本文展示了一种通过小切口在小鼠体内建立急性缺血的高效手术方法。该方法无需对实验室进行任何升级改造，大多数研究团队均可应用。
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摘要
摘要
本研究旨在介绍并评估一种改良的小鼠急性缺血诱导手术方法，该方法可在大多数动物实验室中实施。 与传统的股动脉双结扎法（DLFA）不同，本方法仅在右侧腹股沟区域做一较小切口，以暴露近端股动脉（FA）并实施双结扎。随后，使用7-0缝线将切口向膝部方向牵拉，以暴露远端股动脉（FA）。术后采用双侧后肢磁共振成像（MRI）检测股动脉闭塞情况。术后0、1、3、5和7天，通过Tarlov评分对后肢功能恢复情况进行视觉评估和分级。在双结扎术后7天处死动物，进行组织学评估。该手术在10只ApoE-/-小鼠的右后肢成功实施，术后观察期间无小鼠死亡。所有10只小鼠的切口长度均小于5 mm（4.2 ± 0.63 mm）。MRI结果显示，缺血侧股动脉血流明显阻断。Tarlov评分结果表明，手术后小鼠后肢功能显著下降，并在随后的7天内缓慢恢复。组织学评估显示，缺血侧出现显著的炎症反应，且缺血后肢的微血管密度降低。综上所述，本研究介绍了一种采用微小切口实施股动脉双结扎以建立后肢缺血（HLI）模型的改良技术。
引言
目前在血管疾病（如外周动脉疾病（PAD））的研究中，尚缺乏满足需求的临床前动物模型。尽管在诊断和治疗方面已取得显著进展，2018年全球PAD患者仍超过2亿人1，且患者数量持续增长。尽管已有多种新型治疗策略被报道2,3,4,5,6,7，但这些治疗方法成功转化为临床应用仍面临巨大挑战。因此，迫切需要建立可靠且具有临床相关性的in vivo实验模型，以模拟人类疾病的病理状态，从而深入研究这些新型治疗手段在治疗PAD中的潜在机制和有效性6,7。
高脂血症和动脉粥样硬化（AS）是外周动脉疾病（PAD）发生的主要危险因素。载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠在高脂饮食条件下表现出脂肪代谢异常和高脂血症，并继而形成动脉粥样硬化斑块，因此ApoE-/-小鼠是模拟临床相关PA....
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方案
注意：所有实验操作均按照欧盟指南 EC 2010/63/EU 进行，并已获得德国当地法律法规的批准（35-9185.81/G[1]239/18）。使用十只雄性 ApoE-/- C57BL/6J 背景的小鼠，体重为 29.6–38.0 g，在 12 小时光照/12 小时黑暗循环条件下饲养，并饲喂西方饮食（含 1.25% 胆固醇和 21% 脂肪）和水 随意摄取 持续12周，从8周龄开始。在20周龄小鼠上按如下所述进行HLI手术。
1. 在ApoE-/-小鼠中诱导HLI
- 准备手术所需的设备和工具（参见材料表和图1）。 使用前通过高压灭菌法对手术器械进行灭菌，并在手术过程中使用玻璃珠灭菌器。
- 在所有手术操作前，通过皮下注射（S.C.）给予小鼠咪达唑仑（5 mg/kg）、美托咪啶（0.05 mg/ml/kg）和芬太尼（0.5 mg/kg）混合物进行麻醉。
- 麻醉起效后，使用兽用眼膏涂抹眼睛以防止干燥，并确认前肢和后肢无足底回缩反射。
- 随后将小鼠置于加热垫上，以维持核心体温在约37 °C。使用棉签和脱毛膏，小心清除右侧后肢皮肤上的毛发。
注意：脱毛膏应足量使用，覆盖整个后肢，尤其是将要切开的腹股沟区....
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结果
ApoE-/- 小鼠的特征
成功对10只小鼠实施了DLFA手术以建立HLI模型，术后无小鼠死亡。为追踪体重变化，分别在DLFA手术前（术前）和手术后7天（术后）对小鼠进行称重。术前体重范围为29.6至38.0 g（平均值34.74 ± 2.47 g），术后体重范围为26.5至34.1 g（平均值30.77 ± 2.15 g），显著低于术前体重（P < 0.05，图3A）。手术时间范围为15至47分钟（平均34.2 ± 8.82分钟，不包括麻醉时间）。10只小鼠的切口大小范围为3至5 mm（平均4.2 ± 0.63 mm）。
MRI 扫描与功能恢复
MRI 扫描非常清晰地表明，右侧股动脉近端和远端区域无灌注（图 3C），说明该方法成功建立缺血模型。术后第 1 天，Tarl.......
