划跨学科博士后奖学金（LT008/2020-C）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 脂肪族胺乳胶微球 | ThermoFisher | A37362 | 1.0-μm 直径，2%（w/v） |
| 丙酮 | Sigma | 32201 | |
| 肌动蛋白聚合缓冲液 | 细胞骨架 | BSA02 | 10X |
| 声光偏转器（AODs） | AA光电电子 | DTS-XY 250 | 激光束偏转器 |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| 生物素标记的BSA | 赛默飞世尔科技 | 29130 | |
| BSA | Sigma | B4287 | |
| 猪脑钙调蛋白（CaM） | 默克密理博 | 208783 | |
| 牛肝过氧化氢酶 | Sigma | C40 | |
| 聚光镜 | Olympus | 奥林巴斯U-AAC，平场消色差，消色差 | NA 1.4，油镜 |
| 磷酸肌酸二钠盐四水合物 | Sigma | 27920 | |
| 兔肌肉肌酸磷酸激酶 | Sigma | C3755 | |
| DDs | AA 光电 | AA.DDS.XX | 双通道数字合成器 |
| DL-二硫苏糖醇（DTT）> | Sigma | 43819 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| G-肌动蛋白 | 细胞骨架 | AKL99 | |
| 葡萄糖 | Sigma | G7528 | |
| 来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶 | Sigma | G7141 | |
| HaloTag 琥珀酰亚胺酯 O2 配体 | Promega | P1691 | |
| 高真空硅脂，重型 | 默克密理博 | 107921 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4/K2HPO4 | Sigma | P5379/ P8281 | |
| Labview | 国家仪器公司 | 8.1 版本 | 数据采集 |
| Labview FPGA 模块 | 国家仪器公司 | 8.1 版本 | 快速力钳 |
| Matlab | MathWorks | 2016 | 数据分析 |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| 显微镜物镜 | 尼康 | Plan-Apo 60X | 数值孔径 1.2，工作距离 0.2 毫米，水浸 |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| 硝酸纤维素 | Sigma | N8267 | 0.45 孔径 |
| 戊酸乙酯溶液 | Sigma | 46022 | |
| 纯乙醇 | Sigma | 2860 | |
| QPDs | UDT | DLS-20 | D 位置检测器 |
| 罗丹明 BSA | 分子探针 | A23016 | |
| 罗丹明鬼笔环肽 | Sigma | P1951 | |
| 二氧化硅珠 | 邦斯拉布斯 | SS04N | 1.21 毫米，10% 固含量 |
| 叠氮化钠 | Sigma | S2002 | |
| 链霉亲和素蛋白 | Sigma | 189730 |
参考文献
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
- Capitanio, M., Pavone, F. S.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
Posted by JoVE Editors on 8/25/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy. The title was updated.
The title was updated from:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
to:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy
