本文描述了通过两步胶原酶法分离小鼠主动脉瓣膜细胞的过程。分离的小鼠瓣膜细胞对于开展多种实验分析至关重要，例如此项研究中的分析 体外 钙化检测，以及用于研究导致主动脉瓣钙化的分子通路。
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本文内容
摘要
摘要
主动脉瓣细胞的钙化是主动脉瓣狭窄的标志性特征，并与瓣膜小叶纤维化相关。瓣膜间质细胞（VICs）通过启动去分化程序转化为类成骨细胞，在主动脉瓣狭窄的钙化过程中发挥重要作用。小鼠VICs是一种良好的 体外 用于阐明主动脉瓣细胞矿化相关信号通路的工具。本文所述方法由作者成功应用，详细介绍了如何获取新鲜分离的细胞。采用两步胶原酶消化法，分别使用1 mg/mL和4.5 mg/mL浓度的胶原酶。第一步至关重要，旨在去除内皮细胞层，避免任何污染；第二步胶原酶孵育则有助于瓣膜间质细胞（VICs）从组织迁移至培养板。此外，文中还讨论了对分离的小鼠瓣膜细胞进行表型鉴定的免疫荧光染色步骤。进一步地，开展了钙化检测实验 体外 通过钙试剂测定法和茜素红染色法进行检测。使用小鼠瓣膜细胞原代培养对于验证抑制细胞矿化的新药理靶点至关重要。 体外
引言
钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）是西方人群中最为常见的瓣膜性心脏病，影响近2.5%年龄超过65岁的老年人1。CAVD影响超过六百万美国人，并与瓣叶机械性能的改变相关，从而损害正常的血流通过1,2。目前尚无药物治疗手段可阻止该疾病的进展或促进钙化消退。治疗CAVD唯一有效的疗法是通过外科手术或经导管主动脉瓣置换术进行主动脉瓣置换3。因此，迫切需要研究导致瓣膜钙化的分子机制，以识别新的药物治疗靶点。事实上，未经治疗的主动脉瓣狭窄可导致多种不良后果，例如左心室功能障碍和心力衰竭4。
主动脉瓣由三层结构组成，分别称为纤维层（fibrosa）、疏松层（spongiosa）和心室层（ventricularis），其中以瓣膜间质细胞（VICs）为主要细胞类型5。纤维层和心室层表面覆盖有一层血管内皮细胞（VECs）5。血管内皮细胞调控炎性细胞的通透性以及旁分泌信号。机械应力增加可能影响血管内皮细胞的完整性，破坏主动脉瓣的稳态，导致炎性细胞浸润6。扫描电子显微镜分析显示，在人类钙化性主动脉瓣中内皮层出现断裂7。
钙化组织的组织学分析显示存在成骨细胞和破骨细胞。此外，还观察到VICs的成骨分化 体外 以及在人体瓣膜组织中8该过程主要由Runt相关转录因子2（Runx2）和骨形态发生蛋白（BMPs）调控。8,9.
