一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

摘要

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，可调控多种生物通路。当与修饰肽富集的生物化学方法相结合时，质谱技术是全局分析R-甲基化蛋白质组的最佳手段。本文描述了在人类细胞中高置信度鉴定全局R-甲基化的实验流程。

摘要

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的蛋白质翻译后修饰（PTM），参与调控多种细胞通路，包括RNA加工、信号转导、DNA损伤应答、miRNA生成以及翻译过程。

近年来，得益于生物化学与分析技术的进步，基于质谱（MS）的蛋白质组学已成为以单一位点分辨率表征细胞甲基化蛋白质组的最有效策略。然而，甲基化蛋白的鉴定与分析仍面临挑战。 体内 由于这种修饰具有亚化学计量性质，且存在多种氨基酸替换以及酸性残基的化学甲基酯化（与甲基化具有相同质荷比），因此通过质谱法检测蛋白质R-甲基化仍具有挑战性且容易出错。因此，在甲基化蛋白质组学研究中，需要采用富集方法以提高R-甲基化肽段的鉴定效率，并结合正交验证策略以降低假发现率（FDR）。

本文描述了一种专门用于从细胞样品中高置信度鉴定和定量R-甲基化肽的实验方案，该方案结合了使用重同位素编码的甲硫氨酸（hmSILAC）对细胞进行代谢标记，以及对全细胞裂解液进行双蛋白酶溶液内消化，随后通过离线高pH反相（HpH-RP）色谱分离，并利用抗广谱R-甲基化抗体对R-甲基化肽进行亲和富集。经过高分辨率质谱分析后，原始数据首先使用MaxQuant软件包进行处理，然后利用hmSEEKER软件对MaxQuant输出文件中对应的轻链与重链甲基化肽的质谱峰对进行深度搜索分析。

引言

精氨酸（R）甲基化是一种翻译后修饰（PTM），存在于约1%的哺乳动物蛋白质组中¹。蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）是一类催化R-甲基化反应的酶，通过将一个或两个甲基基团以对称或不对称的方式添加到精氨酸侧链胍基上的氮（N）原子上。在哺乳动物中，根据其催化单甲基化（MMA）和不对称二甲基化（ADMA）、MMA和对称二甲基化（SDMA），或仅催化MMA的能力，PRMTs可分为三类：I型、II型和III型^2,3。PRMTs主要靶向富含甘氨酸和精氨酸的区域（称为GAR基序）中的R残基，但某些PRMTs（如PRMT5和CARM1）也可甲基化富含脯氨酸-甘氨酸-甲硫氨酸（PGM基序）的区域⁴。R-甲基化已被证实可调控多种生物学过程，例如RNA剪接⁵、DNA修复⁶、miRNA生成⁷以及翻译²，从而推动了对该PTM的深入研究。

质谱（MS）被公认为是在蛋白质、肽段和位点水平上系统研究全基因组R-甲基化的最有效技术。然而，该翻译后修饰在通过质谱进行高置信度鉴定时需要采取一些特殊预防措施。首先，R-甲基化具有亚化学计量特征，即未修饰肽段的丰度远高于修饰肽段，因此在数据依赖采集（DDA）模式下运行的质谱仪更倾向于碎裂高丰度的未修饰肽段，而对低丰度的甲基化肽段碎裂频率较低⁸此外，大多数基于质谱的R-甲基化位点鉴定工作流程在生物信息学分析层面存在局限性。事实上，由于该翻译后修饰与多种氨基酸替换（如甘氨酸变为丙氨酸）以及天冬氨酸和谷氨酸的甲基酯化等化学修饰具有相同的质荷比，甲基化肽段的计算识别容易产生较高的假发现率（FDR）。⁹因此，基于甲基同位素标记的方法，例如细胞培养中重甲基稳定同位素标记氨基酸法（hmSILAC），已被用作可靠进行质谱鉴定的正交策略 体内 甲基化，显著降低假阳性注释的比率¹⁰.

