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在钻石光源XChem设施实现高效的片段筛选

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DOI：

10.3791/62414

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2021年5月29日

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1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell, Harwell Science and Innovation Campus, 3Structural Genomics Consortium, University of Oxford, 4Centre for Medicines Discovery, University of Oxford, 5Oxford Protein Informatics Group, Department of Statistics, Oxford University, 6Department of Biochemistry, University of Johannesburg

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了基于晶体的片段筛选的完整XChem流程，从申请使用权限开始，到后续所有步骤直至数据发布。

摘要

在基于片段的药物发现中，会针对目标蛋白筛选数百个甚至数千个小分子化合物（通常小于约300 Da），以鉴定出可进一步开发为高效候选药物的化学实体。由于这些化合物分子量较小，与蛋白的相互作用较弱，因此筛选方法必须具有高度灵敏性；此外，获得结构信息对于将这些初筛命中物优化为具有先导化合物特征的分子通常至关重要。因此，蛋白质晶体学一直是金标准技术，但历史上由于技术难度较高，难以作为初筛手段被广泛采用。

XChem 的初步实验于 2014 年完成演示，随后与学术界和工业界合作者共同开展试验，以验证该流程的可行性。此后，通过大量的研究工作和大量的同步辐射机时，优化了样品制备流程，建立了具备快速后续研究潜力的片段分子库，实现了 I04-1 光束线的自动化并提升了其无人值守数据采集能力，同时开发了用于数据管理、数据分析和苗头化合物识别的新工具。

XChem 现已成为一个用于大规模晶体学片段筛选的设施，支持从晶体到结构提交的完整流程，并向全球的学术界和工业界用户开放。自2016年以来，经过同行评审的学术用户计划已积极发展，旨在容纳尽可能广泛的科研项目，包括经过充分验证的项目以及探索性项目。学术访问权限通过每半年一次的同行评审提案征集进行分配，而企业专属项目则由Diamond同步辐射光源的工业联络组负责安排。该工作流程已常规应用于来自多种治疗领域的百余个靶点，能够有效识别弱结合配体（命中率为1%–30%），这些配体不仅可作为化合物设计的高质量起点，还能提供关于结合位点的大量结构信息。在新冠疫情期间，该流程展现出强大的适应能力，持续开展了针对SARS-CoV-2靶点的筛选工作，其中包括主蛋白酶在3周内完成的快速筛选周期。

引言

基于片段的药物发现（Fragment-Based Drug Discovery, FBDD）是一种广泛使用的先导化合物发现策略。自25年前提出以来，该策略已成功推动四种药物进入临床应用，并有超过40种分子进入临床试验阶段1,2,3。片段是一类分子量通常不超过300 Da的小型化学实体，因其化学结构复杂性较低而被选用，可为开发具有优异理化性质且配体效率高的强效抑制剂提供良好的起点。由于片段体积较小，相较于更大、更接近药物或先导化合物的分子库，它们能更全面地探测蛋白质的结合空间，从而揭示结合热点以及潜在的变构位点。结合结构信息，片段可提供蛋白质与配体之间潜在分子相互作用的详细图谱。然而，这些片段通常与靶标蛋白的结合较弱，因此可靠地检测和验证其结合行为需要一系列稳健且灵敏的生物物理筛选方法，例如表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）、核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）或等温滴定 calorimetry（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）4,5。

X射线晶体学是片段筛选（FBDD）工具包中的关键组成部分：其灵敏度足以识别弱结合配体，并能直接提供分子水平上相互作用的结构信息。该方法与其他生物物理筛选技术相辅相成，通常对于将片段命中化合物推进至先导化合物至关重要；其应用依赖于高质量的晶体体系，即结晶过程需具有高度可重复性，且理想情况下晶体衍射分辨率应优于2.8 Å。

从历史上看，无论是在学术界还是工业界，使用晶体学作为主要的片段筛选方法都非常困难6,7,8。相比之下，同步辐射光源在机器人技术、自动化9,10,11以及探测器技术12,13方面实现了数量级的提升，并结合数据处理中计算能力与算法的同步快速发展14,15,16，如今可在数秒内完成完整的衍射数据采集，并实现大量样品的全自动无人操作，这一技术最初由LillyCAT7开创，随后在MASSIF17,18（欧洲同步辐射装置（ESRF））得到进一步发展。这促使同步辐射设施开发出高度流程化的平台，使基于晶体的片段筛选作为主要筛选手段得以面向广泛的用户群体开放使用（Diamond光源的XChem；EMBL/ESRF的CrystalDirect19；柏林亥姆霍兹中心的BESSY20；MaxIV的FragMax21）。

本文记录了XChem平台用于X射线晶体学片段筛选的完整实验流程，涵盖从样品制备到获得三维建模命中化合物最终结构结果的全过程。该流程（图1）需要开发新的晶体识别22、浸泡23和收获24方法，以及数据管理软件25和一种用于识别片段的算法方法26，后者目前已在学术界广泛应用。晶体收获技术现已被一家厂商商业化（参见材料表），而相关工具的公开可用性也使其他同步辐射光源能够借鉴并建立类似的平台21。当前正在进行的项目包括通过Fragalysis平台开展的数据分析、模型完善和数据共享27。样品制备实验室紧邻I04-1光束线，便于将数百个冷冻样品快速转移至光束线，且I04-1的专用机时可实现快速的X射线反馈，从而指导整个筛选工作的推进。

