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方法文章

用于可视化异染色质相关蛋白的免疫荧光染色 果蝇 唾液腺

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DOI：

10.3791/62408

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2021年8月21日

 ,  , 
1Instituto de Biotecnología, Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Universidad Nacional Autónoma de México

本文内容

摘要

本方案旨在可视化Drosophila多线细胞中的异染色质聚集体。

摘要

通过免疫染色观察异染色质聚集物具有挑战性。许多哺乳动物的染色质组分在进化上是保守的 黑腹果蝇 因此，它是研究异染色质形成与维持的极佳模型. 多线化细胞，例如三龄幼虫唾液腺中发现的细胞 D. melanogaster 幼虫提供了一种极佳的工具，可观察到染色质被扩增近一千倍的现象，使研究人员能够研究细胞核内异染色质分布的变化。尽管异染色质组分的观察可直接在多线染色体标本中进行，但某些蛋白质的定位可能因处理条件剧烈而发生改变。因此，对细胞中异染色质进行直接可视化观察可补充此类研究。在本方案中，我们描述了用于该组织的免疫染色技术、荧光二抗的使用以及共聚焦显微镜观察，以更精确和详细地观察这些异染色质聚集体。

引言

自从Emil Heitz的早期研究以来1，异染色质一直被认为是调控基因表达、染色体的减数分裂和有丝分裂分离以及维持基因组稳定性等细胞过程的重要调节因子2,3,4。

异染色质主要分为两种类型：组成型异染色质和兼性异染色质。组成型异染色质通常位于染色体的特定区域，如端粒和着丝粒，其特征是包含重复序列和可移动元件。这类异染色质主要通过特定的组蛋白修饰在表观遗传上加以定义，例如组蛋白H3第9位赖氨酸的二甲基化或三甲基化（H3K9me3），以及异染色质蛋白1a（HP1a）的结合5,6。另一方面，兼性异染色质分布于染色体臂上，主要由在发育过程中被沉默的基因组成7,8。通过对有丝分裂中期细胞中异染色质区段进行免疫染色，或观察间期细胞中异染色质的聚集现象，已极大地增进了人们对异染色质区域形成机制与功能的理解9。

利用Drosophila作为模式系统，使得研究人员能够在不使用电子显微镜的情况下开发出研究异染色质的关键工具10。自从位置效应花斑现象被描述以及异染色质相关蛋白（如HP1a）和组蛋白翻译后修饰被发现以来，许多研究团队已开发出多种免疫组织化学技术，可用于可视化这些异染色质区域10,11。

这些技术基于使用特异性抗体来识别与异染色质相关的蛋白质或组蛋白修饰。对于每种细胞类型和抗体，固定和透化条件必须通过实验经验确定。此外，如果使用压片等额外的机械处理步骤，条件可能需要相应调整。在本方案中，我们描述了利用Drosophila唾液腺来研究异染色质焦点的方法。唾液腺细胞含有多线染色体，其基因组拷贝数超过1,000份，因此可显著放大大多数染色质特征的信号，但卫星DNA和某些异染色质区域因复制不足而例外。尽管如此，异染色质区域在多线染色体制片中易于观察，但压片技术有时会破坏特征性的染色质结合复合物或染色质结构。因此，在完整的唾液腺组织中进行蛋白质免疫定位可避免这些不利影响。我们已使用该方案检测了多种染色质结合蛋白，并证明该方法结合突变型Drosophila品系可用于研究异染色质的破坏12。

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方案

1. 三龄幼虫培养

  1. 通过加入100 g酵母、100 g未精制的全甘蔗糖、16 g琼脂、10 mL丙酸和14 g明胶来配制1升标准培养基。除酵母外，将所有成分溶解于800 mL自来水中，然后溶解酵母。立即高压灭菌30分钟。
    1. 随后，让培养基冷却至60 °C，并加入丙酸至终浓度为0.01%。将瓶子静置，直至明胶凝固。
  2. 为优化三龄幼虫的培养，首先收集5至10日龄的成虫，并将50只（25只雄性和25只雌性）放入装有标准培养基的宽口瓶中。
  3. 将装有果蝇的瓶子置于25 °C的恒温培养箱中，直至产卵数量达到50枚（对于野生型品系约需12小时）。
  4. 培养时间结束后，移除成虫并将其转移至新瓶子中以重复该操作。让胚胎在18 °C下生长72小时
    ​注意：有关黑腹果蝇（Drosophila）品系保种条件的更多信息，请参见Tennessen & Thymmel13。