近年来，多种用于研究精氨酸甲基化蛋白的全蛋白质组学实验方案已得到优化。基于抗体的免疫亲和富集技术的发展，已实现了对人类细胞中数百个精氨酸甲基化位点的注释^11,12。此外，许多研究^3,13报道，将基于抗体的富集方法与肽段分离技术（如高pH反相色谱分级）相结合，可显著提高所鉴定甲基化肽段的总数。

本文介绍了一种用于系统性、高置信度鉴定人源细胞中R-甲基化位点的实验策略，该策略基于一系列生物化学与分析步骤：从hmSILAC标记的细胞中提取蛋白质，使用胰蛋白酶（Trypsin）和LysargiNase蛋白酶进行平行双酶消化，随后对消化后的肽段进行HpH反相色谱（HpH-RP）分级分离，并结合抗体介导的免疫亲和富集，以富集含有单甲基精氨酸（MMA）、对称二甲基精氨酸（SDMA）和非对称二甲基精氨酸（ADMA）的肽段。所有经亲和富集的肽段随后通过高分辨率液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）在数据依赖采集（DDA）模式下进行分析，原始质谱数据由MaxQuant算法处理，用于鉴定R-甲基化肽段。最后，将MaxQuant的输出结果输入hmSEEKER——一种自主开发的生物信息学工具，用于搜索重链与轻链甲基化肽段的配对信号。简而言之，hmSEEKER首先读取并筛选msms文件中的甲基化肽段鉴定结果，然后将每个甲基化肽段与allPeptides文件中对应的MS1峰进行匹配，最终搜索其重链/轻链对应肽段的峰信号。对于每一对潜在的重-轻链肽段，计算其Log2 H/L比值（LogRatio）、保留时间差异（dRT）以及质荷比误差（ME）参数，位于用户自定义阈值范围内的双峰信号被标记为真实阳性结果。该生物化学实验流程如图1所示。

方案

1. 细胞培养与蛋白质提取（所需时间：3 - 4 周）

1. 分别在添加轻链（L）或重链（H）甲硫氨酸的培养基中平行培养 HeLa 细胞（培养基成分见表1）。在细胞至少经历八次分裂后，分别从每种 SILAC 通道中取样，并进行掺入效率检测。
   注意：为检测掺入效率，需通过 LC-MS/MS 分析确认重链通道中重甲硫氨酸（Met-4）的掺入比例尽可能接近 100%。使用重同位素标记的细胞样品进行 LC-MS/MS 分析（仪器参数见表2），然后使用 MaxQuant 软件处理质谱数据，参数设置见表3。为检测 Met-4 的掺入情况，可使用位于 https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/ 的自研脚本。
2. 当重甲硫氨酸的掺入率达到>97% 时，认为掺入已完成。当每种通道的细胞总数达到约 60 × 10⁶ 个（相当于约 40 个直径 15 cm 的培养皿，HeLa 细胞汇合度约 85%，具体数量因细胞类型而异）时，收集细胞。仔细计数后按 1:1 比例混合，并在 4 °C 条件下以 335 × g 离心 5 分钟形成细胞沉淀。
   注意：为验证 L/H 混合比例是否准确为 1:1，可保留部分混合样品，将其上样至含有高丰度且高度 R-甲基化蛋白（例如 fibrillarin）的凝胶切片进行检测。若标记成功且混合比例正确，则样品中 R-甲基化肽段的轻链与重链形式应呈 1:1 比例。或者，保留部分混合样品进行 LC-MS/MS 分析，使用 MaxQuant 软件（参数见表3）处理质谱数据，并绘制 Log2 H/L 比值的分布图，如图2C所示。此步骤后可将细胞沉淀速冻并保存于 -80 °C，暂停实验流程。
3. 根据细胞沉淀体积，加入四倍体积的裂解缓冲液（Lysis Buffer 成分见表1）重悬细胞沉淀。例如，对于由 120 × 10⁶ 个 HeLa 细胞（60 × 10⁶ 轻链 + 60 × 10⁶ 重链）形成的 1.5 mL 沉淀，使用 6 mL 裂解缓冲液。
   注意：蛋白提取需在室温（RT）下进行，因为裂解缓冲液中含有 9 M 尿素这一变性剂，其在冰浴温度下会析出沉淀；因此，需同时加入广谱丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂以及磷酸酶抑制剂，以防止蛋白发生蛋白水解降解和去磷酸化。蛋白酶与磷酸酶抑制剂混合物可作为小药片形式商业化购买，详见表1和材料表。
4. 使用带微探头的超声破碎仪对样品进行超声处理，至少进行五个循环，每个循环为 15 秒开启、30 秒关闭，以确保细胞膜充分破裂并释放 DNA 且 DNA 被有效剪切。通过移液器反复吹打溶液检测提取液的黏度。若因 DNA 剪切不完全或膜溶解不充分导致黏度过高，则需重复超声处理。
   注意：应确保超声过程中样品不过热，因为高温可能损伤蛋白质。但由于存在 9 M 尿素，无法在超声循环间将样品置于冰上；因此，建议在不同超声循环之间暂停 60 秒。此外，应避免超声过程中产生气泡，因为气泡会降低超声效率。
5. 在室温下以 3,000 × g 离心 10 分钟，沉淀细胞碎片，将上清液转移至新的 15 mL 离心管中。
6. 使用比色法测定提取液的蛋白含量，例如 Bradford 法或二辛可宁酸（BCA）法^14,15。本实验方案推荐的蛋白提取物起始量为 20–30 mg。
   注意：含有高浓度尿素的裂解缓冲液适用于 Bradford 法和 BCA 法蛋白定量；而含有高浓度十二烷基硫酸钠（SDS）等其他类型的裂解缓冲液则不适用于 Bradford 法。

