小鼠间质瓣细胞分离研究主动脉瓣体外钙化

摘要

本文描述了通过两步拼贴程序分离小鼠主动脉瓣细胞。分离的小鼠瓣细胞对于执行不同的测定（如 体外 钙化检测）和研究导致主动脉瓣矿化的分子通路非常重要。

摘要

主动脉瓣细胞的钙化是主动脉狭窄的标志，与瓣膜尖纤维化有关。瓣膜间质细胞（VICs）通过激活其去分化程序，在主动脉狭窄的钙化过程中发挥重要作用。小鼠 VIC 是用于阐明驱动主动脉瓣细胞矿化的信号通路的一个很好的 体外 工具。此处描述的方法，这些作者成功使用，解释了如何获得新分离的细胞。以1毫克/mL和4.5毫克/mL进行两步拼贴手术。第一步对于去除内皮细胞层和避免任何污染至关重要。第二个拼贴剂孵化是促进VIC从组织转移到板。此外，还讨论了分离小鼠瓣膜细胞表型特征的免疫荧光染色程序。此外，钙化检测是使用钙试剂测量程序和阿里扎林红色染色 在体外 进行的。使用小鼠瓣膜细胞原培养物对于测试新的药理靶点以抑制体外细胞矿化至关重要 。

引言

钙化主动脉瓣病（CAVD）是西方人群中最常见的瓣膜心脏病，影响近2.5%的65^岁以上的老年人。CAVD影响超过600万美国人，并与传单的机械性质的变化，损害正常的血液流过^1，2。目前，没有药理治疗来阻止疾病的进展或激活矿物质回归。治疗CAVD的唯一有效疗法是主动脉瓣置换手术或导管主动脉瓣置换^3。因此，必须研究导致阀门矿化的分子机制，以确定新的药理学目标。事实上，未经治疗的主动脉狭窄有若干不良后果，如左心室功能障碍和心力衰竭^4。

主动脉瓣由三层组成，称为纤维瘤、海绵状和心室，其中含有以VC为主要细胞^型的5。纤维瘤和心室被一层血管内皮细胞^（VECs）5覆盖。VEC调节炎症细胞和寄生虫信号的渗透性。机械应力增加可能会影响VEC的完整性，扰乱主动脉瓣的平衡，导致炎症细胞入侵^6。扫描电子显微镜分析显示，人类钙化主动脉瓣⁷的内皮被破坏。

钙化组织的组织学分析揭示了骨细胞和骨囊的存在。此....

方案

注:这里描述的所有动物程序都已获得西奈山伊坎医学院机构核心和使用委员会的批准。

1. 在从成年小鼠中分离出瓣膜细胞之前的准备

1. 使用 70% v/v 乙醇清洁和消毒 图 1A 中显示的所有手术器械，然后用 70% 乙醇自动清洁手术工作空间 30 分钟。
2. 加入500微升青霉素-链霉素至50ml的10毫米赫佩斯。准备 50 mL 的 1 倍磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的碱度。将解决方案保留在冰上。
3. 准备 1 毫克/mL 和 4.5 毫克/mL 拼贴剂解决方案，并在 15 mL 管中使用每个溶液中的 5 mL 执行整个过程。准备 5 mL 的 1 毫克/mL 拼贴剂， 混合 5 毫克拼贴剂与 2.5 mL 的杜尔贝科的改性鹰介质 （DMEM， 胎儿牛血清 （FBS） 免费） 和 2.5 mL 的 10 mM HEPES 补充抗生素 （1% 青霉素链霉素从第 1.2 步）.通过 0.22 μm 过滤器过滤解决方案，以消除任何污染。
   注意:将溶液保留在冰上以保护酶。
4. 在下面描述的所有步骤中使用之前，将 DMEM 解决方案加热到 37 °C。通过补充1%青霉素-链霉素、1%丙酮酸钠、5mL 200m L-谷氨酰胺、1 mL支原体消除试剂（见 材料表）和10%FBS来补充DMEM，准备完整的介质。

结果

由于木质主动脉瓣的直径通常为1毫米，因此必须集中至少三个阀门来收集一百万个可行的细胞，用于不同的实验程序。VIC 隔离过程的不同步骤显示在图1和图 2中。由于很难手动刮擦瓣膜组织，最好使用涡流产生的剪切应力来去除 VEC。事实上，CD31免疫荧光染色结果显示没有内皮细胞污染（图3D）。此外，小鼠VIC表达维他汀和α-SMA，这是阀门细胞的主要标记（图3B，C）。

细胞矿化 体外
使用钙试剂盒测量钙浓度:与未经治疗的细胞相比，用钙化介质治疗的细胞钙浓度更高（图4A）。钙的浓度随着蛋白质的总浓度而正常化。阿里扎林红色染色通过显示红色阳性钙节点（

讨论

本文为原培养提供了鼠标瓣膜细胞隔离的详细方案。从8周大的小鼠的三个主动脉瓣被集中，以获得足够的细胞数量。此外，本协议描述了VIC表型的特征和体外矿化测定。该方法改编自马蒂厄等人先前描述^的协议。

在主动脉瓣隔离期间，必须小心避免所有可能的传染源，以保护细胞免受细菌或支原体污染。事实上，在开始实验之前，对所有的手术工具进行高压灭菌是至关重要的。HEPES 溶液应辅以 1% 抗生素，以最大限度地减少细菌感染。此外，支原体可能导致细胞病理学，从而干扰细胞培养¹⁰中测量到的每一个参数。

将细胞电镀在培养介质体积较低的小培养皿中，对VIC的生长和增殖至关重要。让组织沉淀并粘附在细胞培养皿上，允许细胞从组织迁移到培养皿壁。鉴于幼鼠的分离细胞增殖速度更快，建议在培养5天后将细胞转移到75cm²的较大培养皿中。将细胞保持在80%的汇合度是关键，以尽量减少VIC的差异化为肌纤维细胞表型

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3 毫米刀刃剪刀	FST	15000-00
抗 α 平滑肌肌动蛋白抗体	abcam
抗小鼠、Alexa Fluor 488 偶联物	细胞信号传导	4412
砷唑-III 试剂套装	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	a 用于测量钙浓度
的试剂盒 波恩剪刀	FST	14184-09
氢氧化钙	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
胶原酶 I 型 （125 单位/毫克）	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
超细镊子	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
细镊子	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M 溶液	干细胞技术
L-谷氨酰胺 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	支原体消除试剂
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
青霉素链霉素 100x	Thermofisher Scientific	10378016
酮酸钠 100 mM	Thermofisher Scientific
标准图案镊子	FST	11000-12
手术剪刀 - 锐利钝	F.S.T	14008-14
胰蛋白酶 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam