使用脂质纳米颗粒将化学修饰的mRNA递送至哺乳动物细胞

摘要

本方案介绍了化学修饰mRNA的体外转录（IVT）、阳离子脂质体的制备，以及利用脂质体介导的mRNA转染在哺乳动物细胞中的功能分析。

摘要

近年来，化学修饰的信使RNA（mRNA）作为一种高效的核酸分子，已广泛应用于多种治疗领域，包括新型疫苗、蛋白质替代疗法和免疫疗法。在各类递送载体中，脂质纳米颗粒被证明在递送RNA分子（如siRNA、miRNA、mRNA）方面更安全且更有效，已有部分产品进入临床应用。为展示脂质纳米颗粒介导的mRNA递送技术，本文提供了一种优化的实验方案，涵盖功能化me1Ψ-UTP修饰的eGFP mRNA的合成、阳离子脂质体的制备、mRNA与阳离子脂质体的静电复合物形成，以及在哺乳动物细胞中转染效率的评估。结果表明，这些修饰在与阳离子脂质体共同递送时能显著提高mRNA的稳定性，并增强eGFP mRNA在哺乳动物细胞中的翻译效率和稳定性。该方案可用于合成目标mRNA，并利用阳离子脂质体实现其在哺乳动物细胞中的目的基因表达。

引言

作为一种治疗分子，mRNA 由于其非整合特性以及能够转染非分裂细胞，在与质粒 DNA（pDNA）相比时具有多项优势¹。尽管早在20世纪90年代初就已实现mRNA递送，但由于其稳定性差、无法激活免疫反应以及翻译效率低下，其治疗应用曾长期受限²。近年来发现的化学修饰，例如在mRNA上引入假尿苷5'-三磷酸（Ψ-UTP）和1-甲基假尿苷5'-三磷酸（me1Ψ-UTP），有助于克服这些局限性，推动了mRNA研究的革新，从而使mRNA成为基础与应用研究中极具前景的工具。其应用范围涵盖诱导多能干细胞（iPSCs）的生成、疫苗开发以及基因治疗等领域^3,4。

随着mRNA技术的进步，非病毒递送系统也取得了重大进展，使得mRNA的递送更加高效，从而使该技术在多种治疗应用中具备可行性⁵。在非病毒载体中，脂质纳米颗粒已被证明在递送核酸方面具有显著效果^6,7。最近，Alnylam公司开发的基于脂质的siRNA药物已获得美国FDA批准，用于治疗肝脏疾病，包括用于遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性（hATTR淀粉样变性）的Patisiran，以及用于急性肝性卟啉症（AHP）的Givosiran⁸。在COVID19大流行期间，辉瑞-BioNTech和Moderna公司开发的脂质包裹mRNA疫苗展示了其有效性，并获得FDA批准^9,10。因此，基于脂质的mRNA递送技术具有巨大的治疗潜力。