2. 裂解液消化（预计所需时间 2 小时）

1. 使用超纯水配制的二硫苏糖醇（DTT）储存液对蛋白质的巯基（-SH）进行还原，终浓度为4.5 mM，在55 °C反应30分钟。
   注意：可配制1 M的DTT储备液，于-20 °C保存最多1个月，每次实验仅需解冻所需 aliquot。 alternatively，可使用巯基还原剂三(2-羧乙基)膦（TCEP）进行-SH基团的还原；尤其在蛋白质长期保存时，若缓冲液中不含EGTA等金属螯合剂，TCEP的稳定性显著优于DTT；而当存在金属螯合剂时，DTT则更为稳定。¹⁶.
2. 在避光条件下，向蛋白质中加入终浓度为10 mM的碘乙酰胺（IAA），对蛋白质的巯基（-SH）进行烷基化反应，并于室温孵育15分钟。由于碘乙酰胺具有光敏感性，提取的蛋白质与IAA溶液的孵育步骤需在避光条件下进行。
   注意：100 mM 的 IAA 储存液应在每次实验前新鲜配制。或者，也可使用氯乙酰胺对 -SH 基团进行烷基化修饰，特别是在实验目的为分析甲基化与泛素化之间串扰时，因为 IAA 诱导的修饰会模拟泛素化修饰，产生干扰性假象。¹⁷.
3. 在进行蛋白质消化步骤之前，保留一份蛋白提取物等分试样（取自未消化裂解液起始量的1/1,000），用于后续在SDS-PAGE考马斯亮蓝染色凝胶上的分析，并与消化后的相应量样品进行比较；该检测用于验证蛋白水解效率（见第4点）。
4. 用四倍体积的 20 mM HEPES（pH 8.0）稀释剩余的蛋白质提取物，使终浓度的尿素 2 M 浓度（该浓度与蛋白酶的酶活性相容）。将样品分为两部分：第一部分加入测序级修饰胰蛋白酶，第二部分加入 LysargiNase 蛋白酶（参见 材料表以1:100（w/w）的比例（相对于起始材料的毫克数）加入，在37 °C、600 rpm条件下于恒温混匀仪中孵育过夜，以实现酶消化。
   ​注意：胰蛋白酶是蛋白质组学中最常用的消化酶，可在精氨酸（R）和赖氨酸（K）的C末端进行切割，产生的肽段具有特定的电荷分布，导致其碎裂谱图以 y型离子在碰撞诱导解离（CID）过程中产生。LysargiNase在R和K的N端发生切割，因此其切割特异性与胰蛋白酶相对应，产生在CID碎裂时主要释放b型离子的肽段。这种联合分析显著提高了肽段序列的覆盖度，并增强了R-甲基化位点特异性鉴定的置信度¹⁸.

