监测氧诱导视网膜病变小鼠模型中视网膜血管的动态生长

摘要

本方案详细描述了小鼠视网膜平铺片的制备与免疫荧光染色及分析方法。同时详细介绍了小鼠幼崽的荧光素眼底血管造影（FFA）技术及图像处理方法。

摘要

氧诱导视网膜病变（OIR）被广泛用于研究包括早产儿视网膜病变（ROP）、增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）和视网膜静脉阻塞（RVO）在内的缺血性视网膜疾病中的异常血管生长。大多数OIR研究仅在特定时间点观察视网膜新生血管形成；然而，活体小鼠在时间进程中的动态血管生长过程——这对于理解与OIR相关的血管疾病至关重要——仍研究不足。本文中，我们描述了一种诱导OIR小鼠模型的逐步实验方案，强调了潜在的技术难点，并提供了一种改进的方法，通过免疫荧光染色快速定量血管闭塞（VO）和新生血管（NV）区域。更重要的是，我们在OIR小鼠模型中通过荧光素眼底血管造影（FFA）对活体小鼠从P15到P25期间的血管再生过程进行了连续监测。将FFA应用于OIR小鼠模型使我们能够观察血管再生过程中的重塑变化。

引言

视网膜新生血管形成（RNV）是指病理性新生血管起源于现有的视网膜静脉，通常沿视网膜内表面延伸，并向玻璃体（或在某些情况下向视网膜下腔）生长¹。它是多种缺血性视网膜病变的典型特征和常见表现，包括早产儿视网膜病变（ROP）、视网膜静脉阻塞（RVO）和增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）²。

大量临床和实验观察表明，缺血是视网膜新生血管形成的主要原因^3,4。在早产儿视网膜病变（ROP）中，为了提高存活率，新生儿在密闭培养箱中暴露于高浓度氧气环境，这同时也是导致血管生长停滞的重要因素。治疗结束后，新生儿视网膜会经历一个相对缺氧的时期⁵。在视网膜静脉阻塞（RVO）中可观察到中央或分支视网膜静脉的闭塞情况，而在增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）中则可见由微血管病变引起的视网膜毛细血管损伤²。缺氧进一步通过缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）信号通路增加血管生成因子（如血管内皮生长因子，VEGF）的表达，从而引导血管内皮细胞向缺氧区域生长并形成新生血管^6,7。

方案

所有涉及小鼠使用的实验程序均经中山大学中山眼科中心动物实验伦理委员会批准（批准编号：2020-082），并遵循中山眼科中心动物护理与使用委员会及视力与眼科研究协会（ARVO）《眼科与视力研究中动物使用声明》中的相关规定。

1. 小鼠OIR模型的诱导

1. 选用眼部先天畸形发生率较低的小鼠品系，例如 C57BL/6J 小鼠，以雄:雌 = 1:2 的比例进行交配。获取同一天出生的仔鼠，并于出生后第 7 天（P7）开始建立氧诱导视网膜病变（OIR）模型。建模前严格记录每只仔鼠的体重。
   注意：将出生当天记为 P0。定期记录每只小鼠的体重。新生仔鼠的体重在 OIR 模型诱导过程中至关重要，因为不同状态小鼠对氧气的敏感性存在差异。在 P7 时剔除体重超过 5 g 的仔鼠，以确保实验结果具有可比性。
2. 为哺乳母鼠及其仔鼠提供适宜的生活环境，例如将环境温度设定为 23 °C ± 2 °C，湿度控制在 40%–65%，每日实行 12 小时光照与 12 小时黑暗交替，笼内添加适量脱脂棉供筑巢使用，保证充足的灭菌饲料和饮水，并将动物饲养于独立通风笼具（IVC）中。
3. 监测氧舱内的湿度和温度水平。将湿度控制在 40% 至 65% 之间，温度维持在 23 °C ± 2 °C。
4. 使用氧气传感器检测氧气供应情况，维持氧浓度恒定在 75%，并控制氧气流速在 0.5–0.75 L/min。在氧舱底部放置 50 g 钠石灰，....