本文详细描述了一种化学修饰的体外转录eGFP mRNA的制备方案、阳离子脂质体的制备、mRNA-脂质复合物的优化以及将其转染至哺乳动物细胞中的方法（图1）。

方案

1. me1 Ψ-UTP 修饰 mRNA 的制备

1. 体外转录（IVT）DNA模板制备
   注意：为制备体外转录（IVT）DNA模板（含T7启动子-目的基因的开放阅读框（ORF）），需设计一对针对目的基因的特异性引物。在基因特异性正向引物前添加T7启动子序列（5'-NNNNNNTAATACGACTCACTATAGGGNNNNNN-3'）。
   1. 按照所述方法配制PCR反应混合液 表1.
      注意：为提高体外转录（IVT）的DNA模板浓度和质量，至少需进行四次PCR反应。
   2. 使用微量移液器将反应混合物充分混匀，并用微量离心机离心。
   3. 运行所提供的PCR循环程序 表2 在热循环仪上。
2. 通过有机萃取/乙醇沉淀法纯化体外转录DNA模板
   1. 使用无RNA酶的1.5 mL离心管，用经DEPC处理的水将扩增的PCR反应体系调整至总体积200 µL。
   2. 加入200 µL TE饱和酚/氯仿（pH 8.0），剧烈涡旋振荡10秒。
   3. 在12,000 × g下离心5分钟以分离各相，然后将上层水相（约200 µL）转移至新的1.5 mL微量离心管中。
   4. 加入1/10^th 加入20 µL 3 M乙酸钠（pH 5.5）和两倍体积（400 µL）的99–100%乙醇，充分混匀后于-20 °C孵育至少30分钟。
   5. 在4 °C下以12,000 × g离心15分钟，使DNA模板沉淀。
   6. 使用微量移液器小心移除上清液，切勿扰动沉淀。
   7. 向沉淀中加入0.5 mL 75%乙醇，颠倒混匀5–10次。
   8. 在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 2 分钟。随后用移液器彻底去除乙醇，注意勿扰动 DNA 沉淀。
   9. 将沉淀物在室温下干燥，直至其略微呈现半透明状。
   10. 加入20 µL无核酸酶水，充分重悬数秒。
3. 体外转录DNA模板纯化后的质量控制
   1. 定量分析
      1. 使用微量分光光度计测定纯化的体外转录DNA模板的浓度和质量。
         注意：预期的DNA浓度约为300–600 ng/µL。长期保存请将体外转录（IVT）DNA模板置于-20 °C。
   2. DNA琼脂糖凝胶电泳
      注意：本实验旨在验证纯化的体外转录DNA模板是否具有正确的大小，并且不含非特异性产物污染。
      1. 制备1%琼脂糖凝胶，称取0.5 g琼脂糖加入锥形瓶中，加入50 mL 1x TAE缓冲液，微波加热至琼脂糖完全溶解。室温冷却5分钟。
      2. 向50 mL琼脂糖溶液中加入1 µL核酸染料（SafeView染料）。
      3. 将琼脂糖溶液倒入带有梳子的凝胶制备托盘中，静置直至凝胶完全凝固。
      4. 从凝胶中取出梳子，将凝胶保留在含1x TAE缓冲液的电泳槽中。
      5. 将10 µL的100-10000 bp DNA Ladder与100-200 ng的PCR纯化模板产物混合，加入2 µL的6x DNA上样缓冲液，总体积为12 µL。
      6. 将每个样品加入相应的孔中，在100 V电压下电泳至少45-60分钟。
      7. 在凝胶成像系统上观察DNA条带图2).
4. 合成me1Ψ-UTP修饰的RNA
   ​注意：实验开始前，应使用含70%乙醇的DEPC处理水清洁工作区域（层流空气罩）。使用无菌、无核酸酶和无内毒素的低吸附管及带滤芯的吸头。操作过程中应频繁用70%乙醇喷洒手套表面。
   1. 按照所提供的方案配制体外转录（IVT）反应混合物 表3 在0.2 mL离心管中于室温下用微量移液器充分混匀。
   2. 在微型离心机中离心10秒。
   3. 在37 °C下于热循环仪中孵育3小时。
5. DNase 1 处理降解体外转录DNA模板
   1. 向体外转录反应体系中加入1 µL浓度为1 U/µL的DNase 1（无RNase），在37 °C孵育30分钟。
6. RNA的有机提取/醋酸铵沉淀纯化
   1. 用179 µL经DEPC处理的水将体外转录（IVT）反应体系调整至200 µL。
   2. 加入200 µL TE饱和酚/氯仿（pH 8.0），涡旋振荡10秒。
   3. 在25 °C下以12,000 × g离心5分钟，以分离两相。
   4. 将水相上层（200 µL）转移至1.5 mL离心管中，加入200 µL 5 M醋酸铵。充分混匀后置于冰上孵育15分钟，以沉淀RNA。
   5. 在4 °C条件下，以12,000 × g离心15分钟，使沉淀的RNA成团，然后用微量移液器完全去除上清液。
   6. 用70%乙醇洗涤RNA沉淀，颠倒混匀5-10次。在4 °C下以12,000 x g离心5分钟。
   7. 用移液枪完全吸除上清液，注意不要扰动RNA沉淀。
   8. 将沉淀在室温下干燥至半透明状态，然后用60–75 µL无RNase的水重新悬浮沉淀。
7. 纯化RNA的质量控制
   1. 定量分析
      1. 使用微量分光光度计测定纯化后RNA的浓度和质量。
         注意：每反应未修饰RNA的预期产量为140–180 µg，me1Ψ-UTP修饰RNA的预期产量为100–150 µg，具体产量取决于目的基因的大小和体外转录（IVT）DNA模板的质量。最佳质量应为OD₂₆₀/OD₂₈₀ 比值约为 1.9-2.0 且 OD₂₆₀/ OD₂₃₀ 比率 >2.0. 短期储存RNA于-20 °C。
   2. 变性RNA琼脂糖凝胶电泳
      ​注意：本实验旨在验证合成的RNA是否具有正确的长度，并且不含体外转录（IVT）副产物污染。
      1. 制备1%琼脂糖凝胶，将0.5 g琼脂糖和50 mL 1×TAE缓冲液加入锥形瓶中，微波加热至琼脂糖完全溶解。将琼脂糖溶液于室温放置5分钟，冷却。
      2. 向50 mL 1%琼脂糖溶液中加入1 µL核酸染料。
      3. 将琼脂糖溶液倒入带有梳子的凝胶制备托盘中，静置直至凝胶完全凝固。
      4. 从凝胶中取出梳子，并将凝胶保留在含1x TAE缓冲液的电泳槽中。
      5. 按照所述方法制备RNA上样染料样品 表4.
      6. 将样品在 65 °C 下加热 10 分钟，然后置于冰上冷却。
      7. 将每个样品分别加入对应的加样孔中，以100 V电压运行至少45-60分钟。
      8. 在凝胶成像系统上观察RNA条带图3).
8. 通过酶法加帽合成me1Ψ-UTP修饰的mRNA & 多聚A加尾
   注意：使用酶法对体外转录（IVT）RNA进行加帽的效率为100%。因此，本实验方案中采用酶法在mRNA合成过程中引入Cap-1结构。我们添加了长度为 >每分子150个碱基，以提高mRNA的翻译效率。
   1. 在1.5 mL离心管中加入55–60 µg纯化的IVT RNA，并用无RNase水定容至72 µL。
   2. 在65 °C下于恒温混匀仪中变性RNA 10分钟，然后立即将离心管置于冰上孵育5分钟。
   3. 同时，按下表配制加帽反应混合液 表5.
   4. 将加帽反应混合物和4 µL加帽酶加入变性的RNA中，用微量移液器充分混匀。在微量离心机中离心10秒。
   5. 在37 °C下孵育反应混合物2小时。
   6. 2小时后，将离心管置于冰上，并按如下配制Poly A加尾主混合液 表6.
   7. 将Poly A加尾主混合液加入带帽的RNA溶液中，用微量移液器充分混匀。在微量离心机中离心10秒。
   8. 在37 °C下孵育反应混合物2小时。
      注意：mRNA 可立即进行进一步纯化，或粗制 mRNA 可在 -20 °C 保存过夜。
9. 体外转录mRNA纯化
   1. 按照第1.6节方案中的有机萃取/乙酸铵沉淀法纯化mRNA。
   2. 用60 µL无RNase的水重悬mRNA沉淀。
10. 纯化mRNA的质量控制
    1. 按照第1.7节方案中所述的质量控制方案进行操作。
       注意：由于添加了Poly-A尾，在变性RNA琼脂糖凝胶电泳中，mRNA条带应出现在RNA条带的上方图3）。此外，加尾修饰（Poly-A尾）可提高mRNA产量（应为 > RNA浓度）。定量后，将mRNA分装成多份，每份浓度为1 µg/µL，并立即于-80 °C保存。避免RNA反复冻融，以防合成的mRNA降解。