3. 肽段纯化（所需时间参考值 1 小时）

1. 从两个反应中分别保留一份消化后的肽段等分试样，所取体积需与之前相同 参见第2.3节，通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色凝胶比较评估蛋白酶消化效率（见第4节）。
2. 通过加入三氟乙酸（TFA）将样品酸化至终浓度5%以终止消化反应。充分混匀后，用石蕊试纸检测样品pH值（pH应约为3）。短暂涡旋振荡后离心酸化样品，再转移至新的15 mL离心管中。
3. 通过两个 C18 真空柱（填料重量 1 g，参见 材料表），一份用于胰蛋白酶消化的样品，另一份用于LysargiNase消化的样品。配制溶剂A、溶剂B和洗涤缓冲液（见 表1 缓冲液成分）。
4. 使用玻璃移液管，用6 mL 100%乙腈（ACN）对每个小柱重复再水合3次。随后，依次用3-9-18 mL溶剂A对每个小柱进行平衡。上样（树脂应变为黄色）。再依次用3-9-18 mL溶剂A洗涤，然后加入6 mL洗涤缓冲液。将每个小柱转移至洁净的15 mL离心管中，用7 mL溶剂B洗脱样品。重复使用7 mL溶剂B进行洗脱，最终洗脱体积为14 mL。
   注意：所有步骤均需让缓冲液和溶液流经层析柱 通过重力作用使缓冲液流经色谱柱。为促进缓冲液在柱中的流动，可用注射器缓慢推动每种溶液，以模拟真空抽滤效果。
5. 保存50 µL洗脱的肽段、50 µL流穿液（FT）、50 µL溶剂A洗涤液以及最后一次洗涤的50 µL洗涤液 用于后续通过SDS-PAGE进行的多肽分析（见第4步）。

4. 考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶（所需时间约为 2小时）

1. 将收集的等分试样在17.5% SDS-PAGE凝胶上电泳，并用Instant-Blu考马斯亮蓝染色液染色（参见材料表）。预期结果如图2A所示。

5. 肽的冻干（参考时间 2 天）

1. 用石蜡膜覆盖含有洗脱肽段的15 mL离心管，然后用20号针头在膜上刺3-5个孔。将离心管置于干冰中至少30分钟，直至样品完全冻结。
2. 将冻结的组分冷冻干燥48小时，该时间通常足以确保样品完全冻干，但因冻干机性能差异，可能略有变化。
   ​注意：实验可在此处暂停，将冻干样品储存在-80 °C。