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方案
注意：此处描述的所有动物实验程序均已获得西奈山医学院机构核心使用委员会的批准。
1. 成年小鼠瓣膜细胞分离前的准备
- 使用70%（v/v）乙醇清洁并消毒图1A中所示的所有手术器械，随后在高压灭菌器中灭菌30分钟。用70%乙醇清洁手术操作区域。
- 向50 mL的10 mm HEPES溶液中加入500 µL青霉素-链霉素溶液。准备50 mL的1×磷酸盐缓冲液（PBS）。将上述溶液置于冰上保存。
- 配制1 mg/mL和4.5 mg/mL的胶原酶溶液，每种溶液各取5 mL分装至15 mL离心管中，用于整个实验操作。配制5 mL的1 mg/mL胶原酶溶液时，将5 mg胶原酶与2.5 mL无胎牛血清（FBS-free）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）以及2.5 mL含抗生素（来自步骤1.2的1%青霉素-链霉素）的10 mM HEPES溶液混合。使用0.22 µm滤器过滤溶液，以去除任何污染物。
注意：将溶液置于冰上以保护酶活性。 - 在后续所有步骤中使用前，将DMEM溶液预热至37 °C。通过向DMEM中添加1%青霉素-链霉素、1%丙酮酸钠、5 mL 200 mM L-谷氨酰胺、1 mL支原体清除试剂（见材料表）以及10% FBS，配制完全培养基。
2. 瓣膜细胞的分离
- 为获得实验所需的 106 个细胞，使用五只 8 周龄的小鼠（最少三只）。将小鼠放入诱导室中，同时放入浸有 1 mL 异氟烷的滤纸片，但避免小鼠与滤纸直接接触。通过脚趾夹捏反射确认动物已完全麻醉后，采用颈椎脱位法处死小鼠。在进行颈椎脱位前使用异氟烷以减轻疼痛，因为下述操作为终末性实验步骤。
- 将小鼠置于解剖平台上，用套管固定四肢以保持位置稳定。用乙醇清洁胸部和腹部；用剪刀剪开腹部和胸部。使用小型手术剪在左心房与左心室之间剪开以放血。用 10 mL 冷的 1× PBS 灌注心脏，以清除心脏中的血液。
- 剪下心脏，并保留升主动脉近端约 3 mm 的部分，如 图 1B 所示。在体视显微镜下分离主动脉瓣。在心室中部水平横向剪开心脏（图 1C）。从左心室向主动脉方向剪开，并小心分离主动脉瓣（图 1D-F）。将分离的瓣膜组织收集至一个小型 35 mm 组织培养皿中。
- 在 75 mm 细胞培养皿中用 5 mL 冷 HEPES（10 mM）（含抗生素，1% 青霉素-链霉素）清洗分离的瓣膜，以去除残留血液（图 2）。按照步骤 1.3 所述方法，准备两管分别为 1 mg/mL 和 4.5 mg/mL 的胶原酶溶液。
注意：解剖完成后，应在无菌生物安全柜中操作分离的瓣膜，以尽量减少污染。 - 将瓣膜在 I 型胶原酶（1 mg/mL）中于 37 °C 持续振荡孵育 30 分钟（图 2）。在 150 × g 条件下离心 5 分钟，弃上清，用 2 mL HEPES（10 mM）洗涤沉淀一次，并高速涡旋 30 秒。将管内内容物倒入 35 mm 培养皿中，用细镊子小心将组织碎片转移至新管中。
注意：此阶段心瓣膜间质细胞（VICs）尚未从组织中完全解离，沉淀中仍含有组织碎片。为避免内皮细胞污染，在步骤 2.5 涡旋后不要再次离心。 - 将沉淀置于 15 mL 管中，加入 5 mL I 型胶原酶（4.5 mg/mL），于 37 °C 持续振荡孵育 35 分钟。用 1 mL 移液器吹打重悬细胞，然后在 4 °C 下以 150 × g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，用 2 mL 完全 DMEM 培养基重悬沉淀，并在 4 °C 下以 150 × g 离心 5 分钟。重复此步骤两次以清洗细胞。
注意：沉淀中仍可能含有少量组织碎片。 - 用 1 mL 完全培养基重悬沉淀，将细胞接种至 6 孔细胞培养板的一个孔中，使用最少体积的培养基以促进细胞贴壁。将细胞置于 37 °C、含 5% 二氧化碳的培养箱中静置培养。
- 3 天后，在显微镜下观察细胞，确认细胞在组织碎片周围生长良好。当显微镜下可见约 1,000 个细胞时，用高压灭菌的镊子小心移除组织碎片，并更换培养基。
注意：培养板应避免扰动；若未观察到足够数量的细胞，可将培养皿放回培养箱继续培养 2 天。 - 当细胞融合度达到 70%（约 2.5 × 105 个细胞）时，用胰酶消化后转移至 75 mm 组织培养皿中继续培养。