XChem 是 Diamond 用户计划的重要组成部分，每年开放两次申请（4 月初和 10 月）。同行评审流程经与学术界和工业界药物发现领域的专家协商后不断优化。除了需要具备扎实的科学依据外，申请流程28还要求申请人不仅对晶体系统的成熟度进行自我评估，还需评估其在生物化学及正交生物物理方法方面的专业知识，以及通过后续化学手段推进筛选命中化合物的能力。为适应多学科用户群体的需求，访问模式也已逐步发展完善：

第一层级（单个项目）适用于处于探索阶段的项目，无需具备验证工具（生物物理或生化工具）及后续研究策略。若项目获得通过，将被授予较少的机时班次，足以完成概念验证。

第二层级（单个项目）适用于经过充分验证的项目，要求已具备下游工具和后续研究策略。若获批准，该项目将被分配足够的同步辐射机时，以完成完整的片段筛选实验。单个项目（第一层级或第二层级）须在分配周期的6个月内完成（分配周期为4月至9月或10月至次年3月）。

区块分配组 (Block Allocation Group, BAG) 适用于由多个研究组和项目组成的联合体，要求该联合体内具备健全的靶标筛选与优先级确定流程，并拥有明确的后续研究路径。每个 BAG 必须至少拥有一名完全接受过 XChem 培训的专家（超级用户），负责协调与 Diamond 工作人员的协作，并对 BAG 成员进行培训。分配的机时班次数量取决于 BAG 内具有科学价值的项目数量，并将根据 BAG 提交的报告在每个分配周期内重新评估。该访问权限有效期为两年。

XChem 实验分为三个阶段，每个阶段均设有决策点：溶剂耐受性测试、预筛和主筛（图2）。溶剂耐受性测试用于确定浸泡参数，即晶体系统可耐受的溶剂（如DMSO、乙二醇或其他必要冷冻保护剂）浓度及其耐受时间。溶剂浓度通常设置为5%-30%，至少考察两个时间点。收集衍射数据，并与晶体系统的本底衍射数据进行比较，以确定下一阶段的浸泡条件。在预筛阶段，使用溶剂测试中确定的条件对100-150个化合物进行浸泡，目的是确认晶体在这些条件下能否耐受化合物的存在。如有需要，可在已含有片段的液滴中随后加入冷冻保护剂。成功的标准是80%或以上的晶体能够良好存活，并产生质量良好且一致的衍射数据；若未达标，通常需通过调整浸泡时间或溶剂浓度来优化浸泡条件。预筛成功后，即可采用最终确定的参数开展实验中其余化合物的处理。

DSI-poised 化合物库（见材料表）专为利用“预激活化学”（poised chemistry）29 实现快速后续研究而设计，是本设施的核心化合物库。该库化合物以 500 mM 的浓度溶于 DMSO 中供用户使用。学术用户还可获取合作者提供的其他化合物库（总计超过 2,000 种化合物），浓度为 100–500 mM，溶剂为 DMSO（完整列表可参见网站28）。对于不能耐受 DMSO 的晶体体系，大部分化合物也提供乙二醇溶液形式。用户也可自带化合物库，但须确保其微孔板与声波液体处理系统兼容（见材料表）。

对于实验的全部三个步骤（溶剂表征、预筛选或全筛），以下样品制备流程均相同（图3）：通过成像并利用 TeXRank22 对结晶液滴进行靶向定位，以选择化合物加样位置；使用声波液体分配系统向液滴中分配溶剂和化合物23；利用 Crystal shifter 高效收集晶体24；以及将样品信息上传至光束线数据库（ISPyB）。当前用于实验设计与执行的界面是一个基于 Excel 的应用程序（SoakDB），该程序可为平台上的各种设备生成必要的输入文件，并在 SQLite 数据库中跟踪和记录所有结果。在整个流程的多个阶段均使用条形码扫描仪协助样品追踪，相关数据亦被添加至数据库中。

使用I04-1线站的专用机时，以无人值守模式收集衍射数据。提供两种中心定位模式，即光学定位和基于X射线的定位17。对于针状和棒状晶体，建议采用X射线定位；而对于较粗大的晶体，通常可使用光学模式，该模式速度更快，因此可在规定的机时内收集更多样品。根据晶体的分辨率（进入平台前已确定），数据收集的总曝光时间可选择60秒或15秒。溶剂测试阶段的数据收集通常可为I04-1线站的最佳参数组合提供依据。