6. 肽段的离线高pH反相色谱分级（预计时间 4天）

1. 使用配备C12-RP HPLC柱（250 x 4.6 mm，4 µm Proteo 90A）的高效液相色谱系统，通过HpH-RP液相色谱将肽段分离为60个组分。
2. 运行前，配制新鲜的缓冲液A和缓冲液B（缓冲液的组成见下文描述）。 表1).
3. 使用0.22 µm滤膜过滤所有溶液，并在超声波清洗仪中脱气至少30分钟。
4. 将冻干肽溶解于1 mL缓冲液A中。使用注射器将肽溶液通过聚四氟乙烯（PTFE）0.45 µm滤膜过滤。
5. 以1 mL/min的流速进行分级，收集每管1 mL的组分，采用以下色谱梯度：5% B在60分钟内线性增加至30% B；30% B在2分钟内升至60% B；保持70% B持续3分钟。
6. 将高效液相色谱仪设置为在此时停止馏分收集，并将梯度保持在70%缓冲液B中5分钟，随后通过快速梯度升至100%缓冲液B对色谱柱进行彻底清洗，最后再用100%缓冲液B冲洗10分钟。
   ​注意：每次色谱运行结束后，务必用100%缓冲液A平衡色谱柱20分钟。
7. 分别对经胰蛋白酶和LysargiNase消化的两个样品进行分级分离 离线高pH反相色谱梯度，如6.5节所述。
8. 每个色谱梯度洗脱组分均收集至深孔96孔板中。
9. 合并之前收集的组分 将梯度洗脱组分合并为一个名为PRE的单一组分。通过非连续合并的方式，将HpH-RP反相液相色谱（LC）梯度洗脱得到的60个组分合并为14个最终组分。为实现这种非连续合并，请按照以下方案汇集HpH-RP各组分。
   1. 组分1（终体积5 mL）：合并1-15-29-43-57
   2. 第2组分（终体积5 mL）：合并2-16-30-44-58组分
   3. 第3组分（终体积5 mL）：合并组分3、17、31、45、59
   4. 第4组分（终体积5 mL）：合并4-18-32-46-60
   5. 第5组分（终体积4 mL）：合并5-19-33-47
   6. 第6组分（终体积4 mL）：合并组分6、20、34、48
   7. 第7组分（终体积4 mL）：合并组分7、21、35、49
   8. 第8组分（终体积4 mL）：合并8-22-36-50
   9. 第9组分（终体积4 mL）：合并组分9-23-37-51
   10. 第10组分（终体积4 mL）：合并组分10、24、38、52
   11. 第11组分（终体积4 mL）：合并组分11、25、39、53
   12. 第12组分（终体积4 mL）：合并组分12、26、40、54
   13. 第13组分（终体积4 mL）：合并组分13、27、41、55
   14. 组分14（终体积4 mL）：合并组分14、28、42、56
       注意：非连续性合并是指将早期、中期和晚期洗脱的组分进行组合，此举可增加合并组分内肽段组成的异质性。因此，在后续直接连接质谱仪的纳流速低pH反相液相色谱分析中，每个合并组分中的肽段混合物能够实现有效分离，并显著减少共洗脱现象。
10. 将梯度离心后收集的各组分合并为一个组分，命名为POST。
    注意：通过加入梯度前（PRE）和梯度后（POST）组分，共获得16个组分，分装于15 mL离心管中（见 图3A).
11. 用石蜡膜封住15 mL离心管，并用20 G针头在膜上刺出3–5个孔。将离心管置于干冰中孵育，直至各组分完全冻结。
12. 将各组分冻干约48小时。在停止冻干前，确保每个样品完全干燥。
    注意：实验可在此处暂停，将冻干样品于 -80 °C 保存。

7. R-甲基化肽段免疫亲和富集（预计时间 2天）

1. 分别对胰蛋白酶和LysargiNase消化所得的两个样品，平行但独立地使用抗pan-R-甲基化抗体进行修饰肽段的连续免疫亲和富集。用于修饰肽段亲和富集的免疫亲和纯化（IAP）缓冲液由购买抗pan-R-甲基化抗体的公司提供。 （详情见于 表格材料 和 试剂). IAP 缓冲液为 10 倍浓缩液，使用前应稀释 10 倍。
   注意：IAP 缓冲液 1x 可在 -20 °C 保存长达 1 年。
2. 离心冻干肽，2,000 x g 室温下离心5分钟，使肽段沉淀至15 mL离心管底部。每管加入250 µL 1× IAP缓冲液重悬冻干肽段，转移至1.5 mL低吸附离心管中。使用石蕊试纸检测pH值是否 >6.
3. 每个组分保留少量等分试样（约体积的5%），作为后续质谱分析的输入样品。
4. 将每份组分均分为两份等分试样，以便平行进行不对称二甲基精氨酸肽（ADMA）和对称二甲基精氨酸肽（SDMA）的免疫富集。
5. 每10 mg初始蛋白提取物使用三管与蛋白A琼脂糖珠偶联的抗pan-R-甲基化抗体。
6. 通过在 2,000 x g 条件下离心每支小瓶，制备适量的抗体-琼脂糖微珠复合物 g 30秒后离心去除缓冲液。用1 mL 1×PBS洗涤磁珠三次，每次均以2,000 × g离心 g 30 秒。
7. 最后一次洗涤后，将每管珠子重悬于40 µL 1× PBS中；合并所有珠子，最后均分为16份（使每份加入2.5 µL抗体-珠子悬液）。
8. 向每管中加入250 µL 1x IAP缓冲液，通过倒置混匀，并在4 °C下于旋转轮上孵育2 h。
   注意：通过倒置1.5 mL离心管来混匀样品，而不是使用微量移液器枪头吹打，以免损坏磁珠或导致磁珠丢失。
9. 孵育2小时后，将含有多肽和R-甲基化广谱抗体偶联磁珠的1.5 mL离心管在2,000 x g 30 秒离心以沉淀微珠；将各组分中的上清液转移至洁净的 1.5 mL 低吸附离心管中。
10. 将偶联有抗R-单甲基化（MMA）抗体的磁珠加入FTs中 重复步骤 7.7 至 7.9。
11. 在肽样品与MMA磁珠孵育期间，将各组分洗涤两次 此前用抗ADMA和SDMA抗体进行免疫沉淀，并加入250 µL IAP缓冲液（通过倒置混匀，不使用移液器吹打），每次洗涤后弃去上清液。
12. 用LC-MS级水重复洗涤₂三次。
13. 将50 µL 0.15% TFA加入各管中，从琼脂糖珠上洗脱经亲和富集的对称性和非对称性R-二甲基化肽段（事实上，强酸条件可使表位变性，从而导致抗原从抗体上释放）。室温孵育10分钟，每2–3分钟颠倒混匀一次。
14. 将第一次洗脱液转移至洁净的1.5 mL低吸附离心管中，用50 µL 0.15% TFA重复洗脱；将两次洗脱液合并至同一管中。
15. 重复步骤7.11至7.14，针对与抗MMA抗体-磁珠孵育的R-单甲基化肽段进行操作。

