我们开发了一种新的功能缺失研究方法，该方法通过利用人工微小RNA序列的导入及其在鸡胚基因组中的整合来实现 在卵内 电穿孔与Tol2转座子系统。该技术为研究发育过程中基因功能提供了高效且稳定的基因敲低方法。
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摘要
摘要
鸡视网膜长期以来一直是发育神经生物学研究中的重要模型系统，其优势包括组织体积大、发育迅速，以及便于进行可视化观察和实验操作。然而，该系统主要的技术局限在于缺乏高效的基因功能缺失研究手段。本实验方案描述了一种利用Tol2转座子系统通过转基因表达人工微小RNA（miRNA）实现鸡胚胎视网膜中基因沉默的方法。该方法将包含EmGFP（emerald green fluorescent protein）标记基因和针对目标基因的人工pre-miRNA序列的表达盒的Tol2转座子质粒，与Tol2转座酶表达载体共同导入鸡胚视网膜中 在卵内 电穿孔。在转染的视网膜细胞中，转座酶催化表达盒从转座子载体上切除，并将其整合到宿主染色体中，从而实现miRNA和EmGFP蛋白的稳定表达。在我们之前的研究中，已证明利用该技术可显著抑制Nel（一种在神经发育中具有多种功能的糖蛋白）在发育中鸡胚视网膜中的表达。结果表明，该方法可诱导基因表达的稳定且高效的抑制，因此为视网膜发育研究提供了一种有效的功能缺失研究策略。
引言
脊椎动物的视网膜是研究神经发育的重要模型系统。尽管位于外周，视网膜在解剖学和发育上属于中枢神经系统的延伸，而由视网膜神经节细胞轴突组成的视神经，代表了中枢神经系统内的一条神经束。鸡视网膜作为研究神经发育分子机制的模型系统具有显著优势：其组织较大且发育迅速，结构和功能与人类视网膜具有相似性，并且便于进行可视化观察和实验操作。利用鸡视网膜，研究人员已广泛深入地探讨了神经发育过程中细胞增殖与分化、形态发生以及轴突导向的分子机制。
在卵内 电穿孔技术在过去二十年中已成功用于将外源基因导入发育中的鸡胚细胞。该技术可用于标记发育中的细胞、细胞命运示踪、细胞迁移及轴突投射路径追踪，以及外源基因表达研究 体内 基因功能分析。条件 在卵内 电穿孔法在鸡胚中实现高效异位基因表达已得到充分建立1,2,3.
尽管具有上述优势，缺乏一种稳定的基因功能缺失研究技术一直是鸡胚研究中的主要技术局限。将小干扰RNA（siRNAs）电穿孔导入鸡胚后4 或短发夹RNA（shRNA）的表达载体5 显示靶基因的敲低，但这些方法中的基因抑制是瞬时的，因为一旦细胞丢失了导入的RNA或DNA，抑制效应便会消失。通过RCAS将siRNA递送至鸡胚，可实现更稳定的基因抑制R复制 C感受态 A禽肉瘤-白血病病毒（ASLV）长末端重复序列（LTR）带有 Splice acceptor）逆转录病毒系统6病毒载体整合到宿主基因组中，外源基因得以稳定表达。然而，逆转录病毒仅能在细胞周期的有丝分裂（M）期将基因组整合至分裂细胞中，这可能限制了该功能缺失研究方法在特定发育阶段和/或细胞类型中的应用。此外，RCAS介导的转基因表达较其他方法诱导的表达更缓慢且强度较低。 在卵内 电穿孔7.