大量数据分析通过XChemExplorer（XCE）25进行管理，也可使用XCE启动基于PanDDA26的命中识别步骤。XCE是一种数据管理和工作流程工具，支持对蛋白质-配体结构进行大规模分析（图4）；它可读取在Diamond Light Source收集数据后产生的各种自动处理结果（包括DIALS16、Xia214、AutoPROC30和STARANISO31），并根据数据质量及与参考模型的相似性自动选择其中一种结果。该参考模型必须能代表用于XChem筛选的晶体体系，并且必须包含仅用溶剂浸泡晶体时可见的所有水分子或其他溶剂分子，以及所有辅因子、配体和替代构象。参考模型的质量将直接影响后续模型构建和精修阶段所需的工作量。PanDDA用于分析所有数据并识别结合位点。它将各结构与参考结构对齐，计算统计图谱，识别事件，并生成事件图谱26,32。在PanDDA的分析范式中，无需也不建议构建完整的晶体学模型；需要建模的仅是片段结合处的蛋白局部结构（即结合态模型），因此只需根据事件图谱专注于构建配体及其周围的残基和溶剂分子即可32。

方案

1. 项目提案提交

  1. 提案内容：由于XChem项目申请量超过承载能力，提案中提供详尽且完整的信息对于通过同行评审至关重要。
    1. 阐明研究意义！阐述靶标的重要性，并将其置于更广泛的研究背景中。
      1. 明确片段筛选实验后的研究策略：已有的正交方法用于验证筛选命中化合物，以及后续如何推进这些化合物的研究。如有需要，提前建立合作机制。
      2. 由于实验和数据分析部分工作量大且复杂，强烈建议提前指定一名经验丰富的晶体学家。
      3. 一个稳定的晶体系统是消除技术变异的关键，用户应重点关注以下基本要求。
        1. 确保结晶条件能够在适用于平台的板上产生可重复的液滴，所得晶体衍射质量相似，且每孔储液池体积为30 µL（或更小），液滴体积在200–500 nL之间。理想情况下，每块板中超过50%的液滴能生长出至少35 µm大小的晶体33。
        2. 确保晶体具有稳定的衍射质量（2.6 Å或更高分辨率）。
        3. 评估该晶体系统是否适用于片段筛选，包括晶体堆积方式以及已知结合位点的可及性。若已有分子结合于这些位点的先验证据，通常更具说服力。

2. 访问前的准备工作

  1. 现场结晶实验的结晶方案转移。
    1. 提供 2 × 50 mL 即用型储液溶液。
    2. 提供达到结晶所需浓度的蛋白质溶液，以 30–50 µL 分装量准备并可直接使用。
    3. 提供 10 mL 蛋白质缓冲液。
    4. 提供晶种储备液（即使结晶方案中未要求使用）。
      注：使用晶种有助于提高结晶的可重复性，并加快成核时间33。
    5. 填写 XChem 网站上提供的结晶信息表单28。
    6. 在 XChem 网站上提供的运输表单中填写储存信息28。
  2. 安装 NoMachine 软件，并设置连接至 Diamond 的远程桌面（https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment-at-Diamond/IT-User-Guide/Not-at-DLS/Nomachine.html）。
  3. 在专家级晶体学家或 XChem 支持人员的指导下，生成并传输一个高质量的参考模型。