8. 使用C18微柱对亲和富集的甲基化肽段进行脱盐和浓缩（预计所需时间 30分钟）

1. 在进行质谱分析之前，使用3M固相萃取小柱制备的C18反相微柱，以甲醇进行平衡，用于肽段的脱盐与富集¹⁹。
2. 将样品（对应于分别进行免疫亲和富集的组分及输入组分）分两步加载至C18微柱上（每个C18微柱加样50 µL + 50 µL），在600 × g 条件下离心6分钟。
3. 用55 µL缓冲液A洗涤微柱（缓冲液成分见表1），每次均在约900 × g 条件下离心5分钟。
   注意：实验可在此处暂停，将C18反相微柱置于4 °C保存，最多可保存2周。

9. 第二次酶消化（所需时间约为 3 小时）

1. 用55 µL缓冲液A洗涤C18-RP微柱（参见 表1 缓冲液成分）重复两次 通过约850 x g的离心处理 g 5 分钟。
2. 用 20 µL 缓冲液 B 洗脱肽段两次（参见 表1 根据缓冲液成分合并两部分组分。
3. 在真空浓缩仪中将洗脱的肽段干燥（参见 材料与试剂表 有关详细信息，请参见）。同时，准备消化溶液，该溶液由50 mM碳酸氢铵组成，用新配制的1 M母液稀释而成（见 表1).
4. 向各相应样品中加入胰蛋白酶或LysargiNase，使其终浓度为25 ng/µL。将每个样品在37 °C下孵育2小时。
5. 加入1 µL 5% TFA终止消化反应；涡旋混匀并离心收集样品。
   ​注意：甲基化的精氨酸（R）和赖氨酸（K）的C末端可抑制胰蛋白酶的酶切作用，导致漏切现象，从而增加肽段长度和电荷，进而产生复杂且不完整的碎片谱图，阻碍肽段鉴定及甲基化位点的特异性归属。已有研究表明，进行第二次酶解可降低此类漏切的发生频率，提高序列覆盖度及位点归属准确性。²⁰.

10. 肽的脱盐（预计所需时间 30 分钟）

1. 将酸化后的肽溶液上样至新的C18-RP微柱，该微柱需按照第8步所述相同步骤预先平衡。
2. 上样至C18-RP微柱的肽可在4 °C下保存，直至进行LC-MS/MS分析时洗脱。

11. 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析（预计时间 5 天）

1. 通过加入10 µL缓冲液B，以615 × g 离心5分钟（室温）从C18反相微柱中洗脱肽段。重复此步骤两次，并合并洗脱液。
2. 在真空浓缩仪中将洗脱液浓缩至接近干燥，避免过度干燥。
3. 将肽段重新溶解于10 µL缓冲液A中，用于LC-MS/MS分析。
4. 使用与纳米流超高效液相色谱（UHPLC）系统联用的高分辨率 质谱仪（参见材料表），对R-甲基化肽段的各组分进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。仪器参数设置详见表2。
5. 将每份样品2 µL上样至纳米分析柱（easy spray柱，内径75 µm，长度25 cm），柱内填料为C18反相树脂（粒径2 µm）。
6. 样品以300 nL/min的流速通过C18反相纳米柱，采用以下线性梯度洗脱：3%-30% B持续89分钟，30%-60% B持续5分钟，60%-95% B持续1分钟，95% B持续5分钟。
7. 质谱仪采用数据依赖性采集（DDA）模式，自动在全扫描MS和MS/MS采集之间切换。设定全扫描MS在检测器中的分辨率为R = 70,000。依次选择信号最强的15个肽离子，目标值设为3 × 10⁶，并以28%的相对碰撞能量进行碎裂。全扫描的最大离子累积时间设为20 ms，MS/MS设为50 ms，并将MS/MS的目标值固定为1 × 10⁶。动态排斥时间设为20秒。