2. 阳离子脂质体的制备及体外mRNA转染性能评价

1. 脂质体的制备
   1. 制备1 mM阳离子脂质体时，使用阳离子脂质：DOPE：胆固醇的摩尔比为1:1:0.5。
   2. 将适当摩尔比的阳离子脂质、胆固醇和DOPE（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺）溶解于氯仿（200 µL）中，置于玻璃小瓶内。
   3. 使用无水氮气的细流去除溶剂。
   4. 将干燥后的脂质在高真空条件下继续干燥2小时。
   5. 真空干燥后，向干燥脂质中加入1 mL无菌去离子水，使混合物在室温下溶胀过夜。
   6. 在室温下涡旋震荡小瓶，形成多层单囊泡（MUVs）。
   7. 先进行水浴超声，再以25 W功率进行探头超声，将多层单囊泡（MUVs）转化为小单层囊泡（SUVs）。
      ​注意：SUVs应呈现为半透明的脂质体溶液。若未达到此状态，可增加每次30秒的脉冲次数，开启与关闭之间间隔1分钟。使用粒径分析仪测定其流体动力学直径和表面电位（图4）。
2. mRNA/脂质体复合物的形成及凝胶阻滞实验
   1. 为制备1:1至8:1不同脂质-RNA电荷比的复合物，按照表7所示，分别将mRNA和阳离子脂质体用去离子水稀释。
   2. 按照表7指示，将稀释后的mRNA加入脂质体溶液中，室温孵育10分钟以形成脂质复合物（lipoplex）。
   3. 向复合物中加入20 µL的2×RNA上样染料，混匀后上样。单独的mRNA作为对照。
   4. 将样品加入含1×TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶中，以100 V电压电泳45分钟。
   5. 使用凝胶成像系统观察RNA条带（图5）。
3. 体外mRNA转染
   1. 在48孔板中每孔接种45,000个哺乳动物细胞，加入完全培养基，于37 °C培养16至20小时后进行转染。
   2. 培养16至20小时后，检查细胞密度。转染时细胞融合度应约为80%。
   3. 向0.5 mL离心管中加入150 ng编码GFP蛋白的mRNA，与阳离子脂质体按1:1电荷比在无血清DMEM培养基中形成复合物，总体积为20 µL。
   4. 室温孵育10分钟。
   5. 将脂质复合物加入细胞中，在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育4小时。
   6. 小心移除培养基，避免扰动细胞。每孔加入250 µL含10%胎牛血清（FBS）的完全培养基（表8）。
   7. 转染72小时后，在荧光显微镜下观察GFP表达情况（图6、7）。
   8. 为定量分析GFP表达水平，将细胞进行流式细胞术检测。
   9. 移除培养基，用1×PBS洗涤两次。用胰酶消化细胞，并用于流式细胞仪检测GFP阳性细胞百分比。
   10. 使用488 nm激光在流式细胞仪中获取细胞信号，圈选活细胞群体，并分析GFP阳性细胞的百分比，同时测定平均荧光强度（MFI）（图6、7）。