3. 片段筛选实验

  1. 确定化合物分配位置。
    1. 成像结晶板。
      1. 使用结晶板成像仪（见材料表）对实验所需的所有结晶板（见材料表）进行成像。利用成像仪软件，在正确目录下按以下格式生成对应板类型的板名称：项目编号_板编号。
      2. 打印条形码（右键单击板名称并从菜单中选择），将其贴在板上与行字母相对的一侧，将板放入装载口时条形码朝向远离操作者的方向。
      3. 使用成像仪控制软件，扫描装载口，右键单击板，然后选择成像板。
      4. 成像完成后，从成像仪中取出板。
    2. 选择晶体及化合物添加位置
      注意：结晶液滴的图像将在Luigi流程中通过TexRank基于textons的排序算法（Ranker）进行处理，以根据晶体存在的可能性对液滴进行排序22。该过程约需10分钟，之后图像将在TexRank中可用。
      1. 从PC打开TeXRank，通过右下角列表或在左上角输入条形码来选择晶体托盘。
      2. 选择正确的成像格式和单孔视图。浏览液滴图像，当发现适合用于实验的晶体时，在晶体之外但仍在液滴内部单击右键——目标是确定向液滴中添加溶剂/化合物的位置，因此不应直接命中晶体23。
      3. 继续浏览整块板，完成后选择Echo 1 Target按钮；将文件保存至相应访问记录的晶体目标目录下。请勿更改文件名。
      4. 如有其他板，重复上述步骤。
  2. 化合物分配
    1. 生成用于化合物分配的文件
      1. 在SoakDB中，在库/溶剂表中输入文库筛选或溶剂信息。
      2. 输入液滴体积，并载入目标晶体列表。
      3. 生成所需的批次。
      4. 输入浸泡参数。点击计算，然后点击导出待处理项按钮。对于溶剂，将不同浓度添加到表格中。这将生成用于声波分配仪的文件。
      5. 若使用冷冻保护剂，输入其浓度并以相同方式生成文件。
    2. 使用声波分配仪分配溶液（见材料表）
      1. 取源板（化合物或溶剂/冷冻保护剂），在离心机中以1,000 × g离心2分钟。
      2. 若分配溶剂或冷冻保护剂，用移液器将30 µL加入384PP板的相应孔中；用微密封膜覆盖后，按上述条件离心。
      3. 打开软件；选择新建，并选择正确的源板类型（384PP、384LDV或1536LDV）和液体类别（DMSO、CP、BP或GP）。确保选择正确的板类型作为目标板。然后勾选自定义框并继续。
      4. 选择导入，并选择相应的批次文件。根据软件提示完成导入步骤。
      5. 使用板图检查待分配的溶液及其目标位置。
      6. 运行程序，按提示操作。源板中的溶液将被分配至选定的晶体液滴中。
      7. 将板在孵育箱中存放所需时间。
        注意：这些参数在溶剂表征步骤中确定，温度将根据晶体生长温度设为4 °C或20 °C，时间通常在1小时至3小时之间。
  3. 使用半自动晶体收获装置收获晶体（见材料表）。
    注意：如需冷冻保护，应在收获样品前重复步骤3.2.2，将冷冻保护剂溶液添加至晶体液滴。
    1. 收获前准备
      1. 在SoakDB中准备收获所需的文件。当系统询问时，确认浸泡已完成且批次已结束。
      2. 在正确的项目编号下扫描出实验所需数量的样品托（puck）。
      3. 选择合适尺寸环的托盘用于晶体（35 µm、75 µm或150 µm）。重要的是，应尽可能选择与晶体尺寸匹配的环，以便在光束线上实现更精确的自动居中，通过减少背景提高数据质量，并避免使用冷冻保护剂。
      4. 打开相关软件，打开工作流程标签页。
      5. 将puck扫描进软件，并滚动回到列表顶部，高亮第一个puck。
      6. 将puck放入泡沫杜瓦瓶中，并用液氮冷却。
      7. 选择从SoakDB导入文件，并选择要收获的批次；检查该批次是否分配给左手侧支架。工作列表将出现。
      8. 取结晶板，移除密封，放入左手侧支架；将板移至停放位置。
    2. 收获晶体
      1. 调整好姿势后，按下启动工作流程按钮（屏幕为触摸屏），移动至第一个选定的孔位。
      2. 如果晶体仍完好，将晶体装入环中，迅速浸入液氮，并将其放置在列表中第一个puck的1号位置。
      3. 从界面中选择晶体的适当描述（正常、融化、开裂、果冻状或有色）。
      4. 如果液滴为化合物浸泡，记录化合物状态的描述（澄清、结晶、沉淀、分配不良或相分离）。
      5. 如果晶体成功装入，选择已装入，否则选择失败。
      6. 板将移至下一个选定的孔。连续填满所有puck位置（即使某个晶体失败也不留空位）。继续直至工作流程结束。
      7. 工作流程结束后，加载任何额外批次，并按顺序继续填满puck。新批次无需开启新的puck。
    3. 收获结果的条形码追踪
      1. 所有晶体收获完毕后，将puck送至条形码扫描仪，依次放入支架中扫描puck和针的条形码。
      2. 完成后，为puck盖上盖子，并存放在液氮储存杜瓦瓶中。
      3. 将输出文件加载到SoakDB界面中。
    4. 将样品信息录入ISPyB34,35,36
      1. 将样品数据上传至ISPyB
        1. 在SoakDB中更新光束线访问记录为ISPyB更新，点击导出以生成可上传至ISPyB的文件。
        2. 打开Putty。登录后浏览至以下目录：dls/labxchem/data/year/lbXXXX-1/processing/lab36/ispyb。
        3. 运行脚本csv2ispyb（csv2ispyb lbXXXX-1-date.csv）
          注意：样品现已加载至ISPyB。
      2. 记录puck位置和数据采集策略。
        1. 记录puck的详细信息和位置
          注意：记录puck的详细信息和位置非常重要，以便后续定位并将其装载到光束线上。
          1. 在SoakDB中，打开标有Pucks的第二个标签页。
          2. 填写顶部各框中的信息。具体包括puck的位置（储存杜瓦瓶和提杆）、数据采集参数，包括预期分辨率和项目编号。
          3. 点击保存按钮，所有puck的列表将出现在表格中。复制最近填写的puck信息。
          4. 打开XChem队列电子表格（桌面快捷方式），粘贴信息，并填写任何其他相关信息。

4. 数据采集

注意：数据以无人值守模式采集，并由 XChem/光束线团队管理。

  1. 重新收集未正确居中的样品。
    ​注意：当某些样品的数据收集出现问题时，需要进行此操作，最常见的原因是样品针未正确居中。
    1. 在 ISPyB 中查看样品更换器界面，选择按自动处理分辨率排序，以从绿色到红色的颜色梯度对样品按自动处理分辨率进行排序。
    2. 点击样品，检查是否存在红色或黄色的样品。
      注意：这将显示数据收集情况。
    3. 检查晶体快照，确认晶体是否已居中。
    4. 记录所有未居中的样品，并发送给本地联系人，由其重新收集缺失的样品。