2. 幼虫采集

  1. 收集幼虫时，应选择未出现气门外翻的游走期幼虫。气门外翻后，幼虫进入前蛹期，此时唾液腺仍具有优良的多线染色体，适合进行分析。唾液腺细胞在12小时后才开始启动程序性细胞死亡14,15。
  2. 取15只三龄幼虫，放入培养皿中清洗。随后将其转移至冰冷的生理盐水或PBS溶液中（1× PBS：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4，调节pH至7.4）。
  3. 在含有蛋白酶抑制剂的冷PBS中，于体视显微镜下解剖15至30对唾液腺（或在30分钟内尽可能多地解剖）。将解剖得到的唾液腺转移至1.5 mL离心管中，并加入冰冷的PBS。
  4. 用1 mL含蛋白酶抑制剂的PBS洗涤一次。等待组织沉降至管底。
  5. 洗涤后，用1000 µL移液器吸除PBS，注意不要触碰组织。
    1. 或者，可在5 mL PBS中直接解剖唾液腺，从而省去此洗涤步骤，随后将唾液腺转移至0.5 mL下述Ruvkun固定液中，进入步骤3。

3. 唾液腺组织固定

  1. 上一步骤的 PBS 去除后，直接加入 0.5 mL 含 50% 甲醇（加入 0.5 mL 甲醇）和 2% 甲醛的 1× Ruvkun 固定缓冲液。
    ​注意：2× Ruvkun 溶液为 pH 7.4 条件下的 160 mM KCl、40 mM NaCl、20 mM EGTA、30 mM PIPES。
  2. 在 4 °C 下轻轻旋转孵育 2 小时。

4. 唾液腺组织洗涤

  1. 用1 mL Tris/Triton缓冲液（100 mM Tris pH 7.4，1% Triton X-100和1 mM EDTA）进行一次5分钟的旋转洗涤。
    ​注意：等待组织沉降至管底。

5. 透化处理

  1. 将唾液腺在1 mL Tris/Triton X-100（同上）中孵育。对于某些蛋白质，可能需要添加1% β-巯基乙醇。
  2. 在37 °C下轻轻振荡（300 rpm）孵育2小时。

6. 保存步骤（可选）

注意：如果未立即进行抗体孵育，请按以下方法保存组织。

  1. 用 1 mL BO3 缓冲液（0.01 M H3BO3，pH 9.2 + 0.01 M NaOH）洗涤，然后在 37 °C 条件下用 BO3/10 mM DTT 溶液轻度振荡（300 rpm）孵育 15 分钟。
  2. 孵育结束后，用 1 mL BO3 缓冲液单独洗涤一次。
    注意：等待组织沉降至管底。
  3. 加入 1 mL PBS。将组织保存在此溶液中，于 4 °C 最多可保存 72 小时，随后进行下一步操作。当处理不同突变株（其生命周期可能存在延迟）时，此步骤尤为有用，可使免疫检测与对照组同时进行。

7. 组织切块

  1. 将唾液腺在1 mL缓冲液B（PBS + 0.1% BSA + 0.5% Triton X-100 + 1 mM EDTA）中室温旋转孵育2小时。

8. 免疫染色

  1. 移除所有缓冲液B，加入缓冲液A（PBS + 0.1% BSA）以及目标抗体。
    ​注意：我们使用Hybridoma Bank提供的HP1a C1A9c（浓缩抗体），稀释比例最高可达1:3000。当使用C1A9s（上清液）时，我们尝试过1:100至1:500之间的各种稀释比例，均能获得良好效果。4 ᵒC条件下旋转孵育过夜。此步骤中需注意震荡不可产生气泡，以免损伤抗体。

9. 免疫染色洗涤

  1. 在室温下，每次使用1 mL缓冲液B，搅拌条件下进行3次，每次15分钟的洗涤。
  2. 将腺体转移至含有与荧光染料偶联的二抗的缓冲液B中，在4 ᵒC条件下旋转孵育2小时（使用的二抗为Invitrogen Alexa Fluor 568，稀释比例为1:3000）。
    1. 用铝箔纸包裹离心管，避免二抗暴露于光照下。
  3. 在室温下，加入1 mL缓冲液B，旋转条件下进行2次、每次15分钟的洗涤。
  4. 加入DNA标记物（如Sytox：取2 µL 5 mM的储存液溶于1 mL缓冲液B中；或Hoechst：取1 µL 10 mg/mL的储存液溶于1 mL缓冲液B中），在室温下旋转孵育10分钟。
  5. 用缓冲液B和PBS各洗涤一次，每次洗涤在室温下旋转10分钟。
    ​注意：请始终避免光照。

