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利用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱法分析黑加仑果实中的挥发性化合物

DOI：

10.3791/62421

⸱

2021年6月9日

 ,  , 
1Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Campus de Teatinos, Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora”, Universidad de Málaga-Consejo Superior de Investigaciones Científicas

本文内容

摘要

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本文介绍了一种顶空固相微萃取-气相色谱平台，用于快速、可靠且半自动化地鉴定和定量成熟黑加仑果实中的挥发性成分。该技术可用于加深对果实香气的认识，并有助于筛选风味更佳的品种，以用于育种目的。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人们日益关注对成熟果实释放的挥发性有机化合物（VOCs）进行检测，旨在培育具有更优感官特性的品种或栽培品种，从而提高消费者的接受度。近年来已开发出高通量代谢组学平台，用于定量分析不同植物组织中的多种代谢物，包括决定果实风味和香气品质的关键化合物（挥发性代谢组学）。本文描述了一种利用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）的方法，用于鉴定和定量成熟黑加仑果实释放的挥发性有机化合物（VOCs），黑加仑是一种因其风味和健康益处而备受青睐的浆果。

采摘成熟黑加仑植株（Ribes nigrum）的果实后，立即用液氮冷冻。组织经匀浆处理形成细粉后，将样品解冻并立即与氯化钠溶液混合。离心后，将上清液转移至含有氯化钠的顶空玻璃小瓶中。随后使用固相微萃取（SPME）纤维，并结合气相色谱-离子阱质谱联用仪对挥发性有机化合物（VOCs）进行提取。通过积分色谱峰面积对所得离子色谱图中的挥发性物质进行定量，每种VOC采用特定的m/z离子进行检测。通过将样品在相同条件下测得的保留时间与纯商品化标准品的质谱图进行比对，以确认VOC的正确注释。在欧洲不同产地种植的成熟黑加仑果实中鉴定出60多种VOC。其中，萜类化合物和C6挥发物等关键香气成分可作为评价黑加仑果实品质的生物标志物。此外，本文还讨论了该方法的优缺点，并提出了可能的改进方向。同时强调了使用对照样品进行批次校正以及降低信号漂移强度的重要性。

引言

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风味是任何水果的关键品质性状，影响消费者的接受程度，从而显著影响其市场竞争力。风味感知涉及味觉和嗅觉系统的综合作用，其化学基础取决于在植物可食用部分积累的各种化合物的存在及其浓度，或对于挥发性有机化合物（VOCs），由成熟果实释放的化合物所决定1,2。尽管传统育种主要关注产量和抗病虫性等农艺性状，但由于风味等果实品质性状具有遗传复杂性，且难以准确进行表型鉴定，长期以来未受到足够重视，导致消费者满意度下降3,4。近年来，代谢组学平台的发展已成功鉴定并定量了影响果实味道和香气的关键化合物5,6,7,8。此外，将代谢物分析与基因组学或转录组学工具相结合，有助于阐明果实风味的遗传基础，进而推动育种项目培育出具有更优感官特性的新品种2,4,9,10,11,12,13,14。

黑加仑（Ribes nigrum）果实因其风味和营养价值而备受青睐，在欧洲、亚洲和新西兰的温带地区广泛种植15。大部分产量被加工成食品和饮料，在北欧国家尤为流行，主要得益于其优良的感官特性。果实浓郁的颜色和风味来源于成熟果实中花青素、糖类、有机酸以及挥发性有机化合物（VOCs）的共同作用16,17,18。对黑加仑挥发性成分的分析最早可追溯至20世纪60年代19,20,21。近年来，多项研究聚焦于黑加仑的挥发性有机化合物，鉴定了影响果实香气感知的关键成分，并评估了基因型、环境条件以及贮藏和加工过程对挥发性成分含量的影响5,17,18,22,23。

