方法文章

免疫荧光染色，用于 在果蝇 唾液腺中可视化异色素相关蛋白质

DOI：

10.3791/62408

⸱

2021年8月21日

 ,  , 
1Instituto de Biotecnología, Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Universidad Nacional Autónoma de México

本文内容

摘要

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此协议旨在可视化 多聚 体细胞中的异色素聚合物。

摘要

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通过免疫染色来可视化异色素聚合物可能具有挑战性。许多哺乳动物的染色质成分在 果蝇黑色素加斯特保存。 因此，研究异色素的形成和维护是一个很好的模型。 聚合细胞，如在第三星 D.黑色素幼 虫的唾液腺中发现的细胞，提供了观察血红素放大近千次的绝佳工具，并使研究人员能够研究异色素在细胞核中分布的变化。虽然异色素成分的观察可以直接在多极染色体制剂中进行，但某些蛋白质的定位可以通过治疗的严重程度来改变。因此，细胞中异色素的直接可视化补充了这种类型的研究。在此协议中，我们描述了用于此组织的免疫染色技术、使用二次荧光抗体和连续显微镜以更精确和更精细的方式观察这些异色素聚合物。

引言

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自早期研究Emil Heitz1以来，异色素一直被认为是细胞过程的重要调节器，如基因表达、染色体的美色和间质分离，以及维持基因组稳定性2、3、4。

异色素主要分为两种类型:具有特征定义重复序列的构成异色素，以及存在于特定染色体位点（如端粒和中位体）中的可转换元素。这种类型的异色素主要通过特定的平生标记，如赖氨酸9的地基或三甲基化的希石H3（H3K9me3）和异色素蛋白1a（HP1a）5，6的结合来表观遗传。另一方面，通过染色体的手臂，由发育沉默的基因7，8组成。代谢细胞中异色素块的免疫染色，或相间细胞中异色素聚合物的观察，在了解异色区形成和功能方面，揭示了许多光。

使用卓索菲拉作为模型系统，使得开发必要的工具，研究异色素，而无需使用电子显微镜10。

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方案

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1. 第三星幼虫培养

  1. 加入100克酵母、100克未精制的全甘蔗糖、16克琼脂、10mL丙烯酸和14克明胶，准备1升标准介质。将除酵母以外的所有成分溶解在 800 mL 的自来水中，然后溶解酵母。高压灭菌立即30分钟。
    1. 之后，让媒体冷却到60°C，并将丙酸添加到最终浓度0.01%。让瓶子站立，直到明胶形成。
  2. 为了优化3o星内幼虫培养，首先收集5至10天的老年人，并将50（25男25女）放在一个宽脖子瓶的标准媒体。
  3. 将瓶子与苍蝇一起放在25°C的受控温度孵化器中，直到产卵数量为50个（野生型菌株约12小时）。
  4. 孵化期结束后，将成人取出并转移到新瓶中重复该程序。让胚胎在18°C下生长72小时
    注意:有关果蝇库存维护条件的更多情况，请参阅特内森和提梅尔13。

2. 拉瓦系列

  1. 对于幼虫集合选择没有曾经的螺旋骨的流浪幼虫。螺旋骨变老后，幼虫进入前肺阶段，同时保留适合分析的优秀多分子染色体。只有12小时后，唾液腺的细胞才开始为14、15号程序化细胞死亡做准备。
  2. 取15个3°星内幼虫，并把它们放在一个手表玻璃清洗他们。然后将其转移到冰....

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结果

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图1显示，在果蝇唾液腺中，HP1a免疫染色具有代表性。 一个积极的结果是观察一个焦点（图1a）（异色聚合物或凝结物）。负结果为无信号或分散信号。有时可以观察到双重信号，即双点（图1c），但它通常发生的数量较小。

数据分析可以表示为条形图，比较不同突变背景中 HP1a 的分布。例如，在 图2 中，我们可以看到，98%的野生类型核呈现一个焦点的分布，2%的原子核存在两个foci，而在突变体中，比例变化，两个foci的存在增加到40%。

图3显示了 德罗索菲拉 唾液腺中具有代表性的H3k9me3免疫染色结果。我们可以观察一个焦点（图3b），类似.......

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讨论

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真核生物的细胞功能可以定义细胞核内的3D结构，由不同蛋白质与染色质和包括RNA在内的各种分子之间的相互作用得到支持。在过去三年中，具有相关性的生物凝结物，包括异色素，在确定相分离方面发挥了根本作用，促进了活跃和抑制性色度素16、17、18的独特核空间组织。

异色素对于保持细胞功能和身份至关重要。以前人们认为这些密集区域没有转录。然而，现在我们有更强大的技术，我们可以看到，异色素不仅是转录，而且是一个基本的过程，以保持基座的脚手架，是敏感的发展或病理过程12，19。此外，某些嵌入在近心异色素中的基因需要一个异色环境才能正常工作。HP1a突变减少了光和轧基因的表达，这是19日首次发现。这些基因对生物体.......

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披露

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作者宣称他们没有相互竞争的利益。

致谢

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我们感谢马可·安东尼奥·罗萨莱斯·维加和阿贝尔·塞古拉拍摄了一些焦点图像，卡门·穆尼奥斯为媒体准备，阿图罗·皮门特尔博士，M.C安德烈斯·萨拉莱吉博士和来自LMNA的克里斯·伍德博士就显微镜的使用提供建议。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Axygen MCT-150-C11351904品牌不重要
16% 甲醛Thermo Scientific28908
AF1 CitifluorTed pella1947025 mL
BSA，分子生物学级Roche10735078001品牌不重要
完整，蛋白酶抑制剂 Ultra EDTA-free
蛋白酶抑制剂		默克5892953001
盖玻片康宁CLS285022-200EA22x22，品牌不重要
DTTSigmad9779品牌不重要
EDTASigmaE5134品牌不重要
EGTA品牌不重要
载玻片金密封3011品牌不重要
H3BO3Baker0084-01品牌不重要
H3K9me3Abcam8889
HP1a杂交瘤库C1A9产品形式 浓缩液 0.1 mL
KClBaker3040-01品牌不重要
甲醇Baker9070-03品牌不重要
NaClSigma71376品牌不重要
NaOH品牌不重要
PIPES品牌不重要
旋转器Thermo Scientific13-687-12Q Labquake 管摇床
Thermo Mixer CEppendorf13527550SmartBlock 1.5 mL
TrisMilipore648311品牌非关键
Triton X-100SigmaT8787100 mL，品牌非关键
&β;-巯基乙醇Bio-Rad161071025 mL，品牌非关键

参考文献

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  1. Berger, F. Emil Heitz, a true epigenetics pioneer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572(2019).
  2. Irick, H. A new function for heterochromatin. Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).
  3. Kasinathan, B., et al.

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HP1

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