我们介绍了三种不同方法的实验方案，用于匀浆大鼠骨骼肌组织中的四个不同肌群，以测定和比较硝酸盐和亚硝酸盐的水平。此外，我们比较了不同的样品重量，以研究组织样本量是否影响匀浆结果。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
硝酸根离子（NO3-）曾被认为是一氧化氮（NO）代谢的惰性终产物。然而，先前的研究表明，硝酸根离子可在哺乳动物体内通过两步还原机制重新转化为NO：硝酸根主要由口腔共生细菌还原为亚硝酸根（NO2-），随后亚硝酸根通过多种机制（包括含血红素或含钼蛋白）进一步还原为NO。这一还原性硝酸盐途径有助于增强NO介导的信号通路，尤其在心血管系统中以及肌肉运动期间发挥重要作用。在利用之前，体内硝酸盐的水平由两个不同来源决定：内源性NO的氧化以及膳食硝酸盐的摄入，后者主要来自植物。为了阐明生理条件下复杂的NO循环，我们进一步研究了其相对稳定的代谢产物——硝酸根和亚硝酸根离子的动态变化。先前的研究已确定骨骼肌是哺乳动物体内硝酸根离子的主要储存器官，同时也是运动过程中NO的直接来源之一。因此，建立一种可靠的测定骨骼肌中硝酸根和亚硝酸根含量的方法具有重要意义，并有助于将该方法拓展应用于其他组织样本。本文详细阐述了骨骼肌样本的制备过程，采用了三种不同的匀浆方法用于硝酸根和亚硝酸根的测定，并讨论了与匀浆过程相关的重要问题，包括样本尺寸等。此外，还比较了四个不同肌群中硝酸根和亚硝酸根的浓度。
引言
一氧化氮（NO）是一种小分子气态信号分子，在生理和病理生理过程中发挥着关键作用1。NO 可由内源性一氧化氮合酶（NOS）家族酶催化 L-精氨酸生成，随后在血液和组织中迅速氧化为硝酸盐（NO3-），并可能进一步转化为亚硝酸盐（NO2-）2,3。最近研究表明，这些阴离子可在哺乳动物系统中被还原回 NO4。硝酸盐主要通过口腔中共生细菌的硝酸盐还原酶作用转化为亚硝酸盐，这些离子来源于唾液腺分泌或直接摄入的硝酸盐5，此外，一定程度上也可由哺乳动物体内的酶（如黄嘌呤氧化还原酶）催化完成6,7。亚硝酸盐可通过多种机制进一步还原为 NO，包括脱氧血红蛋白8、脱氧肌红蛋白9、含钼酶10，以及在质子存在下的非酶促还原反应11,12。
在缺氧条件下，一氧化氮合酶（NOS）活性降低，而硝酸盐-亚硝酸盐-NO 通路在此时得到增强，因为 NOS 生成 NO 需要氧气4。近年来许多研究报道了膳食硝酸盐在血压调节和运动表现方面的有益作用，提示硝酸盐还原通路有助于增强 NO 信号传导13,14,15。先前的研究表明，某些骨骼肌可能是体内主要的硝酸盐储存部位16。与血液或其他内脏器官（如肝脏）相比，骨骼肌（臀大肌）含有显著更高水平的硝酸盐，并且在哺乳动物体内具有较大的质量。已有研究显示，在大鼠模型中，跑步机运动可促进臀大肌中硝酸盐向亚硝酸盐及 NO 的还原7。这些结果提示，在生理条件下，某些骨骼肌可能通过硝酸盐还原通路成为 NO 的重要来源。最近的研究进一步表明，包括运动过程中肌肉硝酸盐水平变化在内的这些发现，在人体中同样存在17。
本研究的两位作者此前已建立了一种用于测定血液及其他液体样本中硝酸盐和亚硝酸盐水平的方法18。然而，在最初分析组织匀浆中这些阴离子的含量时，尚无详细的实验方案可供参考。为了阐明多种不同器官中硝酸盐-亚硝酸盐-一氧化氮（nitrate-nitrite-NO）的动态变化，我们的目标是开发一种准确且高效的测定哺乳动物组织（包括骨骼肌）中硝酸盐和亚硝酸盐含量的方法。在早期研究中，研究人员利用啮齿类动物组织建立了可靠的匀浆制备流程，并进而分析这些匀浆中的硝酸盐和亚硝酸盐含量7,16,19。随后，该匀浆方法被拓展应用于人体骨骼肌活检样本，所得结果得到了验证；更重要的是，肌肉组织与血液/血浆中检测到的数值范围及比值与在啮齿类动物中观察到的结果相似17。近年来，其他研究团队也开始测定骨骼肌匀浆中的硝酸盐和亚硝酸盐水平，其报告的结果与我们团队所报道的数值相当20,21。
本实验方案旨在详细描述采用三种不同匀浆方法制备骨骼肌匀浆液，以用于后续测定硝酸盐和亚硝酸盐含量的具体步骤。此外，本文还考察了用于匀浆的组织重量对骨骼肌样本中硝酸盐和亚硝酸盐测定值的影响。我们认为，这些方法可轻松应用于其他类型的哺乳动物组织。近年来，尤其是在运动生理学领域，研究者日益关注不同肌群在硝酸盐/亚硝酸盐/一氧化氮（NO）生理学方面可能存在的差异。本文还报告了四种不同啮齿类动物肌肉中硝酸盐和亚硝酸盐的含量，发现这两种离子在不同肌肉间的分布并不均匀；这一现象尚需进一步研究。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
动物实验方案已获国家糖尿病、消化病和肾病研究所（NIDDK）动物护理与使用委员会批准（方案编号：K049-MMB-20）。动物的饲养与处理均依照美国实验动物评估和认证协会（AAALAC）官网上公开发布的现行《实验动物护理与使用指南》进行。
1. 大鼠骨骼肌采集