5. 数据分析

  1. 通过 XChemExplorer (XCE) 检索和分析 Diamond 的自动处理结果25。
    1. 在终端中，进入子文件夹 Processing：cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing，或对于 XChem BAGs：cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing/project/processing/。
    2. 使用别名 xce 打开 XChemExplorer。
    3. 点击 Update Tables From Datasource 按钮。
    4. 在 Overview 选项卡下，可查看实验数据的摘要。通过 Datasource 菜单中的 Select Columns to Show 选项添加额外的分类。
    5. 在 Settings 选项卡下，选择数据收集目录（/dls/i04-1/data/year/visit/）。
    6. 打开 Datasets 选项卡，从 Select Target 下拉菜单中选择目标，从 Datasets 下拉菜单中选择 Get New Results from Auto processing，然后点击 Run。
      注意：XCE 现在将解析数据收集访问中的自动处理结果。首次运行时可能需要较长时间，具体取决于正在解析的数据集/目录数量。
    7. 通过检查分辨率、空间群和 Rmerge 来评估数据的一致性和质量。排除分辨率低于 2.8 Å 的数据。
      注意：默认情况下，数据集的选择基于从 I/sigI、完整度和唯一反射数计算出的评分，但也可选择其他处理结果25。
    8. 如需为单个数据集选择不同的处理结果，可点击 Sample ID 并选择所需的程序/运行。如需为所有数据集更改处理流程，请从 Preferences 菜单中选择 Edit preferences，并更改 Dataset Selection Mechanism。
    9. 如有需要，通过 ISPyB37 重新处理数据。
    10. 如果某个样品的处理数据均不可接受，则标记为 Failed ，以排除在后续分析之外。
    11. 完成后，点击 Update Tables From Datasource，将数据添加到后续表格中。
  2. 使用 DIMPLE38 计算初始电子密度图。
    1. 打开 Maps 选项卡，从下拉菜单中选择参考模型，选择所需的数据集，然后点击 Run DIMPLE on selected MTZ files。
    2. XCE 在 Diamond 的集群上同时运行多个 DIMPLE 任务。可在 Dimple Status 列中查看这些任务的状态，并通过 Update Tables from Datasource 按钮或在 Linux 中使用 qstat 命令刷新状态。
    3. 完成后，检查 Dimple Rcryst、Dimple Rfree 和空间群的值是否可接受。如有必要（Rfree 过高/空间群错误/晶胞体积差异较大），按前述方法更改自动处理结果，并对这些数据集重新生成电子密度图。
  3. 使用 Grade39、AceDRG40 或 phenix.eLBOW41 生成配体限制参数。
    1. 选择所需的程序（Preferences, Edit preferences, Restraints generation program），然后在 Maps 选项卡下选择数据集，接着从 Maps & Restraints 下拉菜单中运行 Create CIF/PDB/PNG file of SELECTED compounds。
    2. 使用 Update Tables from Datasource 按钮刷新 Compound Status 列中任务的状态。
  4. 构建基态模型（预运行）
    注意：“基态模型”表示蛋白质在无配体状态下的结构，基于 100 个数据集观察得到（此数量为任意选择）。由于基态模型将作为构建配体结合态模型的参考，因此在分析整个片段筛选项目之前，必须准确构建包含所有溶剂和水分子的基态模型。在此步骤中，使用 PanDDA 标记为无显著事件（因此可能为无配体状态）的前一百个最高分辨率数据集生成基态平均电子密度图，同时选择 Rfree 最低的数据集用于精修。基态平均电子密度图并非晶体学意义上的电子密度图，但必须仅使用该图来构建基态模型。
    1. 打开 PanDDAs 选项卡，如有需要，从数据源更新表格。
    2. 定义 Output Directory（/dls/labxchem/data/year/visit/processing/analysis/panddas）。
    3. 选择 Pre-run for Ground State Model，然后点击 Run。
      注意：具有高 Rfree 和异常空间群的数据集应自动从分析中排除。
    4. 如需手动排除具有高 Rfree 和异常空间群的数据集，请选择 Ignore Completely。
    5. 在终端窗口中使用 qstat 检查预运行任务的状态。
    6. 完成后，选择 Build ground state model，然后点击 Run。
      注意：这将在 Coot 中打开 PanDDA 平均电子密度图，以及来自最佳质量数据集的参考模型/2Fo-Fc/Fo-Fc 电子密度图，用于在 Coot 中进行重新建模和精修。建模时必须仅使用 PanDDA 平均电子密度图。
  5. 使用 PanDDA26 识别命中结果
    1. PanDDA 分析
      注意：如果数据集数量众多、晶胞较大，或非对称单元中存在多个蛋白拷贝，则在集群上运行可能需要较长时间。
      1. 重复之前描述的 Analyse DLS Auto-processing Results 和 Initial Map Calculation 步骤。在计算电子密度图时，使用基态模型作为参考：Refresh Reference File List > Set New Reference，并根据需要为新数据生成 Ligand Restraints（步骤 6.1–6.3）。
      2. 在 XCE 的 PanDDAs 选项卡下，确保输出目录已正确设置，然后从 Hit Identification 下拉菜单中运行 pandda.analyse。
      3. 在 Linux 终端中使用 qstat 命令检查任务状态。
    2. PanDDA inspect — 检查/构建结合 events
      1. 在 XCE 的 PanDDAs 选项卡下，从 Hit Identification 下拉菜单中运行 pandda.inspect，以在 Coot42 中打开 PanDDA 控制面板。
        注意：pandda.inspect 控制面板提供 PanDDA 统计信息的摘要，并允许用户浏览结合事件/位点。还会生成结果的摘要 HTML 文件，可在检查过程中通过选择 Update HTML 进行更新。
      2. 建模配体时，在跳转到另一个事件之前，点击 Merge Ligand With Model 和 Save Model ，以避免丢失对结合态模型的任何修改。
        注意：只有已更新并保存的模型才会在后续阶段导出用于精修。
      3. 使用 Event Comment 字段注释结合事件，并使用 Record Site Information 注释结合位点。
      4. 加载平均电子密度图和 2mFo-DFc 电子密度图（来自 DIMPLE），以便与事件电子密度图和模型进行比较。
        1. 当所有可行的配体均基于事件电子密度图完成建模、合并和保存后，关闭 pandda.inspect。
    3. PanDDA 导出与精修
      注意：PanDDA inspect 完成后，模型将导回项目目录，并启动初步精修。目前在 XCE 的 PANDDAs 选项卡下提供两种可用的流程。
      1. Export NEW/ALL/SELECTED PANDDA models 将生成结合态和非结合态模型的集合用于精修，并为 Refmac43 生成占有率限制参数。
        注意：该集合模型将用于精修，但仅结合态模型将在 Coot 中更新并提交至 PDB。此流程最适合用于低占有率片段或蛋白模型发生显著变化的数据集。
      2. Refine NEW/ALL bound-state models with BUSTER 仅使用 Buster44 对结合态模型进行精修。
        注意：此流程最适合用于高占有率配体或蛋白模型变化较小的数据集。
  6. 精修命中结果（所有选中用于精修的数据集现在将在 Refinement 选项卡中可见）。从 Refinement 下拉菜单中选择 Open COOT - BUSTER Refinement 或 Open COOT - REFMAC Refinement，以在 Coot 中打开 XCE Refinement 控制面板。
    1. 从 Select Samples 下拉菜单中选择待精修样品的状态（通常为 3 - in refinement），然后点击 GO。
      注意：XCE 控制面板提供该类别数据集数量的摘要，并允许在数据集之间导航，同时显示精修统计信息摘要。
    2. 在 XCE 控制面板中注释配体置信度：0 - no ligand present — 片段未结合；1 - Low Confidence — 片段可能结合，但证据不充分；2 - Correct ligand, weak density — 用户确信片段已结合，但占有率低/电子密度图存在某些问题；3 - Clear density, unexpected ligand — 电子密度图明确显示配体结合，但与提供的化学结构不符；4 - High confidence — 配体明确结合。
    3. 在此阶段对模型进行必要的修改，并使用 Refine 按钮启动进一步精修。
    4. 使用 Show MolProbity To-Do List 按钮访问在所有精修循环中运行的 MolProbity45 分析。
    5. 如有需要，通过选择 Refinement Parameters 按钮添加精修参数，例如各向异性温度因子、孪晶数据或占有率精修。
      注意：XCE 的 Refinement 选项卡下也提供数据处理统计信息，若使用 Buster 流程进行精修，则还会提供包含 MOGUL 分析46 的 Buster 报告。
    6. 在主 XCE 窗口的 Refinement 选项卡或 Coot XCE 控制面板中，随着精修进展更改数据集的状态。当确认配体周围的模型准确且适合用于进一步分析时，将状态更改为 CompChem Ready。当精修完成且模型已准备好上传至 PDB 时，将状态更改为 Deposition ready。