由于具有多种优势，顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME/GC-MS）24,25已成为高通量挥发性成分分析的首选方法。该技术采用涂有聚合物相的石英纤维，并将其安装在注射器装置上，使挥发性物质在纤维上吸附，直至达到平衡状态。顶空萃取可避免基质中非挥发性成分对纤维造成污染24。固相微萃取（SPME）能够有效分离出大量浓度差异显著的挥发性有机化合物（VOCs）（浓度范围从十亿分之一至百万分之一）25。此外，该方法无需使用溶剂，且样品前处理步骤简单。HS-SPME的其他优势还包括易于实现自动化操作以及相对较低的成本。

然而，其成功与否可能受到挥发性有机化合物（VOCs）的化学性质、提取方案（包括时间、温度和盐浓度）、样品稳定性以及是否有足够的果实组织等因素的限制26,27。本文介绍了一种通过顶空固相微萃取（HS-SPME）分离黑加仑VOCs，并采用气相色谱联用离子阱质谱仪进行分析的实验方案。该方法在植物材料用量、样品稳定性、提取及色谱分析时长之间实现了平衡，从而能够高效处理大量黑加仑样品，其中部分样品在本研究中予以展示。特别地，本文将以五个栽培品种（'Andega'、'Ben Tron'、'Ben Gairn'、'Ben Tirran' 和 'Tihope'）的VOC谱图和/或色谱图作为示例数据进行展示和讨论。此外，该相同方案已成功应用于其他浆果类水果物种的VOC测定，如草莓（Fragaria × ananassa）、树莓（Rubus idaeus）和蓝莓（Vaccinium spp.）。

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方案

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1. 果实采收

  1. 每种基因型和/或处理条件种植4至6株植物，以确保获得足够的果实材料并具有代表性变异。
  2. 尽可能在同一天采收样品；若果实材料不足，可将不同日期采收的样品合并。
    注意：建议采收时间（上午、中午、下午）保持大致一致，因为挥发性有机化合物（VOC）谱会受到昼夜节律和生物钟的影响28,29,30,31。
  3. 通过目视观察评估果实成熟阶段32。将处于相同成熟阶段的果实合并，因为成熟状态对VOC释放具有显著影响。剔除任何受损或受病原体感染的果实。
    注意：为更准确评估果实成熟度，可进行质构分析33。此外，可通过统计开花后天数来确保合并的果实处于相似的成熟阶段。
  4. 每个生物学重复（3至5个）至少包含10–15个果实，用于VOC分析。
    注意：本实验中，分别在波兰和苏格兰两个地点于2018年夏季采收了‘Andega’、‘Ben Tron’、‘Ben Gairn’、‘Ben Tirran’和‘Tihope’品种的果实，每个品种设置三个独立的果实池（每个池包含13–20个果实，作为生物学重复），立即用液氮冷冻。样品随后送至实验室，并按以下步骤处理。
  5. 采收后立即用液氮将所有果实速冻，之后于-80 °C保存直至处理。
    ​注意：如条件允许，果实可在采收后直接处理。此时可将新鲜果实用搅拌器均质化，称重后直接进行分析（从步骤3.1开始）。然而，为防止果实采后发生进一步降解，新鲜材料应置于冷藏环境（4 °C）中，并尽快完成处理。若操作不当，液氮可能导致冻伤，并在通风不良的空间中引起窒息风险。