转座子是一类能够在基因组中从一个位置移动到另一个位置的遗传元件。Tol2 元件属于 hAT 转座子家族，其内部含有一个编码转座酶的基因，该转座酶可催化 Tol2 元件自身的转座反应8。当将携带由 Tol2 元件左右末端序列（分别为 200 bp 和 150 bp）所侧翼包围的基因表达盒的质粒载体，与 Tol2 转座酶表达载体共同导入脊椎动物细胞时，该表达盒会从质粒上被切除并整合到宿主基因组中，从而实现外源基因的稳定表达（图 1）。研究表明，Tol2 转座子在多种脊椎动物中均能高效介导基因转座，包括斑马鱼9,10、青蛙11、鸡12和小鼠13，因此是一种有效的转基因和插入诱变方法。Tol2 转座子系统已被成功用于通过将可加工成长链双链 RNA 的 siRNA 整合到基因组中，实现对靶基因的条件性敲低14。
本方案描述了一种在鸡胚中实现基因功能缺失的研究方法，该方法通过Tol2转座子系统引入人工微小RNA（miRNAs）15,16. 在该方法中，将针对目的基因的 EmGFP（翠绿色荧光蛋白）标记和人工 miRNA 的表达盒克隆至 Tol2 转座子载体中。随后，通过将 Tol2 转座子构建体与 Tol2 转座酶表达构建体共同导入鸡胚视网膜中 在卵内 电穿孔。在转染的视网膜细胞中，转座酶催化表达盒从转座子载体上切除，并将其整合到宿主染色体中，从而实现miRNA和EmGFP蛋白的稳定表达。在我们之前的研究中，已成功在发育中的鸡视网膜中敲低了Nel的表达——一种主要在神经系统中表达的细胞外糖蛋白（见 代表性结果。我们的结果表明，可以实现稳定且高效的基因抑制 在卵内 通过该技术。
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方案
1. miRNA 表达载体的构建
注意：构建miRNA表达载体的步骤（步骤1.1–1.3、1.5–1.6）已针对miRNA表达试剂盒进行优化，即Block-iT Pol II miR RNA表达试剂盒（含EmGFP），如先前所述15,16。该试剂盒提供用于miRNA表达的表达载体（pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA）、对照载体（pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-阴性对照质粒）、辅助试剂以及制备miRNA表达载体的操作说明（参见材料表）17。
- 设计编码靶基因pre-miRNA的单链DNA寡核苷酸：设计单链DNA寡核苷酸（"上链" 寡核苷酸（靶向pre-miRNA）以及 "底链" 寡核苷酸（正义链寡核苷酸的互补链）使用在线工具 RNAi Designer（见 材料表）。参见 图2 单链寡核苷酸所需具备的特征（图2A）以及靶序列的示例（图2B).
注意：建议针对特定靶基因设计 5-10 条 pre-miRNA 序列，并筛选其敲低活性 体外 （步骤 1.4） - 顶部链与底部链寡核苷酸退火以生成双链寡核苷酸
- 设置以下变性反应（表1在无菌的0.5 mL 微量离心管
- 在95 °C下孵育反应混合物4分钟。通过将反应混合物冷却至室温（RT）5–10分钟，使上链和下链寡核苷酸退火，形成双链寡核苷酸。短暂离心样品（约5秒）。
注意：退火后的寡核苷酸在 -20 °C 下可保存至少一年而不会降解。
- 将双链寡核苷酸克隆至miRNA表达载体（pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA（来自miRNA表达试剂盒））：根据生产商说明书，将各个双链寡核苷酸克隆至线性化的miRNA表达载体中17.
- 基因敲低效果的评估
注意：建议对单个miRNA序列进行基因抑制效率的检测 体外 在应用之前 在卵内敲低效率可通过将miRNA表达质粒转染至表达靶基因的细胞系中进行检测。或者，可将单个miRNA表达质粒与靶基因表达载体共转染至细胞系中。对于编码非膜锚定状态蛋白的靶基因（例如可溶性蛋白），可使用碱性磷酸酶（AP）融合蛋白来监测靶蛋白的表达。可将编码靶蛋白的cDNA序列在AP-tag载体（APtag-1至APtag-5；见 材料表）并导入细胞中18当在培养细胞（例如HEK293T细胞）中表达时，AP标记的目标蛋白会高水平分泌至培养基中，因此可通过检测转染miRNA的细胞培养基中AP活性的降低来评估miRNA序列的敲低效果（步骤1.4.1–1.4.4）。- 在24孔板中培养HEK293T细胞（8 × 10⁵）4 细胞/孔）过夜培养。使用各自的miRNA表达载体和AP标记靶蛋白的表达质粒对细胞进行瞬时转染。以miRNA表达试剂盒中提供的pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-阴性对照质粒作为对照。（若使用稳定表达AP标记靶蛋白的细胞系，则仅转染各自的miRNA表达载体。）
注意：一种常规的脂质转染试剂（参见 材料表用于转染。 - 转染后48-72小时收集条件培养基，于65 °C水浴中加热5分钟以灭活内源性碱性磷酸酶（AP）活性。随后在台式微量离心机中以最大速度离心5分钟，去除碎片。