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讨论
本研究报道了一种改良的、简化的且手术效率更高的方法，通过3-4 mm的切口对ApoE-/-小鼠股动脉（FA）近端和远端进行双重结扎，以建立下肢缺血（HLI）模型，且无需对实验室设备进行任何升级。该方法的主要特点是与此前报道的小鼠HLI模型研究8,9,10,11,12,15,20,22,23,24相比，切口更小。
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披露
作者声明，本文内容的撰写不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系。
致谢
作者感谢 Viktoria Skude、Alexander Schlund 和 Felix Hörner 提供的出色技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10倍磷酸盐缓冲液 | Roth | 9143.1 | 用于苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色 |
| 30% H2O2 | Roth | 9681.2 | 用于免疫组织化学染色 |
| 6-0 可吸收缝线 | PROLENE | 8776H | 用于皮肤缝合 |
| 6-0 可吸收缝线 | PROLENE | EP8706 | 用于手术 |
| 7-0 可吸收缝线 | PROLENE | EH8021E | 用于结扎动脉 |
| 7-0 可吸收缝线 | PROLENE | EP8755 | 用于手术 |
| 乙酸 | Roth | 6755.1 | 用于苏木精-伊红染色 |
| 白蛋白 V 组分 | Roth | 8076.2 | 用于免疫组织化学染色 |
| 高压灭菌器 | Systec GmbH | Systec VX-150 | 用于手术器械的灭菌 |
| Axio vert A1 显微镜 | Carl Zeiss | ZEISS Axio Vert.A1 | 用于观察和拍摄苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色图像 |
| Bruker BioSpec 94/20 AVIII | Bruker Biospin MRI GmbH | N/A | 扫描股动脉阻塞情况 |
| Buprenovet Sine 0.3 mg/ml | Bayer AG | 2542 (WDT) | 用于术后镇痛管理。剂量：每8小时按0.1 mg/kg体重给药，持续48小时 |
| CD31 抗体 | Abcam | ab28364 | 用于免疫组织化学染色 |
| 伊红Y水溶液（0.5%） | Roth | X883.1 | 用于苏木精-伊红染色 |
| pH 6 抗原修复液 | Leica Biosystems | 6046945 | 用于免疫组织化学染色 |
| 乙醇 ≥ 99.5% | Roth | 5054.1 | 用于苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色 |
| 芬太尼 | Cayman Chemical | 437-38-7 | 用于麻醉 |
| 精细尖头镊子 | Medixplus | 93-4505S | 用于分离动脉与神经和静脉 |
| 玻璃珠灭菌器 | Simon Keller | Type 250 | 用于手术器械的灭菌 |
| 弯头Graefe虹膜镊 | VUBU | VUBU-02-72207 | 用于钝性分离皮肤和皮下组织 |
| 脱毛膏，Veet（含芦荟） | Reckitt Benckiser | 108972 | 去除小鼠后肢毛发 |
| 加热板 | STÖRK-TRONIC | 7042092 | 维持小鼠体温稳定 |
| 苏木精 | Roth | T865.2 | 用于苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色 |
| Leica 手术显微镜 | Leica | M651 | 放大视野以方便手术操作 |
| 液体DAB+底物显色系统 | Dako | K3468 | 用于免疫组织化学染色 |
| 雄性ApoE-/-小鼠 | Charles River Laboratories | N/A | 用于建立外周动脉疾病小鼠模型 |
| 美托咪定 | Cayman Chemical | 128366-50-7 | 用于麻醉 |
| 微型持针器 | Black & Black Surgical | B3B-18-8 | 用于夹持缝合针 |
| 微型打结镊 | Life Saver Surgical Industries | PS-MSF-145 | 用于辅助手术中打结 |
| 切片机 | Biobase | Bk-Mt268m | 用于组织切片 |
| 咪达唑仑 | Ratiopharm | 44856.01.00 | 用于麻醉 |
| 磁共振兼容小型动物监测与门控系统，型号1025 | SA Instruments | N/a | 在MRI扫描期间监测动物生命体征 |
| 无色Octeniderm | Schülke & Mayr GmbH | 180212 | 用于皮肤消毒 |
| 眼鼻用软膏 | Bayer AG | 1578675 | 在麻醉期间保持眼睛湿润 |
| 多聚甲醛 | Roth | 0335.1 | 用于组织固定 |
| 戊巴比妥 | Nembutal | 76-74-4 | 用于麻醉 |
| 生理盐水 | DeltaSelect | 1299.99.99 | 用于麻醉 |
| 弹簧手柄精细尖头剪刀 | Black & Black Surgical | B66167 | 用于剪切动脉 |
| SuperCut 剪刀 | Black & Black Surgical | B55992 | 用于剪切皮肤 |
| 曲拉通X-100 | Roth | 9002-93-1 | 用于免疫组织化学染色 |
| 西方饮食，含1.25%胆固醇 | ssniff Spezialdiäten GmbH | E15723-34 | 小鼠饲料 |
| 二甲苯 | Roth | 4436.3 | 用于苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色 |
参考文献
- Shu, J., Santulli, G. Update on peripheral artery disease: Epidemiology and evidence-based facts. Atherosclerosis. 275, 379-381 (2018).
- Tateishi-Yuyama, E., et al. Therapeutic ....
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