2. 果实样品和试剂的准备

  1. 将果实研磨成细粉，过程中需借助液氮始终保持样品处于冷冻状态。使用冷冻研磨机、珠磨机或研钵与研杵进行匀浆。预先用液氮冷却不锈钢研磨罐或研钵与研杵，以防止样品解冻。
    注意：必须将样品充分研磨至细粉状，以确保挥发性有机化合物（VOC）的有效提取。
  2. 称取1 g冻存样品（来自步骤2.1）至预先在液氮中冷却的5 mL离心管中，记录准确重量。将样品保存于-80 °C，直至进行步骤3.1处理。
  3. 在分析中加入“参照”或“对照”样本，以检测技术变异，包括挥发性有机化合物（VOC）提取及顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（HS-SPME/GC-MS）检测性能。为此，将随机选取的果实样本混合制成混合样品，并在每天的VOC分析中至少包含一个对照样本。此外，如步骤2.5所述，使用内标物以尽量减少信号强度漂移的影响。
  4. 配制20%（w/v）氯化钠溶液：将氯化钠溶于高效液相色谱（HPLC）级水中（下文简称NaCl溶液），使用磁力搅拌器助溶；确保每份样品提供1 mL该溶液。
  5. 在高效液相色谱级甲醇中配制1 ppm的溶液 N十五烷（D32，98%），来自纯商业标准品（下文简称内标）。
    注意： N十五烷-d32 将用作内标物，每个样品需要 5 µL。甲醇应在通风橱中操作。
  6. 制备用于挥发性有机化合物鉴定的纯商品标准品（见 表1 （详见本研究中所用商业标准品列表）。
  7. 准备10 mL带螺口盖的顶空瓶，每个所需顶空瓶中加入0.5 g NaCl。确保螺口盖包含由柔软材料制成的隔垫。 即硅胶，内侧带有薄聚四氟乙烯膜，以避免污染。

3. 样品制备

  1. 向含有称重后冷冻样品的5 mL离心管中加入1 mL NaCl溶液。振荡试管，直至样品完全解冻并均质化。
  2. 在室温下以5000 × g 离心5分钟。
  3. 用1000 µL移液枪头将上清液转移至含有NaCl的顶空瓶中。可剪去枪头末端以方便此操作。
  4. 向每个含有样品的顶空瓶中加入5 µL内标物。

4. HS-SPME/GC-MS 数据采集

  1. 将密闭的顶空瓶置于室温下的气相色谱-质谱自动进样器中，进行自动化的顶空固相微萃取/气相色谱-质谱（HS-SPME/GC-MS）分析，具体步骤见第4节。请勿将生物学重复样本连续放置在自动进样器中；应将其随机分布，以最小化信号强度漂移的影响。
    注意：一次可在自动进样器中放置约10–12个顶空瓶，且不会影响样品稳定性。
  2. 在50 °C下预孵育顶空瓶10分钟，同时以17 × g 的条件振荡。
  3. 将固相微萃取（SPME）装置插入顶空瓶中，使萃取头暴露于顶空气中，在50 °C、17 × g 振荡条件下萃取挥发性有机化合物（VOC）30分钟。
  4. 将萃取头插入进样口，在250 °C不分流模式下保持1分钟，以实现挥发性物质的解吸。
  5. 在SPME清洗装置中，使用氮气（1 bar N2，纯度≥ 99.8%）于250 °C清洗萃取头5分钟。该萃取头可重复使用约100次。
  6. 采用与离子阱质谱仪联用的气相色谱仪分析挥发性有机化合物（见材料表），在恒定流速为1 mL/min的高纯氦气（He，纯度≥ 99.9999%）载气条件下进行色谱分离，色谱柱规格为60 m × 0.25 mm × 1 μm。采用以下程序升温：40 °C恒温3分钟，以8 °C/min升温至250 °C，并在250 °C保持5分钟。质谱分析时，设定传输线温度为260 °C，离子源温度为230 °C；电离能量设为70 eV，质荷比（m/z）扫描范围为35–220，每秒扫描6次。
  7. 按照上述方法提取并分析市售标准品的1 ppm溶液。此外，在样品数据采集前，运行一份包含所有稀释后市售标准品混合液（加入300 µL NaCl溶液和900 µL HPLC级水）的样品，以检查仪器校准是否正确。同时，每批样品中均需包含一份仅含NaCl溶液的空白对照样品。