6. 数据提交

注意：片段筛选的所有数据集以及用于生成 PanDDA 事件图的基态模型均可通过组合提交方式存入 PDB。

  1. 从Hit Identification菜单中运行Event Map ->SF，将所有PanDDA事件图谱转换为MTZ格式。
  2. 通过选择Deposition > Edit information提供作者和方法等附加元数据。填写所有必填项目，点击Save to Database，然后保存此信息以用于基态模型的提交。此操作应在模型状态更改为Deposition Ready后进行。
  3. 在Deposition 选项卡中，选择Prepare mmcif按钮，为所有Deposition Ready数据集生成结构因子mmcif文件。完成后，终端窗口将显示以下消息：Finished Preparing mmcif Files for wwPDB Deposition。
  4. 选择Copy mmcif按钮，将所有这些文件复制到本次访问的Group Deposition Directory中的单个bzipped tar压缩包中。
  5. 访问 https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit；使用用户名：grouptester 和密码：!2016rcsbpdb 登录。创建会话，并从组提交目录上传ligand-bound.tar.bz2文件。
  6. 在成功提交配体结合结构后，系统将发送包含PDB编号的电子邮件。从Deposition 菜单中选择Update DB with PDB Codes；将邮件中的信息复制粘贴到弹出窗口中，然后点击Update Database以添加PDB编号。
  7. 为提交PanDDA所使用的基态模型，请在XCE中选择相应的PanDDA目录，并从Hit Identification菜单中运行apo->mmcif。
    注意：XCE将任意选择一个高分辨率且Rfree较低的结构作为提交包中的模型，然后将所有结构因子mmcif文件合并为单个文件。
  8. 在Deposition 选项卡中，选择Group Deposition of Ground-State Model部分下方的Add to Database按钮。
  9. 输入基态模型的元数据（再次通过选择Deposition > Edit Information），加载之前的文件并点击Save to Database。
  10. 在Group Deposition of Ground-State Model 部分运行Prepare mmcif以准备基态mmcif文件，完成后，从同一部分选择Copy mmcif按钮，将mmcif文件复制到Group Deposition目录中。
  11. 与之前相同，访问 https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit；使用用户名：grouptester 和密码：!2016rcsbpdb 登录。创建会话，并从组提交目录上传ground_state_structures.tar.bz2文件。