结果

在OIR小鼠模型中，最重要且最基本的结果是对无灌注区（VO）和新生血管（NV）面积的定量分析。从出生后第7天（P7）起，幼鼠在高氧环境中生活5天后，视网膜中央区域出现最大范围的无灌注区。随后在低氧刺激下持续5天，视网膜逐渐形成新生血管，其荧光强度高于周围正常血管。出生后第17天（P17）之后，随着视网膜的重塑，病理性新生血管的荧光信号迅速消退（图5A）。通过控制每窝幼鼠数量及其出生后的体重增长，OIR小鼠模型中的VO和NV面积表现出良好的重复性和稳定性，且视网膜新生血管的峰值出现在P17，与既往研究结果一致（图5B、C）。

荧光素眼底血管造影（FFA）是研究视网膜血管结构的理想工具。由于FFA可在活体（in vivo）中应用，因此能显著减少实验动物的消耗，同时可随时间动态观察视网膜血管的变化。在以往的研究中，FFA较少用于新生小鼠，且通常仅提供单一视角的图像，不利于进一步分析。在本实验方案中，通过图像处理软件将视.......

讨论

小鼠对氧诱导视网膜病变（OIR）的易感性受多种因素影响。不同遗传背景和品系的幼鼠之间不可相互比较。在BALB/c白化小鼠中，血管会迅速重新生长进入无血管区（VO区域），新生血管簇显著减少³⁸，这给研究带来一定困难。与BALB/cJ小鼠品系相比，C57BL/6小鼠表现出更严重的光感受器损伤^39,40。不同类型的转基因小鼠也存在类似差异^41,42,43。此外，与129S3/SvIM小鼠相比，C57BL/6小鼠的血管生成水平较低⁴⁴。

出生后体重增长（PWG）也是需要考虑的重要因素⁴⁵，是评估新生儿营养状况的指标之一。PWG 已成为预测早产儿视网.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 无菌注射器	Solarbio	YA0550	用于制备视网膜平铺片及腹腔注射
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）	Transgen Biotech	FG701-01	用于制备视网膜平铺片
2 ml 微型离心管	Corning	MCT-200-C	用于制备视网膜平铺片
48 孔透明 TC 处理多孔板	Corning	3548	用于制备视网膜平铺片
粘附性显微镜载玻片	Various		用于制备视网膜平铺片
Adobe Photoshop CC 2019	Adobe Inc.		用于图像分析
二氧化碳气体	Various		用于安乐死
盖玻片	Various		用于制备视网膜平铺片
弯头镊子	World Precision Instruments	14127	用于制备视网膜平铺片
DAPI 染色液	Abcam	ab228549	用于视网膜平铺片上细胞核的标记
解剖显微镜	Olmpus	SZ61	用于制备视网膜平铺片
荧光素钠	Sigma-Aldrich	F6377	用于 in vivo 成像
荧光显微镜	Zeiss	AxioImager.Z2	用于获取视网膜平铺片的荧光图像
Fluoromount-G 封片介质	SouthernBiotech	0100-01	用于制备视网膜平铺片
羟丙基甲基纤维素	Maya	89161	用于 in vivo 成像
Isolectin B4 594 抗体	Invitrogen	I21413	用于视网膜平铺片上视网膜血管系统的标记
小鼠 C57/BL6J	江苏集萃药康生物科技股份有限公司		用于氧诱导视网膜病变模型的建立
直刃显微解剖剪	World Precision Instruments	503242	用于制备视网膜平铺片
4 号直头镊子	World Precision Instruments	501978-6	用于制备视网膜平铺片
正常驴血清	Abcam	ab7475	用于制备视网膜平铺片
O2 传感器	Various		用于监测 O2 浓度
OxyCycler	Biospherix	A84XOV	用于氧诱导视网膜病变模型的建立
多聚甲醛（PFA）	Sigma	P6148-1KG	用于组织固定
戊巴比妥钠	Various		用于麻醉
钠石灰	Various		用于吸收氧舱中过量的 CO2
SPECTRALIS HRA+OCT	Heidelberg	HC00500002	用于 in vivo 成像
SPSS Statistics 22.0	IBM		用于统计分析
脱色摇床	Kylin-Bell	ZD-2008	用于制备视网膜平铺片
组织培养皿（低吸附）	Corning	3261-20EA	用于制备视网膜平铺片
移液管	Various		用于制备视网膜平铺片
Triton X-100	Sigma-Aldrich	SLBW6818	用于制备视网膜平铺片
托吡卡胺	Various		用于 in vivo 成像
ZEN 成像软件	ZEISS		用于图像采集与导出