- 用10 mM HEPES（pH 7.0）缓冲液调节上清液，并通过0.45 µm滤膜过滤。
- 取100 µL（用于酶标仪检测）或500 µL（用于分光光度计检测）上清液，加入等体积的2x AP底物缓冲液（表2）。通过测量OD值检测AP活性405 在酶标仪或分光光度计中。
注意：如果条件培养基中的碱性磷酸酶（AP）活性过高而无法准确测量，可用HBAH缓冲液（Hanks平衡盐溶液（HBSS）、0.5 mg/mL牛血清白蛋白、20 mM HEPES（pH 7.0））或其他含有载体蛋白的缓冲液进行稀释。请勿使用含磷酸盐的缓冲液（如PBS），因为无机磷酸盐会作为AP的竞争性抑制剂。
- 在24孔板中培养HEK293T细胞（8 × 10⁵）4 细胞/孔）过夜培养。使用各自的miRNA表达载体和AP标记靶蛋白的表达质粒对细胞进行瞬时转染。以miRNA表达试剂盒中提供的pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-阴性对照质粒作为对照。（若使用稳定表达AP标记靶蛋白的细胞系，则仅转染各自的miRNA表达载体。）
- miRNA序列连接
注意：通过针对同一靶基因串联不同的miRNA或重复使用相同的miRNA，可增强基因敲低效果。miRNA表达载体支持多个pre-miRNA序列的串联及其共线性表达。17.- 将两种针对同一靶基因且具有最高敲低活性的不同pre-miRNA序列串联起来 体外 根据制造商说明书进行检测（步骤1.4）17.
- 使用串联构建体评估基因抑制效率 体外 如步骤1.4所述进行检测。若三种或更多pre-miRNA序列表现出相似的高敲低活性，则测试不同两种序列的组合，并选用表现出最高敲低活性的组合（参见 代表性结果).
- 将 EmGFP-pre-miRNA 表达盒转移至 Tol2 转座子载体
注意：包含 EmGFP cDNA 和两个 pre-miRNA 序列的表达盒被转入 Tol2 转座子载体（pT2K-CAGGS 载体，参见 材料表）。为此，使用带有人工限制性酶切位点的引物，通过PCR扩增表达盒（包含从CMV启动子3'端至miRNA表达载体中miRNA反向测序引物位点的区域），并将PCR产物克隆至Tol2转座子载体中。Tol2转座子载体包含普遍性CAGGS启动子，可驱动插入表达盒的表达。CAGGS启动子与表达盒两侧均被Tol2序列所包围（图1).- EmGFP-pre-miRNA 表达盒的 PCR 扩增：按照文中所述的反应体系和热循环条件进行 表3.
- 将凝胶纯化的PCR产物（约1.3 kb）连接至经限制性内切酶消化的Tol2转座子载体中。将质粒电转化至感受态E. coli细胞中（参见 材料表）并筛选重组子（pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA 重组质粒）。
- 使用常规质粒大提物试剂盒制备质粒（参见 材料表通过限制性酶切图谱分析以及使用PCR所用引物分别检测质粒的结构和序列。
2. 卵的保存与孵化
- 从当地农场或商业供应商处购买受精的白来航鸡（Gallus gallus）鸡蛋。
注意：在孵化前，鸡蛋可在12–16 °C或4 °C下保存最多1周，不会显著降低活力，也不会在孵化过程中延迟发育。 - 用孵化起始日期标记鸡蛋，并标出鸡蛋的上方（即胚胎将位于的一侧）。将受精蛋水平放置于38 °C条件下孵化，直至胚胎达到Hamburger和Hamilton（HH）10期（33–38小时）至11期（40–45小时）19。
3. 在卵内 电穿孔
- 准备 在卵内 电穿孔
- 0.25%快绿溶液的配制：将25 mg快绿FCF溶解于10 mL PBS中，使用0.2 µm针头滤器过滤溶液。该溶液可在室温下保存。
- DNA 混合液：将各自的 pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA 质粒（步骤 1.6.3）与 Tol2 转座酶表达质粒（pCAGGS-T2TP 载体；参见 材料表)（各5 µg/µL）按2:1的比例混合。加入1/10体积的0.25%快绿溶液以显示注射区域。
注意：最佳DNA浓度可能因载体构建的不同而有所变化。 - 设置显微注射装置（图3A，B）：显微注射装置包括以下部分（参见 材料表）：汉密尔顿注射器，18 G 针头（针头长度 = 2"），聚氯乙烯（PVC）管（2 cm 长），微量移液针（可用微量移液针拉制仪拉制欧米伽点纤维毛细管（外径 1 mm × 内径 0.75 mm）制成）。
- 用重矿物油填充 Hamilton 注射器。将18 G针头连接至注射器，并推动注射器活塞，使针头内部充满矿物油。
- 连接一段 2 cm 长的 PVC 将管路连接到针头末端，并用油填充管路。
- 将拉制的微玻璃针连接到管路上。使用精细镊子将微玻璃针尖端折断，使其开口直径为10–20 µm，形成一个小孔。用油完全填充整个针头。
注意：应避免在系统中残留任何气泡，因为气泡会阻碍DNA溶液的流动。
- 将5 µL有色DNA混合液（步骤3.1.2）置于无菌培养皿中。在解剖显微镜下，将微量移液器针头的尖端插入无菌培养皿中的DNA溶液内 培养皿，并缓慢将溶液吸入针头中。