12. 运行 MaxQuant 和 hmSEEKER 数据分析

1. 完成 LC-MS/MS 运行后，将质谱原始数据导入肽段搜索引擎，通过基于概率的方法比对参考数据库以鉴定甲基化肽段。在本方案中，我们使用 MaxQuant 1.6.2.10 版本进行分析。运行 MaxQuant 至少需要 2 GB 的内存，以及足够的磁盘空间来存储所有原始数据和输出文件。
   注意：有关安装及硬件和软件要求的所有详细信息，请参阅 https://www.maxquant.org 上的官方文档。
2. 将每个原始数据文件复制一份。将原始文件的文件名末尾添加 "_light" 进行重命名，然后将副本文件的文件名末尾添加 "_heavy" 进行重命名。
   注意：用于下游分析的脚本 hmSEEKER 区分大小写。
3. 使用 表 3 中指定的设置启动 MaxQuant/Andromeda 搜索以进行肽段鉴定。MaxQuant 生成的多个输出数据中，仅需 allPeptides.txt 和 msms.txt 文件（位于 combined/txt 子文件夹中）用于后续处理步骤。
4. MaxQuant 输出数据的后续处理由 hmSEEKER 算法完成。可从以下地址下载 hmSEEKER：https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/。该脚本以 Python 3.7 编写的 Jupyter 笔记本形式提供，并附带一个用于测试的示例数据集。对于新用户，建议下载并安装 Anaconda 平台（https://www.anaconda.com/products/individual）。最新版本默认包含 Python 3.8、Jupyter 以及运行 hmSEEKER 所需的所有软件包（例如 Scikit-learn 0.23.1）。
5. 创建一个文件夹，并将 MaxQuant 输出中的 allPeptides.txt 和 msms.txt 文件存入该文件夹。
6. 启动 Jupyter（可通过命令行或 Anaconda Navigator 启动）。
7. 导航至 hmSEEKER 文件夹，并打开 hmSEEKER.ipynb。
8. 在笔记本的 输入参数 部分，指定 FASTA 数据库的路径以及包含 MaxQuant 文本文件的文件夹路径。
9. 通过选中每个单元格并点击 Jupyter 界面上方的 运行 按钮，执行每个单元格内的代码。
10. 该脚本为每个分析的数据集生成一个逗号分隔的输出文件，并生成一个合并文件。最终的双峰列表位于名为 "[date]-[time]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv" 的文件中。
    （表 4 包含输出表格中各列的简要说明）。

结果

本文描述了一种高置信度鉴定全局蛋白质精氨酸甲基化的工作流程，该流程基于将蛋白质提取物平行地用两种不同的蛋白酶进行酶解消化，随后对蛋白水解肽段进行HpH反相液相色谱分级，并利用抗广谱精氨酸甲基化抗体对精氨酸甲基化肽段进行免疫亲和富集（图1）。

细胞在甲硫氨酸存在条件下培养，甲硫氨酸为天然形式（轻型，L，Met-0）或同位素标记形式（重型，H，Met-4）。通过质谱分析对少量仅含Met-4的提取物进行检测，确认实现完全同位素标记后，收集重链和轻链细胞，并按1:1的轻/重（L/H）比例混合，如图1A所示。在¹³CD₃-甲硫氨酸代谢标记过程中，甲基基团由甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）添加至蛋白质骨架，且将以轻同位素或重同位素形式存在²¹。图1B描述了由蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）家族催化的精氨酸甲基化反应，该反...