3. 细胞身份与形态的分析
注意：采用免疫荧光染色法研究细胞形态及内皮细胞污染情况。
- 用70%（v/v）乙醇清洁超净工作台。将无菌盖玻片（22 mm × 22 mm）放入6孔板中。
注意：为灭菌盖玻片，可用70%乙醇清洗，并在超净台内紫外灯下放置过夜。 - 在6孔板中每孔接种100,000个细胞。24小时后，用1×PBS洗涤细胞两次，再用4%多聚甲醛（PFA）固定20分钟。随后再次用1×PBS洗涤细胞两次。
注意：此时可将细胞置于4 °C的PBS中保存，直至染色实验开始。 - 为验证VICs的纯度，可使用α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）、波形蛋白（vimentin）和分化簇31（CD31）检测是否存在VEC污染。
- 通过混合500 µL正常血清（与二抗同源物种）、9.5 mL 1×PBS和30 µL Triton X-100，配制封闭缓冲液。将细胞置于2 mL封闭缓冲液中，孵育1小时。
- 配制抗体稀释缓冲液：含30 µL Triton X-100、10 mL 1×PBS和0.1 g牛血清白蛋白（BSA）。
- 取一个空的枪头盒，装入半盒水以形成湿化室。用湿润的纸巾覆盖枪头架，再用一层Parafilm膜封住。
- 取1 µL一抗，与步骤3.5中配制的100 µL稀释缓冲液混合。将50 µL稀释后的一抗滴加在Parafilm膜上。从孔板中取出盖玻片，翻转后置于抗体液滴上，使细胞面与抗体接触，4 °C孵育过夜。
- 在6孔板中加入1 mL PBS。小心将盖玻片从Parafilm膜上取下，翻转后放回孔中。用1 mL 1×PBS持续轻柔振荡洗涤5分钟。更换新鲜PBS，重复洗涤3次。
- 将细胞与稀释后的二抗（1/500）（Alexa-488、Alexa-555）在室温下孵育1小时。将1 µL二抗加入500 µL抗体稀释缓冲液（步骤3.5配制）中混匀。用铝箔包裹孔板避光。用1 mL 1×PBS持续振荡洗涤3次。
- 用50 µL含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片液封片，置于显微镜下观察，分析细胞形态及VEC污染情况。
4. 体外 钙化检测
- 用70%乙醇清洁超净台，将DMEM培养基预热至37 °C。
- 将100,000个细胞/条件接种于6孔板中，加入完全DMEM培养基，在37 °C培养24小时。
- 通过混合2 mM NaH制备钙化培养基2PO4, 10-7 M 胰岛素和 50 µg/mL 抗坏血酸的 DMEM 培养基（含 5% FBS）。配制 93 mL DMEM 时，加入 5 mL FBS、1 mL 抗生素（终浓度 1%）、1 mL 丙酮酸钠（100 mM）和 27.5 mg NaH2PO4, 5.8 µL 胰岛素和 5 mg 抗坏血酸。
注意：使用 0.22 µm 滤膜在使用前过滤溶液。 - 24小时后，将上清液更换为成骨诱导培养基，在37 °C下继续培养细胞7天。第3天rd 第几天，更换为新鲜的成骨诱导培养基，并将培养板放回培养箱中，完成共7天的处理。
- 7天后，移除培养基，用2 mL 1× PBS洗涤细胞两次。加入1 mL 0.6 N盐酸（HCl），在37 °C下孵育24小时。收集HCl溶液至1.5 mL离心管中，用旋转蒸发仪蒸发。将所有管中的残留物重新悬浮于60 µL HCl中。
注意：干燥步骤对于浓缩溶液以及确保每种条件下的体积一致非常重要。 - 使用96孔板，利用现成的砷偶氮III试剂盒（见参考文献）测定钙离子浓度 材料表 如需更多详细信息）。
- 配制浓度为 10 mg/dL 的钙标准溶液。称取 10 mg 氢氧化钙（Ca(OH)₂），溶于适量去离子水中，定容至 100 mL，混匀。2）并溶于100 mL蒸馏水中。
- 在透明的96孔板中，每孔分别加入2 µL空白溶液（0.6 N HCl）、标准溶液、样品（10 mg/dL）及待测样品。每个处理设三个重复，以验证移液的变异性。每孔加入200 µL试剂。
注意：浓度高于15 mg/dL的样本应用生理盐水1:1稀释后重新检测，结果乘以2。 - 室温下孵育反应体系15分钟。
注意：该反应在60分钟内保持稳定。 - 在650 nm处读取并记录酶标板的吸光度。使用以下公式计算样品中的钙含量：
钙含量（mg/mL）=（样品吸光度／标准品吸光度）× 标准品浓度
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结果