结果

我们优化了me1Ψ-UTP修饰mRNA的制备、脂质体的制备，以及利用阳离子脂质体将mRNA转染至多种哺乳动物细胞的实验方案（图1）。为合成mRNA，首先从mEGFP-N1哺乳动物表达载体中扩增出经哺乳动物密码子优化的eGFP体外转录（IVT）模板，并通过有机萃取/乙醇沉淀法进行纯化（图2）。随后，通过体外转录（IVT）过程生成me1Ψ-UTP修饰的RNA和mRNA。变性RNA琼脂糖凝胶电泳结果显示，所合成的RNA具有良好的完整性，并达到预期长度（相对于RNA标记物，分别为750个碱基的RNA和约1000个碱基的mRNA）（图3）。

为制备阳离子脂质体，采用薄膜水化法结合超声处理，形成小单层囊泡（SUVs）。对脂质体的理化性质进行表征，结果显示其流体动力学直径约为65 nm，表面电位约为+20 meV（图4）。通过凝胶阻滞实验，在脂质体-mRNA复...

讨论

由于未修饰的mRNA半衰期较短，并且能够激活细胞内固有免疫反应，从而导致转染细胞中蛋白质表达水平较低，其治疗应用一直受到限制¹¹。Katalin 等人证明，含有修饰核苷酸（如 m5C、m6A、ΨU 和 me1Ψ-UTP）的 RNA 可以避免激活 Toll 样受体（TLR）¹²。更重要的是，在体外转录（IVT）mRNA 中引入 ΨU 或 me1Ψ-UTP 可显著提高目标蛋白的翻译效率，增强室温下的稳定性，并防止核酸酶降解^{13, 14}。

在本视频中，我们展示了利用脂质介导的me1Ψ-UTP修饰mRNA向多种培养细胞递送的实验方案。该方案包括me1Ψ-UTP修饰mRNA的制备、阳离子脂质体的制备、细胞转染以及蛋白表达水平的评估。我们采用哺乳动物密码子优化的eGFP报告基因进行转染实验，并通过检测荧光强度来分析蛋白表达水平。通过制备阳离子脂质体以与mRNA形成复合物，并在脂质/碱...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Lonza	50004
水浴超声仪	DNMANM Industries	USC-100
阳离子脂质	实验室合成
氯仿	MP biomedicals	67-66-3	"注意"
胆固醇	Himedia	GRM335
DEPC处理水	SRL BioLit	66886
DMEM培养基	Lonza	12-604F
DNA Ladder	GeneDireX	DM010-R50C
DOPE	TCI	D4251
EDTA钠盐	MP biomedicals	194822
乙醇	Hayman	F204325	"注意"
胎牛血清	Gibco	10270
流式细胞仪	BD	FACS Celesta
荧光显微镜	Leica	MI6000B
凝胶成像系统	Cell Biosciences	Flurochem E
冰醋酸	Fisher Scientific	85801	"注意"
mEGFP-N1 哺乳动物表达载体	Addgene	54767
N1-甲基假尿苷三磷酸	Jena Bioscience	NU-890
苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1)，pH 8.0	SRL BioLit	136112-00-0	"注意"
磷酸盐缓冲液 (PBS)，pH 7.4	CellClone	CC3041
探针式超声仪	Sonics Vibra Cells	VCX130
RNA Ladder	NEB	N0362S
RNase抑制剂	Thermo Scientific	N8080119
SafeView染料	abm	G108
乙酸钠	Sigma	S7545
PCR仪	Applied biosystems	4375786
恒温混匀仪	Eppendorf	22331
Tris缓冲液	SRL BioLit	71033
胰蛋白酶	Gibco	25200056