- 当大鼠处于深度麻醉状态（5% 异氟烷，通过尾部/腿部夹捏无反应来确认）时，开始用含有肝素的生理盐水进行灌注，将19 G针头插入左心室心尖，并在右心房处剪开一小口。让含肝素的生理盐水流经内脏器官，直至灌注量至少达到每公斤体重1.5升。此时动物因失血而死亡，尸体可进行后续样本采集。
注：充分灌注至关重要，尤其是对于亚硝酸盐的准确测定，因为残留的血红蛋白会将亚硝酸盐氧化为硝酸盐。 - 使用洁净的外科器械识别目标肌肉组织，并从后肢22中将其切除。尽可能去除肌肉组织中的脂肪和结缔组织。
- 将所需量的肌肉组织放入微量离心管中，随后置于干冰上。将装有组织的离心管存放在-80 °C冰箱中。
注：对于人类活检样本，采集后应立即用洁净纱布彻底吸干，以去除多余血液。
2. 匀浆前准备
- 硝酸盐保存液（终止液）的配制
- 在蒸馏水中配制含有890 mM铁氰化钾（K3Fe(CN)6）和118 mM NEM（N-乙基马来酰亚胺）的澄清黄色溶液，确保无晶体残留。按1:9（v/v）的比例加入非离子型表面活性剂（去垢剂）（材料表），轻轻混匀以避免产生泡沫。
- 用蒸馏水将终止液按1:9比例稀释。将稀释后的终止液（肌肉组织与稀释终止液的体积比为1:5）加入匀浆管中。
注意：20毫克组织需使用100 μL终止液，200毫克组织需使用1000 μL终止液。所加溶液中必须含有去垢剂，这对细胞膜的破坏至关重要。可使用任何非离子型去垢剂，但必须注意验证其不会干扰化学发光检测方法。
- 组织准备
- 从-80 °C冰箱中取出组织，在冰上缓慢解冻。去除骨骼肌中残留的脂肪和结缔组织。切取骨骼肌小块，并用纱布吸干表面液体。
- 称取所需量的组织（20、50和200 mg）。将预先称重的骨骼肌放入含有终止液的匀浆管中，或将其放入干净的微量离心管中以备后续使用。
3. 匀浆化
- 旋转匀浆器（图1)
- 将装有预先称重的骨骼肌和预先量取的终止液的M型管放入仪器中。每个样本进行两次匀浆（设置为最强的匀浆循环），每次匀浆后立即将管置于冰上冷却5分钟。
- 短暂离心，2,000 × g 4 °C 下放置 5 分钟。将整管放回冰上，加入适当体积的甲醇（≥ 99.9 %，为组织重量的 10 倍）。充分涡旋振荡 15 秒。
注意：每20 mg组织使用200 μL甲醇。甲醇用于从组织匀浆中沉淀蛋白质，且不会干扰化学发光法。若采用其他蛋白质沉淀方法，需测试其与化学发光法的兼容性。 - 再次匀浆，冰上孵育30分钟。4 °C条件下以3,500 × g离心35分钟。 g吸弃上清液，测定亚硝酸盐/硝酸盐水平，或于-80 °C保存以备后续使用。
- 珠磨匀浆器（图2)
- 将骨骼肌组织放入含有珠子的离心管中（组织与稀释终止液的比例为1:5），使用仪器可达到的最高转速匀浆两次，每次45秒。每次匀浆后立即将离心管置于冰上冷却5分钟。
- 使用小型台式离心机短暂离心（2,000 × g）5 秒。将离心管放回冰上，加入适量甲醇（纯度 ≥ 99.9 %，体积为组织重量的 10 倍）。充分涡旋振荡 15 秒。
注意1：对于20 mg组织，使用200 μL甲醇。
注2：甲醇用于从组织匀浆中沉淀蛋白质，且不会干扰化学发光法。若使用其他蛋白质沉淀方法，需检测其与化学发光法的兼容性。 - 再次以所用仪器的最高速度匀浆45秒。冰上孵育30分钟。在4 °C、17,000 x g条件下离心30分钟。吸除上清液，测定亚硝酸盐/硝酸盐水平，或于-80 °C保存以备后续使用。
- 研磨器（图3)
- 准备含有终止液的离心管（终止液体积为组织重量的5倍），并称重。记录重量（管加终止液）。
- 将液氮研磨工具置于干冰上，等待约30分钟，使其达到所需温度。
- 使用在液氮中预冷的镊子，将一个样品（已测量组织重量）转移至研磨器中。加入一小勺液氮，以确保组织保持在液氮温度。
- 当95%的液氮挥发后，将研磨工具置于组织上方并用力按压，应能感觉到样品被压碎。使用锤子敲击研磨工具3至5次。
- 使用在液氮中冷却的勺子检查样品中是否残留组织块。在液氮中冷却后，用一张纸巾擦去组织表面冻结的水分，再接触组织。若发现有组织块残留，将其移至中心位置，再用锤子敲击5–6次。
- 当整个样品被充分研磨后，使用液氮冷却的药匙将粉碎的组织直接转移至已预先称重并含有稀释终止液的离心管中（步骤 3.3.1）。此步骤需迅速操作，因为粉碎后的骨骼肌一旦升温会变得黏稠，难以转移。
- 涡旋15秒。打开管盖，检查是否有组织残留在管顶。如有残留，设法将其移下，然后再次涡旋。
- 使用小型台式离心机将样品离心2-3秒。再次称量离心管。通过从此次重量中减去离心管的初始重量（步骤3.3.1）计算组织重量。将离心管置于冰上。
注意：精确的重量将有助于确定组织的确切重量以及在研磨过程中损失的组织量。 - 所有样本处理至步骤 3.3.8 后，加入适量甲醇（≥ 99.9 %，体积为组织重量的 10 倍）。充分涡旋振荡 15 秒，冰上孵育 30 分钟。
注意：对于 20 mg 组织，使用 200 μL 甲醇。甲醇用于从组织匀浆中沉淀蛋白质，且不会干扰化学发光法。若采用其他蛋白质沉淀方法，需测试其与化学发光法的兼容性。 - 在17,000 × g下离心 g4 °C 下孵育 30 分钟。吸除上清液，测定亚硝酸盐/硝酸盐水平，或于 -80 °C 保存以备后续使用。
