本文介绍了一种顶空固相微萃取-气相色谱平台，用于快速、可靠且半自动化地鉴定和定量成熟黑加仑果实中的挥发性成分。该技术可用于加深对果实香气的认识，并有助于筛选风味更佳的品种，以用于育种目的。
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本文内容
摘要
摘要
人们日益关注对成熟果实释放的挥发性有机化合物（VOCs）进行检测，旨在培育具有更优感官特性的品种或栽培品种，从而提高消费者的接受度。近年来已开发出高通量代谢组学平台，用于定量分析不同植物组织中的多种代谢物，包括决定果实风味和香气品质的关键化合物（挥发性代谢组学）。本文描述了一种利用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）的方法，用于鉴定和定量成熟黑加仑果实释放的挥发性有机化合物（VOCs），黑加仑是一种因其风味和健康益处而备受青睐的浆果。
采摘成熟黑加仑植株（Ribes nigrum）的果实后，立即用液氮冷冻。组织经匀浆处理形成细粉后，将样品解冻并立即与氯化钠溶液混合。离心后，将上清液转移至含有氯化钠的顶空玻璃小瓶中。随后使用固相微萃取（SPME）纤维，并结合气相色谱-离子阱质谱联用仪对挥发性有机化合物（VOCs）进行提取。通过积分色谱峰面积对所得离子色谱图中的挥发性物质进行定量，每种VOC采用特定的m/z离子进行检测。通过将样品在相同条件下测得的保留时间与纯商品化标准品的质谱图进行比对，以确认VOC的正确注释。在欧洲不同产地种植的成熟黑加仑果实中鉴定出60多种VOC。其中，萜类化合物和C6挥发物等关键香气成分可作为评价黑加仑果实品质的生物标志物。此外，本文还讨论了该方法的优缺点，并提出了可能的改进方向。同时强调了使用对照样品进行批次校正以及降低信号漂移强度的重要性。
引言
风味是任何水果的关键品质性状，影响消费者的接受程度，从而显著影响其市场竞争力。风味感知涉及味觉和嗅觉系统的综合作用，其化学基础取决于在植物可食用部分积累的各种化合物的存在及其浓度，或对于挥发性有机化合物（VOCs），由成熟果实释放的化合物所决定1,2。尽管传统育种主要关注产量和抗病虫性等农艺性状，但由于风味等果实品质性状具有遗传复杂性，且难以准确进行表型鉴定，长期以来未受到足够重视，导致消费者满意度下降3,4。近年来，代谢组学平台的发展已成功鉴定并定量了影响果实味道和香气的关键化合物5,6,7,8。此外，将代谢物分析与基因组学或转录组学工具相结合，有助于阐明果实风味的遗传基础，进而推动育种项目培育出具有更优感官特性的新品种2,4,9,
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方案
1. 果实采收
- 每种基因型和/或处理条件种植4至6株植物，以确保获得足够的果实材料并具有代表性变异。
- 尽可能在同一天采收样品；若果实材料不足，可将不同日期采收的样品合并。
注意：建议采收时间（上午、中午、下午）保持大致一致，因为挥发性有机化合物（VOC）谱会受到昼夜节律和生物钟的影响28,29,30,31。 - 通过目视观察评估果实成熟阶段32。将处于相同成熟阶段的果实合并，因为成熟状态对VOC释放具有显著影响。剔除任何受损或受病原体感染的果实。
注意：为更准确评估果实成熟度，可进行质构分析33。此外，可通过统计开花后天数来确保合并的果实处于相似的成熟阶段。 - 每个生物学重复（3至5个）至少包含10–15个果实，用于VOC分析。
注意：本实验中，分别在波兰和苏格兰两个地点于2018年夏季采收了‘Andega’、‘Ben Tron’、‘Ben Gairn’、‘Ben Tirran’和‘Tihope’品种的果实，每个品种设置三个独立的果实池（每个池包含13–20个果实，....
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结果
为了准确进行果实香气表型分析，有必要对在不同条件或不同地点种植或属于不同基因型的多种果树作物进行高通量挥发性有机化合物（VOC）分析。本文介绍了一种用于黑加仑品种中VOC相对定量的快速半自动化顶空固相微萃取/气相色谱-质谱（HS-SPME/GC-MS）平台。VOC的检测与鉴定基于一个专门建立的用于浆果类水果物种分析的谱库（表1）。在上述条件下，通过HS-SPME/GC-MS获得的典型成熟黑加仑果实挥发性成分谱图（总离子流色谱图）如图1A所示。共鉴定出63种VOC，归属于多个化学类别，主要包括酯类（27种）、醛类（12种）、醇类（8种）、酮类（7种）、萜烯类（5种）和呋喃类（3种）（表1）。
萜类化合物、酯类以及C6化合物被报道为黑加仑挥发性成分的主要组分，并对新鲜果实的香气具有重要作用5,17。与既往研究一致，
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讨论
由于挥发性化合物合成背后的遗传和生化机制复杂，且缺乏有效的表型鉴定技术，果实香气的育种工作长期受到阻碍。然而，近期代谢组学平台与基因组工具的结合，终于使得研究人员能够鉴定出影响消费者偏好的关键代谢物，并培育出风味更佳的作物3。尽管目前大部分进展集中在模式果实番茄上9,10，类似成果也有望在草莓、苹果和蓝莓等其他具有重要经济价值的作物中实现2,12,35,36。
本文介绍了一种快速且可重复的基于顶空固相微萃取/气相色谱-质谱（HS-SPME/GC-MS）的分析平台，已成功用于测定多种浆果物种中的挥发性有机化合物（VOC）含量，其中包括黑加仑。黑加仑因其细腻的风味和显著.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢马拉加大学的Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación提供的HS-SPME/GC-MS检测支持。我们感谢Sara Fernández-Palacios Campos在挥发性物质定量分析中的协助。同时感谢GoodBerry联盟成员提供的果实材料。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 螺口顶空瓶 | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm 螺口盖 硅胶/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 带 HDPE 螺口盖的 5 mL 管 | VWR | 216-0153 | |
| 离心机 | Thermo Scientific | 75002415 | |
| 用于 HPLC 的甲醇 | Merck | 34860-1L-R | |
| 正十五烷（D32，98%） | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| 氯化钠 | Merck | S9888 | |
| SPME 纤维 PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| TissueLyser 用不锈钢研磨罐 | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | 可用研钵和研杵或低温研磨机替代 |
| Trace GC 气相色谱仪-ITQ900 离子阱质谱仪 | Thermo Scientific | ||
| 带自动 SPME 装置的 Triplus RSH 自动进样器 | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| 用于 HPLC 的水 | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | 软件 |
参考文献
- Klee, H. J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytologist. 187 (1), 44-56 (2010).
- Ferrão, L. F. V., et al. Genome-wide association of volatiles reveals candidate loci for blueberry flavo....
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重印与许可
