使用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用分析黑醋栗果实中的挥发性化合物

Summary

这里描述了一个顶空固相微萃取气相色谱平台，用于在成熟的黑醋栗果实中快速、可靠和半自动地进行挥发性鉴定和定量。该技术可用于增加有关水果香气的知识，并选择具有增强风味的品种以进行育种。

Abstract

人们越来越有兴趣测量成熟水果排放的挥发性有机化合物（VOCs），以培育具有增强感官特性的品种或品种，从而提高消费者的接受度。最近开发了高通量代谢组学平台，用于量化不同植物组织中的各种代谢物，包括负责水果味道和香气质量的关键化合物（挥发性组学）。这里描述了一种使用顶空固相微萃取（HS-SPME）与气相色谱-质谱（GC-MS）结合使用的方法，用于鉴定和定量成熟黑醋栗果实排放的VOCs，这种浆果因其风味和健康益处而受到高度赞赏。

收获黑醋栗植物（Ribes nigrum）的成熟果实并直接在液氮中冷冻。组织均质后产生细粉，解冻样品并立即与氯化钠溶液混合。离心后，将上清液转移到含有氯化钠的顶空玻璃小瓶中。然后使用固相微萃取（SPME）纤维和与离子阱质谱仪耦合的气相色谱仪提取VOC。通过积分峰面积，对所得离子色谱图进行挥发性定量，对每个VOC使用特定的 m / z 离子。通过比较在与样品相同条件下运行的纯商业标准的保留时间和质谱，确认了正确的VOC注释。在不同欧洲地区种植的成熟黑醋栗果实中鉴定出60多种VOC。在已确定的VOC中，关键的芳香化合物，如萜类化合物和C6挥发物，可用作黑醋栗果实质量的生物标志物。此外，还讨论了该方法的优缺点，包括预期的改进。此外，还强调了使用控制装置进行批量校正和最小化漂移强度。

Introduction

风味是任何水果的基本质量特征，会影响消费者的接受度，从而显着影响适销性。风味感知涉及味道和嗅觉系统的组合，并且在化学上取决于成熟水果排放的各种化合物的存在和浓度，这些化合物积聚在可食用植物部分，或者在VOC的情况下，由成熟的水果排放^1，2。虽然传统育种一直专注于产量和抗虫性等农艺性状，但由于遗传复杂性和难以正确表型这些特征，水果品质性状（包括风味）的改善长期以来一直被忽视，导致消费者不满^3，4。代谢组学平台的最新进展已成功鉴定和量化负责水果味道和香气的关键化合物^{5，6，7，8}。此外，代谢物分析与基因组或转录组学工具的结合可以阐明水果风味背后的遗传学，这反过来将有助于育种计划开发具有增强感官特征的新品种^2，4，^9，

Protocol

1. 水果收获

1. 每个基因型和/或处理种植4至6株植物，以确保足够的果实材料和变异性。
2. 如果可能的话，在同一天收获样品;如果没有足够的水果材料，将不同日期收获的样品汇集在一起。
   注意:建议收获时间（上午，中午，下午）保持大致相同，因为VOC曲线受白天/昼夜节律的影响^{28，29，30，31}。
3. 通过目视观察评估水果成熟阶段³²。来自同一成熟阶段的池水果，因为成熟状态强烈影响VOC排放。丢弃任何受损或病原体感染的水果。
   注意:为了更好地评估水果的成熟度，可以进行质地分析³³。此外，花后计数天数可用于确保混合的果实属于类似的成熟阶段。
4. 每个生物重复（3至5个）至少包括10-15个水果，用于VOC分析。
   注意:在这里，2018年夏季在两个地点（波兰和苏格兰）收获了"Andega"，"Ben Tron"，"Ben Gairn"，"Ben Tirran"和"Tihope"品种的三个单独的13-20个水果（生物复制品）池，并直接在液氮中冷冻。然后将样品送到实验室并按如下所述进行处理。
5. ....

Results

在不同条件或地点生长或属于不同基因型的大量水果作物中进行高通量VOC分析对于准确的香气表型是必要的。本文介绍了一个快速、半自动化的HS-SPME/GC-MS平台，用于黑加仑品种的VOC相对定量。VOC检测和鉴定基于为分析浆果果实种类而开发的文库（表1）。在上述条件下，HS-SPME/GC-MS获得的典型成熟黑醋栗果实挥发性剖面图（总离子色谱图）如图 1A所示。总共确定了63种VOC，属于几种化学类别，其中大多数是酯类（27种），醛类（12种），醇类（8种），酮类（7种），萜烯（5种）和呋喃（3）（表1）。

萜类化合物、酯类化合物和C6化合物被描述为在黑醋栗挥发物中占主导地位，并且对新鲜水果的香气很重要^5，17。与之前的这些研究一致，图1A中观察到的一些最丰富的峰对应于两个单萜（芳樟.......

Discussion

长期以来，由于挥发性化合物合成背后的复杂遗传学和生物化学以及缺乏适当表型的技术，水果香气的滋生一直受到阻碍。然而，代谢组学平台的最新进展，结合基因组工具，最终允许鉴定负责消费者偏好的代谢物，并培育出风味更好的作物³。虽然在模型水果番茄^9，10方面取得了大部分进展，但在其他经济相关的作物物种（如草莓，苹果或蓝莓）中也可以取得类似的结果^{2，12，35，36}。

本文提出了一种快速且可重复的基于HS-SPME / GC-MS的平台，该平台已成功用于测量不同浆果物种（包括黑醋栗）中的VOC含量，黑醋栗因其精致的风味和显着的营养价值而受到高度赞赏。与以前发表的方法相比，主要改进.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL 螺口顶空样品瓶	Thermo Scientific	10-HSV
18 mm 螺口盖 硅胶/PTFE	Thermo Scientific	18-MSC
5 mL 管，带 HDPE 螺口盖	VWR	216-0153
离心机	Thermo Scientific	75002415
HPLC 用甲醇		Merck 34860-1L-R
N-十五烷 （D32， 98%）	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-1283-1
氯化钠	Merck	S9888
SPME 纤维头 PDMS/DVB	Merck	57345-U
TissueLyser	Qiagen	69985
TissueLyser II	Qiagen	85300	可用研钵和研杵或低温研磨机替代
痕量 GC 气相色谱仪-ITQ900 离子阱质谱仪	Thermo Scientific
Triplus RSH 自动进样器，带自动 SPME 设备	Thermo Scientific	1R77010-0450
HPLC 用水	Merck	270733-1L
Xcalibur 4.2 SP1	Thermo Scientific		软件