结果

通过X射线晶体学进行片段筛选的XChem流程已得到显著优化，推动了其在科学界的应用（图5）。该流程已在超过150个筛选项目中得到验证，命中率介于1%至30%之间47,48,49,50,51,52，并获得了众多重复使用者的认可。在流程早期即排除不适合的晶体系统（分辨率低、结晶或衍射质量不稳定）或无法耐受DMSO或乙二醇的晶体系统，从而节省时间、人力和资源。成功的筛选项目可提供靶标蛋白上潜在相互作用位点的三维图谱；一个典型的例子是SARS-CoV-2主要蛋白酶的XChem筛选结果（图6）。通常，片段命中位点出现在以下位置：(a) 已知的功能位点，如酶的活性位点和亚口袋48；(b) 潜在的别构位点，例如蛋白质-蛋白质相互作用区域53；(c) 晶体堆积界面，通常被视为假阳性（图6）。此类结构数据通常为将片段命中化合物合并、连接或扩展为类先导小分子提供了基础1,3。

药物发现工作流程：晶体成像、化合物分配、数据收集、苗头化合物鉴定。
图1：XChem 管道流程。 该平台以示意图形式展示了从项目提案到样品制备、数据收集及苗头化合物鉴定的全过程。 请点击此处查看此图的放大版本。

晶体学筛选流程图，包含衍射测试结果和结构模型。
图 2：筛选策略。 该工作流程标明了每个关键节点的目的、实验要求以及决策点。请点击此处查看该图的放大版本。

晶体学工作流程：晶体成像、液滴定位、化合物分配、样品分析。
图 3：样品制备工作流程。 样品制备的关键步骤如图所示，每个步骤的信息均被记录在 SQLite 数据库中。 请点击此处查看该图的放大版本。

晶体学流程图：批量分子置换、PanDDA 分析、苗头化合物鉴定。
图 4：使用 XCE 进行数据分析。 数据分析中的关键步骤通过工作流程图表示，并标注了相关软件包。 请点击此处查看该图的放大版本。

柱状图显示了2015年至2020年的样本数量和研究提案，突出了趋势。
图5：XChem用户计划的发展历程：该图表展示了用户计划从2015年到2019年的增长与巩固过程，包括2019年BAGs的建立，以及平台在2020年COVID-19大流行期间展现出的韧性。请点击此处查看此图的放大版本。

蛋白质结构示意图，突出显示分子相互作用、酶结合位点和生物分子分析。
图6：XChem片段筛选的代表性结果。 SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）二聚体以表面形式展示，其中活性位点命中化合物显示为黄色，潜在的别构位点命中化合物显示为洋红色，表面或晶体堆积伪影显示为绿色。该图使用Chimera软件及来自G_1002156组沉积的Mpro PDB条目生成。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本文所述流程已由用户群体进行了广泛测试，且文中所描述方案的适应性对于处理该平台上通常遇到的各类项目至关重要。然而，晶体系统需满足一些先决条件。

对于使用X射线晶体学进行的任何片段筛选实验，可重复且稳定的晶体系统至关重要。由于标准XChem流程涉及将片段直接加入晶体液滴中，因此优化应侧重于含有高质量晶体的液滴数量，而非晶体总数。若单个液滴中含有多个晶体，则这些晶体在功能上是冗余的，尽管可能有助于简化晶体收获过程。此外，将结晶实验流程从本单位转移至现场设施可能具有挑战性。通常最有效的方法是采用晶体引晶技术以促进可重复的成核过程54，因此建议用户在提供蛋白质和结晶溶液的同时，一并提供引晶用的晶体储备样本。

为了确保化合物具有良好的溶解性和支持性，高浓度浸泡旨在促进弱片段的结合，片段库通常以有机溶剂提供，具体为DMSO和乙二醇。提供两种不同的溶剂可使用户在晶体完全不能耐受DMSO，或DMSO会阻碍片段在目标位点结合的情况下有替代选择。用户也可提供以水相缓冲液配制的替代片段库：只要化合物完全溶解，并且置于与液体分配机器人兼容的板中，即可良好地进行分配。

对于无法找到合适有机溶剂以同时溶解化合物库并被晶体系统耐受的项目，可采用另一种方法，即使用干燥化合物，该方法已在BESSY建立55。

在科研领域中，长期以来一直存在一个问题：能否将化合物浸泡到在高盐浓度结晶条件下生长的晶体中。实际操作中，在收获阶段常观察到化合物更易沉淀，且盐晶体快速形成；通过在收获区域周围维持湿润环境，可减轻这一现象。通常情况下，在高盐结晶条件下获得的晶体系统中进行筛选实验，其命中率与低盐条件下的结果相当。