- 等待针头内外压力平衡（以避免空气进入针头），然后将针头尖端从DNA溶液中取出。在注射前，将针头尖端保持浸没在小烧杯中的无菌PBS中。
- 设置 电穿孔仪（图3A，C):
- 设置一对铂电极 使用微操纵器上的电极夹持器，调节电极尖端之间的间距至2 mm（图3C，E).
- 将电极通过电缆连接至方波脉冲发生器（参见 材料表).
- DNA 溶液的显微注射（图3D)
- 从孵育箱中取出一枚鸡蛋，用浸有70%乙醇的纸巾擦拭蛋壳表面。
- 将18号针头连接至10 mL注射器上。将针头从鸡蛋的钝端插入，向下倾斜45°角，以避免损伤蛋黄。
- 从蛋中抽出 2–3 mL 的白蛋白。用一片透明胶带封住小孔。通过以下步骤确认胚胎和卵黄膜已与蛋壳分离： "照蛋" 用光照射卵
- 使用剪刀和镊子从鸡蛋顶部移除一块直径约2-3 cm的蛋壳，以暴露胚胎。每次开窗的鸡蛋不得超过五个，以防止电穿孔过程中胚胎干燥。
注意：如果难以在不破坏蛋壳的情况下打开窗口，可在移除部分蛋壳前，用透明胶带（Sellotape 或 Scotch tape）覆盖整个蛋的顶部。 - 从视泡近端一侧以45°角将针尖插入视泡内，缓慢按压（或轻敲）推进器，注入DNA混合液，直至蓝色溶液充满腔隙图 3D).
注意：或者，可使用压力显微注射系统（参见 材料表可用于注射DNA溶液。 - 撤出针头，并将其尖端重新放回 PBS 中。
- 电穿孔（Electroporation）图3E)
- 电穿孔仪脉冲参数设置如下：电压：15 V，脉冲时长：50 ms，脉冲间隔：950 ms，脉冲次数：5
- 在胚胎上方的卵黄膜上加入数滴HBSS。使用显微操作器将电极垂直于胚胎的头尾轴方向缓缓浸入HBSS中。
注意：或者，也可不添加 HBSS 进行此操作，因为白蛋白具有良好的导电性，可实现高效的电穿孔。 - 将电极放置在视泡的两侧（前侧（鼻侧）和后侧（颞侧））图3E）。确保电极不接触胚胎或血管。施加脉冲电场。
- 移除电极，并用浸有水的无菌棉签轻轻清洁电极，以避免白蛋白积聚。
- 用透明胶带密封窗口，并将胚胎重新放回培养箱中继续孵育至所需发育阶段。
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结果
构建用于表达靶向Nel的人工miRNA的Tol2转座子载体
Nel (N神经的 E表皮生长因子（EGF）-Like（也称为Nell2）是一种细胞外糖蛋白，其结构与血小板反应蛋白-1具有相似性，主要在神经系统中表达。20,21我们先前已证明，Nel 调控视网膜神经节细胞的分化与存活15 并作为视网膜轴突的抑制性导向信号22,23,24在发育中的鸡视网膜中，Nel 的表达于 HH15 期（胚胎第 (E) 2.5 天）在预定色素上皮区域被检测到。至 HH20 期（E3.5），Nel 的表达也在新分化的视网膜神经节细胞中出现。Nel 在色素上皮和视网膜神经节细胞中的强表达至少持续至 E18
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讨论
本方案通过在鸡胚视网膜发育过程中利用in ovo电穿孔及Tol2转座子系统进行人工miRNA的转基因表达，提供了基因沉默的详细操作指南。
以下因素对于成功实施该技术至关重要。首先，必须使用经证实可产生显著敲低效果的miRNA序列。在将其应用于 在卵内 电穿孔，测试单个pre-miRNA序列在基因沉默效率中的作用 体外 检测（步骤1.4）以及两条显示最高敲低活性的pre-miRNA序列（步骤1.5）。其次，在插入显微注射针以注入DNA溶液时，必须注意不要损伤视泡及其周围神经组织。对胚胎造成过度损伤可能导致胚胎畸形或死亡。为避免组织损伤，应以正确方向将显微注射针插入视泡。较细且更尖锐的针尖有助于更顺畅地穿透视泡，从而减少组织损伤。然而，针尖过细的注射针在加载和释放DNA溶液时可能存在困难。在本研究中，采用针尖开口直径为10–20 µm的注射针。第三，确保DNA溶液完全充满整个视泡（可通过快绿染料的扩散范围进行观察）。第四，将电极置于最佳位置，以使DNA靶向至视泡的特定区域（例如，颞侧或鼻侧）。带负电荷的DNA分子将向阳极方向移动，因...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
pT2K-CAGGS 和 pCAGGS-T2TP 载体分别由 Yoshiko Takahashi（日本京都大学，京都，日本）和 Koichi Kawakami（日本遗传学国立研究所，三岛，日本）惠赠。我们感谢 Michael Berberoglu 对稿件的重要审阅。本工作获得了英国皇家学会和生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）向 M.N. 提供的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 18 G 针头，2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG 试剂盒 A 和 AP-TAG 试剂盒 B | GenHunter Corp | Q201 和 Q202 | 用于构建 AP 融合蛋白的质粒载体（https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html） |