4. 使用一氧化氮分析仪（NOA）测定亚硝酸盐/硝酸盐
- 采用上述三种不同匀浆方法中的任意一种制备所有样品，并将样品注入一氧化氮分析仪（NOA）以测定硝酸盐和亚硝酸盐含量。
注意：NOA 使用的详细方案此前已有发表19。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
为获得具有代表性的结果，使用了8只Wistar大鼠（雄性和雌性，体重250 ± 50 g）的骨骼肌组织。通过三种不同的匀浆工具（旋转匀浆器、珠磨匀浆器和研磨器）制备大鼠骨骼肌匀浆液（每种方法使用50 mg臀大肌组织）。随后采用一氧化氮分析仪（NOA）测定这些匀浆液中的硝酸盐和亚硝酸盐含量（图4）。这三种匀浆样品中的硝酸盐水平（图4A）非常接近，范围为39.6至45.2 nmol/g。
有趣的是，使用研磨机制备的匀浆样品中的亚硝酸盐水平（图4B）最高（0.99 ± 0.15 nmol/g），且该值在统计学上显著高于其他两个样品的数值。为了检验组织大小是否会影响匀浆效率以及最终的硝酸盐和亚硝酸盐测定结果，采用珠磨匀浆仪对三种不同大小的骨骼肌组织（臀肌组织分别为20、50和200 mg）进行了匀浆处理（图5）。不同组织大小样品间的硝酸盐（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
为了监测一氧化氮（NO）代谢物（硝酸盐和亚硝酸盐）在不同生理干预下的变化，必须测定这些离子在参与其代谢的关键器官中的含量。由于血液中的血红蛋白会与NO及其代谢物发生反应，因此在采集组织样本时应尽可能迅速地去除血液。因此，在采集骨骼肌组织（臀肌、胫骨前肌、趾长伸肌、腓肠肌）之前，需先用生理盐水灌注动物。采集后应立即去除目标肌肉周围的结缔组织和脂肪。用于组织匀浆的“终止溶液”经过特别配制，含有铁氰化物、N-乙基马来酰亚胺（NEM）和非离子型表面活性剂，以在多种组织中稳定亚硝酸盐19。非离子型去垢剂的存在对于完全破坏细胞膜至关重要。在本研究使用的两种匀浆设备（旋转式匀浆机和珠磨匀浆机）中，匀浆所需的终止溶液体积为组织重量的5倍，以确保整个组织完全浸没于溶液中并实现均匀处理。
匀浆过程总共进行三次（加入甲醇前进行两次，加入甲醇以沉淀蛋白质后再进行一次），每次均采用仪器制造商设定的程序化参数进行操作。每次匀浆后必须立即将样品置于冰上，以防止因匀浆过程中产生的轻微加热导致样品降解。对于粉碎法，组织样品首先在保持冷冻状态下使用液氮研磨成粉末，然后加...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在利益冲突。Alan N. Schechter 被列为美国国立卫生研究院（NIH）授予的多项专利的共同发明人，这些专利涉及亚硝酸盐用于心血管疾病的治疗。他根据NIH对这些专利进行临床开发授权所获得的特许权使用费获取收益，但无其他报酬。上述安排不影响其对JoVE期刊政策的遵守。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIH/NIDDK）院内研究基金 ZIA DK 0251041-14 资助，项目负责人为 Alan N Schechter 医学博士。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| gentleMACS 组织解离仪 | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M 管 | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | 长度：87 mm；直径：30 mm |
| 肝素钠 | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| 异氟烷 | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| 甲醇 | Sigma | 646377 | |
| Minilys 珠磨均质仪 | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM；N-乙基马来酰亚胺 | Sigma | 4260 | |
| 一氧化氮分析仪 | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40；4-壬基苯基聚乙二醇 | Sigma | 74385 | |
| 铁氰化钾；K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys 细胞裂解试剂盒 | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | 包含用于均质化的 2 mL 管，内含 2.8 mm 陶瓷（氧化锆）珠 |
| 研磨试剂盒 | Cellcrusher | Cellcrusher 试剂盒 |
参考文献
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A. The L-arginine-nitric oxide pathway. New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).
- Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
- Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash. Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).
- Jansson, E. A., et al. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).
- Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle. Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Shiva, S., et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).
- Millar, T. M., et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).
- Benjamin, N., et al. Stomach NO synthesis. Nature. 368 (6471), 502(1994).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).
- Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).
- Kapil, V., et al. Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO. Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).
- Jones, A. M. Dietary nitrate supplementation and exercise performance. Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).
- Piknova, B., et al. Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir. Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).
- Wylie, L. J., et al. Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise. Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay. Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).
- Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. Journal of Visualized Experiments. (118), e54879(2016).
- Nyakayiru, J., et al. Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans. Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).
- Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC. Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).
- Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).
- Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats. bioRxiv. , (2020).
- Ohtake, K., et al. Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice. Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