5. GC-MS 谱图色谱分析：挥发性有机化合物鉴定与半定量

  1. 使用仪器制造商提供的软件打开原始的气相色谱-质谱（GC-MS）谱图文件。为鉴定化合物，将样品色谱图中获得的保留时间、质谱图及科瓦茨线性保留指数与标准品的保留指数进行比对。针对每种商用标准品，标注其保留时间及最丰富的 m/z 离子。随后，为每种挥发性有机化合物（VOC）选择一个特定的 m/z 离子（表1）。
  2. 根据标准保留时间和选定的 m/z 离子，自动积分所选GC-MS原始文件中的VOC峰。为此，需为每种VOC提供包含保留时间及选定 m/z 离子的列表。尽管软件会根据序列设置中提供的保留时间和 m/z 离子自动积分相应的峰面积，仍需检查每个峰的积分是否正确，并在必要时进行手动校正。
  3. 将每种VOC的峰面积相对于内标物的峰面积进行计算，以减少仪器变异和信号漂移的影响。
    注意：在分析不同基因型或不同生长与贮藏条件下获得的果实时，强烈建议将VOC含量相对于果实干重进行计算，以排除因水分含量差异引起的稀释效应。
  4. 为校正批次效应，将每个样品的VOC峰面积归一化至同一批次中分析的对照样品相应峰面积。
    注意：由此获得的是VOC的相对定量结果；然而，根据实验目的，VOC含量也可相对于任意样品进行计算（例如，以未处理果实为参照，比较贮藏对VOC水平的影响）。

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结果

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为了准确进行香气表型分析，有必要对在不同条件或不同地点种植、或属于不同基因型的大量水果作物进行高通量挥发性有机化合物（VOC）分析。本文介绍了一种用于黑加仑品种中VOC相对定量的快速半自动化顶空固相微萃取/气相色谱-质谱（HS-SPME/GC-MS）平台。VOC的检测与鉴定基于一个专门建立的用于浆果类水果物种分析的谱库（表1）。在上述条件下，通过HS-SPME/GC-MS获得的典型成熟黑加仑果实挥发性成分谱图（总离子流色谱图）如图1A所示。共鉴定出63种VOC，归属于多个化学类别，主要包括酯类（27种）、醛类（12种）、醇类（8种）、酮类（7种）、萜烯类（5种）和呋喃类（3种）（表1）。

萜类化合物、酯类以及C6化合物被报道为黑加仑挥发性成分的主要组分，并对新鲜果实的香气具有重要作用5,17。与既往研究一致，

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讨论

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由于挥发性化合物合成背后的遗传和生化机制复杂，且缺乏有效的表型鉴定技术，果实香气的育种工作长期受到阻碍。然而，近期代谢组学平台与基因组工具的结合，终于使得研究人员能够鉴定出影响消费者偏好的关键代谢物，并培育出风味更佳的作物3。尽管目前大部分进展集中在模式果实番茄上9,10，类似成果也有望在草莓、苹果和蓝莓等其他具有重要经济价值的作物中实现2,12,35,36。

本文介绍了一种快速且可重复的基于顶空固相微萃取/气相色谱-质谱（HS-SPME/GC-MS）的分析平台，已成功用于测定多种浆果物种中的挥发性有机化合物（VOC）含量，其中包括黑加仑。黑加仑因其细腻的风味和显著...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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作者感谢马拉加大学的Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación提供的HS-SPME/GC-MS检测支持。我们感谢Sara Fernández-Palacios Campos在挥发性物质定量分析中的协助。同时感谢GoodBerry联盟成员提供的果实材料。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mL 螺口顶空瓶Thermo Scientific10-HSV
18 mm 螺口盖 硅胶/PTFEThermo Scientific18-MSC
带 HDPE 螺口盖的 5 mL 管VWR216-0153
离心机Thermo Scientific75002415
用于 HPLC 的甲醇Merck34860-1L-R
正十五烷（D32，98%）Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-1283-1
氯化钠MerckS9888
SPME 纤维 PDMS/DVBMerck57345-U
TissueLyser 用不锈钢研磨罐Qiagen69985
TissueLyser IIQiagen85300可用研钵和研杵或低温研磨机替代
Trace GC 气相色谱仪-ITQ900 离子阱质谱仪Thermo Scientific
带自动 SPME 装置的 Triplus RSH 自动进样器Thermo Scientific1R77010-0450
用于 HPLC 的水Merck270733-1L
Xcalibur 4.2 SP1Thermo Scientific软件

参考文献

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