XChem 流程的初始阶段（溶剂耐受性测试和预筛）属于小规模且快速的实验，但可为项目提供明确的继续或终止决策依据。最不利的情况是，若蛋白晶体对两种溶剂均无耐受性，或预筛的命中率极低，则必须寻找其他晶体系统。相反，若实验成功，则结果可直接指导筛选实验中所采用的浸泡条件以及最优的数据收集策略。由于数据质量（尤其是分辨率）会影响电子密度图的质量，进而影响命中化合物的识别与分析，因此目标是在不损害衍射质量的前提下，采用尽可能高的化合物浓度进行浸泡（大多数数据集（约80%）的衍射分辨率达到2.8 Å或更高）。

XChemExplorer 内的数据分析流程得到了简化，该工具依赖 PanDDA 软件来检测弱结合配体，并允许用户快速可视化和审查筛选实验的结果。XChemExplorer 从 Diamond 提供的数据处理软件包（DIALS16、autoPROC30、STARANISO31 和 Xia214）导入处理结果，各软件包的分辨率极限由其标准方法确定（即 CC1/2 = 0.3）。默认情况下，数据集的选择基于由 I/sigI、数据完整性和唯一衍射点数量计算得出的评分，但用户也可全局或针对单个样品选择特定的处理结果25。PanDDA 还会根据分辨率、Rfree 值以及参考数据与目标数据之间晶胞体积差异等标准排除部分数据（默认阈值分别为 3.5 Å、0.4 和 12%），以避免衍射质量差、中心偏离或 indexing 错误的晶体影响分析结果。

PanDDA 算法利用片段筛选过程中收集的大量数据集，检测在标准晶体学图谱中不可见的部分占有率配体。最初，PanDDA 使用溶剂耐受性测试和预筛步骤中收集的数据，构建一个平均密度图谱，进而生成一个基态模型。由于该模型将用于所有后续分析步骤，因此至关重要的是，它必须准确反映片段筛选实验条件下未结合配体的蛋白质状态。随后，PanDDA 通过统计分析识别结合的配体，并为晶体的结合态生成事件图谱。事件图谱通过从部分占有率数据集中减去晶体的未结合组分而获得，呈现的是配体以完全占有率结合时所观察到的密度。即使在传统的 2mFo-DFc 图谱中看起来清晰的片段，若未参考事件图谱，也可能被错误建模32。尽管 PanDDA 是一种强大的方法，可用于识别与平均图谱存在差异的数据集（通常表明片段结合），并且在精修过程中会提供诸如 RSCC、RSZD、B 因子比值和 RMSD 等指标以供用户参考，但最终仍由用户判断所观察到的密度是否准确描绘了预期的配体及其最合适的构象。

在完成数据分析与结构精修后，所有用户均可通过 XChemExplorer 同时向蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）提交多个结构。每次片段筛选实验需进行两组数据提交。第一组提交包含所有片段结合模型，并在 MMCIF 文件中附带用于计算 PanDDA 事件图的系数。第二组提交提供相应的基态模型以及实验中所有数据集的实测结构因子：这些数据可用于重现 PanDDA 分析结果，并支持未来算法的开发。对于命中片段的结构，当片段占据率较低时，若模型为配体结合态与干扰性基态结构的复合模型，则精修结果更为稳定32；然而，目前通常仅提交结合态组分，因为完整的复合模型通常较为复杂且难以解释。因此，PDB 重新计算的部分质量指标（特别是 R 值/Rfree 值）有时会略有升高。此外，也可通过 Zenodo 等平台提供全部原始数据56，但当前 XChem 流程尚未支持此功能。

总体而言，自2016年运行以来，采用该方法已在超过95%的靶标中成功鉴定出片段配体。XChem支持的众多项目经验已被总结为晶体制备的最佳实践33，同时发展出一个采用“具备可优化性”（poised concept）理念的片段库，以促进片段的后续优化29，并推动了公开片段库组成的实践。该平台已证明了良好维护的基础设施和标准化操作流程的重要性，本文对此进行了详细阐述，并使得评估其他片段库57,58、比较不同片段库48以及指导协作性EUOpenscreen-DRIVE片段库的设计成为可能59,60。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作是钻石光源（Diamond Light Source）与结构基因组联盟（Structural Genomics Consortium）之间的一项大规模合作成果。作者谨此感谢钻石光源的各个支持团队以及MX团队，感谢他们为i04-1光束线的自动化所做出的贡献，并感谢他们提供了高效的数据采集与自动处理流程，这些流程目前在所有MX光束线上常规运行。作者还感谢SGC PX团队在作为首批测试该系统的用户时所展现出的坚韧与耐心，同时感谢Evotec公司作为首个重要的工业用户参与其中。本工作得到了iNEXT-Discovery（资助号：871037）的支持，该项目由欧洲委员会“地平线2020”计划资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DSI-预激活文库EnamineDSI-896片段文库
Echo 550 和 650 系列Beckman-Coulter声波移液系统
Echo 微孔板Beckman-Coulter001-12380; 001-8768; 001-60251536 孔和 384 孔微孔板
ShifterOxford Lab Technology收获装置
带摆动转子的微孔板离心机Sigma型号 11121微孔板离心机
3-drops 结晶板Swissci3W96T-UVP结晶板
Formulatrix 微孔板成像仪及 Rockmaker 软件Formulatrix结晶板成像设备

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