由于小鼠主动脉瓣的直径通常为1 mm，因此需要至少汇集三个瓣膜才能收集到用于不同实验操作的百万个活细胞。VIC分离过程的各个步骤如图1和图2所示。由于手动刮除瓣膜组织较为困难，建议采用涡旋产生的剪切力去除VEC。事实上，CD31免疫荧光染色结果表明，未见内皮细胞污染（图3D）。此外，小鼠VIC表达波形蛋白（vimentin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），这两种蛋白是瓣膜细胞的主要标志物（图3B、C）。
细胞体外矿化体外
采用钙试剂盒测定钙浓度；经成骨诱导培养基处理的细胞相较于未处理细胞具有更高的钙浓度（图 4A）。钙浓度经总蛋白浓度标准化。茜素红染色通过显...
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讨论
本文介绍了一种用于原代培养的小鼠瓣膜细胞分离详细方案。将来自8周龄小鼠的三个主动脉瓣合并，以获得足够数量的细胞。此外，本方案还描述了心瓣膜间质细胞（VIC）表型的鉴定以及 体外 矿化检测. 该方法改编自 Mathieu 等人先前描述的实验方案。7.
在分离主动脉瓣时，必须注意避免所有可能的污染源，以保护细胞免受细菌或支原体污染。实际上，在开始实验前对所有手术器械进行高压灭菌至关重要。HEPES溶液应添加1%抗生素，以尽量减少细菌感染。此外，支原体可能引起细胞病变，从而干扰细胞培养中所有测量参数10。
在较小的培养皿中以较低体积的培养基接种细胞，对间质瓣膜细胞（VIC）的生长和增殖至关重要。让组织沉降并贴附于细胞培养皿表面，可促进细胞从组织迁移至培养皿壁。由于来自年轻小鼠的分离细胞增殖速度较快，建议在培养5天后将细胞转移至75 cm2的较大培养皿中。维持细胞融合度在80%左右，...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3 mm 刃口剪刀 | F.S.T | 15000-00 | |
| 抗α-平滑肌肌动蛋白抗体 | abcam | ||
| 抗小鼠 Alexa Fluor 488 标记二抗 | Cell Signaling | 4412 | |
| 偶氮胂III试剂盒 | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | 用于测定钙浓度的试剂盒 |
| 波恩剪刀 | F.S.T | 14184-09 | |
| 氢氧化钙 | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| I型胶原酶 （125 单位/mg） | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM培养基 | Thermofisher | 11965092 | |
| 超细格拉夫镊 | F.S.T | 11150-10 | |
| 胎牛血清 | Gibco 16000044 | ||
| 精细镊 | F.S.T Dumont | ||
| 盐酸 | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M 溶液 | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-谷氨酰胺 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | 支原体清除试剂 |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| 青霉素-链霉素 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| 丙酮酸钠 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| 标准齿纹镊 | F.S.T | 11000-12 | |
| 手术剪—锐-钝型 | F.S.T | 14008-14 | |
| 0.05% 胰蛋白酶 | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| 波形蛋白 | abcam |
参考文献
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