分离小鼠主动脉瓣间质细胞以研究主动脉瓣钙化 体外

摘要

本文描述了通过两步胶原酶法分离小鼠主动脉瓣膜细胞的过程。分离的小鼠瓣膜细胞对于开展多种实验分析至关重要，例如此项研究中的分析 体外 钙化检测，以及用于研究导致主动脉瓣钙化的分子通路。

摘要

主动脉瓣细胞的钙化是主动脉瓣狭窄的标志性特征，并与瓣膜小叶纤维化相关。瓣膜间质细胞（VICs）通过启动去分化程序转化为类成骨细胞，在主动脉瓣狭窄的钙化过程中发挥重要作用。小鼠VICs是一种良好的 体外 用于阐明主动脉瓣细胞矿化相关信号通路的工具。本文所述方法由作者成功应用，详细介绍了如何获取新鲜分离的细胞。采用两步胶原酶消化法，分别使用1 mg/mL和4.5 mg/mL浓度的胶原酶。第一步至关重要，旨在去除内皮细胞层，避免任何污染；第二步胶原酶孵育则有助于瓣膜间质细胞（VICs）从组织迁移至培养板。此外，文中还讨论了对分离的小鼠瓣膜细胞进行表型鉴定的免疫荧光染色步骤。进一步地，开展了钙化检测实验 体外 通过钙试剂测定法和茜素红染色法进行检测。使用小鼠瓣膜细胞原代培养对于验证抑制细胞矿化的新药理靶点至关重要。 体外

引言

钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）是西方人群中最为常见的瓣膜性心脏病，影响近2.5%年龄超过65岁的老年人¹。CAVD影响超过六百万美国人，并与瓣叶机械性能的改变相关，从而损害正常的血流通过^1,2。目前尚无药物治疗手段可阻止该疾病的进展或促进钙化消退。治疗CAVD唯一有效的疗法是通过外科手术或经导管主动脉瓣置换术进行主动脉瓣置换³。因此，迫切需要研究导致瓣膜钙化的分子机制，以识别新的药物治疗靶点。事实上，未经治疗的主动脉瓣狭窄可导致多种不良后果，例如左心室功能障碍和心力衰竭⁴。

主动脉瓣由三层结构组成，分别称为纤维层（fibrosa）、疏松层（spongiosa）和心室层（ventricularis），其中以瓣膜间质细胞（VICs）为主要细胞类型⁵。纤维层和心室层表面覆盖有一层血管内皮细胞（VECs）⁵。血管内皮细胞调控炎性细胞的通透性以及旁分泌信号。机械应力增加可能影响血管内皮细胞的完整性，破坏主动脉瓣的稳态，导致炎性细胞浸润⁶。扫描电子显微镜分析显示，在人类钙化性主动脉瓣中内皮....

方案

注意：此处描述的所有动物实验程序均已获得西奈山医学院机构核心使用委员会的批准。

1. 成年小鼠瓣膜细胞分离前的准备

1. 使用70%（v/v）乙醇清洁并消毒图1A中所示的所有手术器械，随后在高压灭菌器中灭菌30分钟。用70%乙醇清洁手术操作区域。
2. 向50 mL的10 mm HEPES溶液中加入500 µL青霉素-链霉素溶液。准备50 mL的1×磷酸盐缓冲液（PBS）。将上述溶液置于冰上保存。
3. 配制1 mg/mL和4.5 mg/mL的胶原酶溶液，每种溶液各取5 mL分装至15 mL离心管中，用于整个实验操作。配制5 mL的1 mg/mL胶原酶溶液时，将5 mg胶原酶与2.5 mL无胎牛血清（FBS-free）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）以及2.5 mL含抗生素（来自步骤1.2的1%青霉素-链霉素）的10 mM HEPES溶液混合。使用0.22 µm滤器过滤溶液，以去除任何污染物。
   注意：将溶液置于冰上以保护酶活性。
4. 在后续所有步骤中使用前，将DMEM溶液预热至37 °C。通过向DMEM中添加1%青霉素-链霉素、1%丙酮酸钠、5 mL 200 mM L-谷氨酰胺、1 mL支原体清除试剂（见材料表）以及10% FBS，配制完全培养基。

结果

由于小鼠主动脉瓣的直径通常为1 mm，因此需要至少汇集三个瓣膜才能收集到用于不同实验操作的百万个活细胞。VIC分离过程的各个步骤如图1和图2所示。由于手动刮除瓣膜组织较为困难，建议采用涡旋产生的剪切力去除VEC。事实上，CD31免疫荧光染色结果表明，未见内皮细胞污染（图3D）。此外，小鼠VIC表达波形蛋白（vimentin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），这两种蛋白是瓣膜细胞的主要标志物（图3B、C）。

细胞体外矿化体外
采用钙试剂盒测定钙浓度；经成骨诱导培养基处理的细胞相较于未处理细胞具有更高的钙浓度（图 4A）。钙浓度经总蛋白浓度标准化。茜素红染色通过显.......

讨论

本文介绍了一种用于原代培养的小鼠瓣膜细胞分离详细方案。将来自8周龄小鼠的三个主动脉瓣合并，以获得足够数量的细胞。此外，本方案还描述了心瓣膜间质细胞（VIC）表型的鉴定以及 体外 矿化检测. 该方法改编自 Mathieu 等人先前描述的实验方案。⁷.

在分离主动脉瓣时，必须注意避免所有可能的污染源，以保护细胞免受细菌或支原体污染。实际上，在开始实验前对所有手术器械进行高压灭菌至关重要。HEPES溶液应添加1%抗生素，以尽量减少细菌感染。此外，支原体可能引起细胞病变，从而干扰细胞培养中所有测量参数¹⁰。

在较小的培养皿中以较低体积的培养基接种细胞，对间质瓣膜细胞（VIC）的生长和增殖至关重要。让组织沉降并贴附于细胞培养皿表面，可促进细胞从组织迁移至培养皿壁。由于来自年轻小鼠的分离细胞增殖速度较快，建议在培养5天后将细胞转移至75 cm²的较大培养皿中。维持细胞融合度在80%左右，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3 mm 刃口剪刀	F.S.T	15000-00
抗α-平滑肌肌动蛋白抗体	abcam
抗小鼠 Alexa Fluor 488 标记二抗	Cell Signaling	4412
偶氮胂III试剂盒	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	用于测定钙浓度的试剂盒
波恩剪刀	F.S.T	14184-09
氢氧化钙	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
I型胶原酶 （125 单位/mg）	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM培养基	Thermofisher	11965092
超细格拉夫镊	F.S.T	11150-10
胎牛血清	Gibco 16000044
精细镊	F.S.T Dumont
盐酸	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M 溶液	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-谷氨酰胺 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	支原体清除试剂
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
青霉素-链霉素 100x	Thermofisher Scientific	10378016
丙酮酸钠 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
标准齿纹镊	F.S.T	11000-12
手术剪—锐-钝型	F.S.T	14008-14
0.05% 胰蛋白酶	Thermofisher Scientific	25300054
波形蛋白	abcam