10. 成像

  1. 将唾液腺置于载玻片上，用盖玻片形成液滴。
  2. 将唾液腺置于液滴中央，并加入AF1 Citifluor以防止产生气泡，同时将黏稠液体均匀铺展。然后用透明指甲油密封四周。
  3. 在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。若样品不在当天观察，需避光保存于4 °C环境中。
  4. 使用GraphPad Prism 6软件生成所有图表并进行统计分析。
  5. 采用Kruskal-Wallis检验分析唾液腺中HP1a分布的数据。统计学显著性水平设定为（p < 0.05*，< 0.01 **，< 0.001***，< 0.0001****）。

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结果

果蝇 唾液腺中HP1a免疫染色的代表性结果如图1所示。阳性结果表现为观察到一个焦点信号（图1a）（异染色质聚集体或凝聚物）。阴性结果则无信号或信号呈弥散分布。有时可观察到双信号，即出现两个焦点（图1c），但通常出现频率较低。

数据分析可用柱状图表示，以比较不同突变背景下HP1a的分布情况。例如，在图2中可以看出，98%的野生型细胞核呈现单个焦点分布，2%的细胞核具有两个焦点；而在突变体中，这一比例发生变化，具有两个焦点的细胞核比例上升至40%。

图3 显示代表性H3K9me3免疫染色结果于 果蝇 唾液腺。我们可以观察到一个焦点（图3b）与...

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讨论

真核生物的细胞功能可以决定细胞核内的三维结构，这种结构依赖于不同蛋白质与染色质以及包括RNA在内的多种分子之间的相互作用。在过去三年中，具有重要生物学意义的生物凝聚物（如异染色质）在相分离过程中发挥了关键作用，促进了活性染色质与抑制性染色质在细胞核内独特的空间组织形式16,17,18。

异染色质对于维持细胞功能和细胞特性至关重要。过去人们认为这些致密区域不会发生转录。然而，随着技术手段的进步，我们现在发现异染色质不仅能够被转录，而且其转录过程对于维持细胞核骨架结构具有重要作用，并且对发育或病理过程具有敏感性12,19。此外，位于着丝粒周围异染色质中的一些基因需要异染色质环境才能正常发挥功能。HP1a基因的突变会降低最早被发现的light和rolled

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

我们感谢Marco Antonio Rosales Vega和Abel Segura拍摄部分共聚焦图像，感谢Carmen Muñoz进行培养基制备，感谢LMNA的Arturo Pimentel博士、M.C. Andrés Saralegui以及Chris Wood博士在显微镜使用方面提供的建议。

资金支持：
本工作由墨西哥国家科学技术理事会（CONACyT）（项目号 A1-S-8239，授予 VV-G）以及研究与技术创新项目支持计划（项目号 204915 和 200118，授予 VV-G）资助

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Axygen MCT-150-C11351904品牌不关键
16% 甲醛Thermo Scientific28908
AF1 CitifluorTed pella1947025 mL
BSA，分子生物学级Roche10735078001品牌不关键
Complete，不含EDTA的超纯蛋白酶抑制剂
蛋白酶抑制剂		Merck5892953001
盖玻片CorningCLS285022-200EA22×22，品牌不关键
DTTSigmad9779品牌不关键
EDTASigmaE5134品牌不关键
EGTA品牌不关键
载玻片Gold seal3011品牌不关键
H3BO3Baker0084-01品牌不关键
H3K9me3Abcam8889
HP1aHybridoma BankC1A9产品形态 浓缩液 0.1 mL
KClBaker3040-01品牌不关键
甲醇Baker9070-03品牌不关键
NaClSigma71376品牌不关键
NaOH品牌不关键
PIPES品牌不关键
旋转仪Thermo Scientific13-687-12Q Labquake 试管摇床
Thermo Mixer CEppendorf13527550SmartBlock 1.5 mL
TrisMilipore648311品牌不关键
Triton X-100SigmaT8787100 mL，品牌不关键
β-巯基乙醇Bio-Rad161071025 mL，品牌不关键

参考文献

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