讨论

高置信度鉴定 体内 基于质谱的蛋白质组学中，蛋白质/肽段甲基化的全局分析具有挑战性，因为在样品制备过程中可能发生多种氨基酸替代以及甲基酯化反应，这些修饰与甲基化具有相同的质荷比，若缺乏正交质谱验证策略，易导致错误指认和较高的假发现率（FDR）。该翻译后修饰的亚化学计量特性进一步增加了全局甲基化蛋白质组学的难度，但可通过修饰肽段的选择性富集加以克服。¹⁰.

本文介绍了一种生化与分析工作流程，该流程旨在通过结合重甲基稳定同位素标记（hmSILAC）策略、高pH反相色谱（HpH-RP）肽段分级分离以及抗广谱R-甲基化肽抗体试剂盒的亲和富集，提高全局质谱分析R-甲基化肽的效率与可靠性。前一种策略可实现对甲基化肽的正交验证，并显著降低鉴定的假发现率（FDR）；而后一方案则可增强甲基化肽在未修饰肽背景中的可检测性²²。然而，该方案的一个局限性在于需要大量起始蛋白提取物（输入量在20–40 mg范围内），以进行后续的肽段分级分离和亲和富集，这限制了该方法仅适用于可大规模扩增的永生化、...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
碳酸氢铵 (AMBIC)	Sigma-Aldrich	09830
过硫酸铵（APS）	Sigma-Aldrich	497363
C18 Sep-Pak 柱，真空 6 cc（1 g）	沃特斯	WAT036905
胶体考马斯亮蓝染色即用型	Sigma-Aldrich	ISB1L-1L
cOmplete Mini，无EDTA	罗氏-西格玛奥德里奇	11836170001	蛋白酶抑制剂
透析胎牛血清（FBS）	GIBCO ThermoFisher	26400-044
DL-二硫苏糖醇（DTT）	Sigma-Aldrich	3483-12-3
DMEM培养基	GIBCO ThermoFisher	请求的	含稳定型谷氨酰胺且不含甲硫氨酸
EASY-nano LC 1200 色谱系统	ThermoFisher
EASY-Spray 高效液相色谱柱	赛默飞世尔科技	ES907
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
HeLa 细胞	ATCC	ATCC CCL-2
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
碘乙酰胺（IAA）	Sigma-Aldrich	144-48-9
Jupiter C12-RP 色谱柱	Phenomenex	00G-4396-E0
L-甲硫氨酸	Sigma-Aldrich	M5308	轻（L）甲硫氨酸
L-甲硫氨酸-(甲基-13C,d3)	Sigma-Aldrich	299154	重（H）甲硫氨酸
LysargiNase	默克密理博	EMS0008
Microtip 细胞破碎仪 Sonifier 250	布拉松
N,N,N′，N′四甲基乙二胺（TEMED）	Sigma-Aldrich	T9281
青霉素-链霉素	GIBCO ThermoFisher	15140122
PhosSTOP	罗氏-西格玛奥德里奇	4906837001	磷酸酶抑制剂
Pierce C18 Tips	ThermoFisher	87782
皮尔斯  乙腈中0.1%甲酸（v/v），LC-MS级	赛默飞世尔科技	85175	LC-MS 溶剂 B
皮尔斯  水（LC-MS级）中的0.1%甲酸（v/v）	赛默飞世尔科技	85170	LC-MS 溶剂 A
皮尔斯  乙腈（ACN），液相色谱-质谱级	赛默飞世尔科技	51101
皮尔斯  水，液相色谱-质谱级	ThermoFisher	51140
聚丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	92560
Precision Plus Protein  所有蓝色预染蛋白质标准品	伯乐（Bio-Rad）	1610373
PTMScan 抗体 α-ADMA	细胞信号技术公司	13474
PTMScan 抗体 α-甲基丙烯酸甲酯	细胞信号技术公司	12235
PTMScan 抗体 α-SDMA	细胞信号技术公司	13563
Q Exactive HF 混合四极杆-轨道阱质谱仪	赛默飞世尔科技
测序级修饰胰蛋白酶	Promega	V5113
三氟乙酸	Sigma-Aldrich	T6508
Ultimate 3000 高效液相色谱仪	Dionex
尿素	Sigma-Aldrich	U5378
真空浓缩仪 5301	Eppendorf		真空浓缩仪