| Block-iT RNAi 设计工具 | Invitrogen | 一种在线工具，用于选择靶序列并设计 pre-miRNA 序列（https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/） | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB 电缆 | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 电缆 | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| 带 omega 点纤维的毛细管（微移液针） | FHC | 30-30-1 | 外径 1 mm，内径 0.75 mm |
| CUY21 方波电穿孔仪 | Nepa Gene | CUY21 | |
| 二乙醇胺（pH 9.8） | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| 解剖显微镜 | |||
| 孵蛋器 | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| 电极夹持器 | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| 电极 | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | 电转化感受态大肠杆菌细胞 |
| 亮蓝 FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| 受精鸡卵（Gallus gallus） | 从商业供应商（例如 Charles River）或本地农户处获得 | ||
| 鹅颈式光纤光源 | |||
| FuGene 6 转染试剂 | Promega | E2691 | |
| Hamilton 微量注射器（50 μL） | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton 货号 80901 |
| Hanks' 平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| 重矿物油 | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-高精氨酸 | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl₂ | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| 显微操作仪 | Narishige（日本） | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| 微移液管拉制仪 | Shutter Instrument | P97 | |
| 对硝基苯磷酸盐 | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP 载体 | Tol2 转座酶表达质粒。由日本遗传学研究所河上晃一慷慨惠赠。也可从 Addgene 获取。 | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer（可选） | Parker | 压力微注射系统 | |
| 质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12163 | 质粒大提纯试剂盒 |
| pT2K-CAGGS 载体 | Tol2 转座子载体。由日本京都大学高桥佳子惠赠 | ||
| PVC 管路 | VWR（英国） | 228-3830 | |
| 壮观霉素 | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA 连接酶 | Promega | M1801 | |
| BLOCK-iT Pol II miR RNA 表达试剂盒（含 EmGFP） | Invitrogen | K493600 | 包含 miRNA 表达载体（pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA）、对照载体（pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-阴性对照质粒）、辅助试剂及说明书（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00） |
| PCR 仪 |
参考文献
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