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利用尺寸排阻色谱分析细菌外膜囊泡的异质性

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DOI：

10.3791/62429

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2021年3月31日

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Lehigh University

本文内容

摘要

细菌囊泡在致病过程中发挥重要作用，并具有广阔前景的生物技术应用价值。由于囊泡具有异质性，其分析和应用受到限制；因此，亟需一种简单且可重复的方法来分离不同大小的囊泡。本文中，我们展示了利用尺寸排阻色谱法分离由Aggregatibacter actinomycetemcomitans产生的异质性囊泡。

摘要

革兰氏阴性菌的细胞壁由内膜（细胞质膜）和外膜（OM）组成，两者之间由一层薄的肽聚糖隔开。在生长过程中，外膜可出芽形成球形的外膜囊泡（OMVs）。这些OMVs参与多种细胞功能，包括向宿主细胞递送 cargo 以及与细菌细胞进行通讯。近年来，OMVs的治疗潜力开始受到关注，例如作为疫苗或药物递送载体的应用。尽管OMVs来源于外膜，但长期以来人们已认识到其脂质和蛋白质 cargo 与外膜本身存在差异，且差异往往显著。最近研究发现，细菌能够释放多种类型的OMVs，并有证据表明OMVs的大小会影响其被宿主细胞摄取的机制。然而，该领域的研究受限于难以高效分离不同大小的异质性OMVs。传统上采用密度梯度离心（DGC）进行此类分离，但该技术耗时较长且难以放大。相比之下，尺寸排阻色谱法（SEC）操作更为简便，并更适用于未来OMVs在治疗应用中的规模化制备。本文中，我们描述了一种SEC方法，可实现对不同大小囊泡的可重复分离，以由 伴放线聚集杆菌，直径范围从小于150 nm到大于350 nm。我们展示了分离 "大" (350 nm) OMVs 和 "小" (<150 nm）的OMVs，并通过动态光散射（DLS）进行验证。由于尺寸排阻色谱（SEC）法在操作简便性、可重复性（包括不同操作者之间的一致性）以及可放大性方面具有优势，我们推荐使用基于SEC的方法而非基于密度梯度离心（DGC）的方法来分离不同大小的囊泡。

引言

革兰氏阴性菌在生长过程中会释放来源于其外膜的囊泡，即外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）。这些OMV通过携带多种重要的生物分子（包括DNA/RNA、蛋白质、脂质和肽聚糖），在细胞间通讯中发挥重要作用，不仅介导细菌与宿主之间的相互作用，也参与细菌细胞之间的交流1,2。特别是，由于OMV富含某些毒力因子和毒素，其在细菌致病过程中的作用已被广泛研究3,4,5,6,7,8,9,10,11。

据报道，外膜囊泡（OMVs）的大小范围为20至450 nm，具体尺寸取决于母体细菌种类及其生长阶段，且多种细菌释放的OMVs在尺寸上具有异质性8,12,13,14，这些OMVs在蛋白质组成及进入宿主细胞的机制方面也存在差异12。H. pylori释放的OMVs直径范围为20至450 nm，其中较小的OMVs比大型OMVs具有更均一的蛋白质组成。重要的是，观察到这两类OMVs通过不同的机制被宿主细胞内化12。此外，我们已证实Aggregatibacter actinomycetemcomitans会同时释放一群小型（<150 nm）和一群大型（>350 nm）的OMVs，且这些OMVs含有大量分泌型蛋白毒素——白细胞毒素（LtxA）15。尽管OMVs的异质性在细胞过程中所起的作用显然重要，但分离和分析不同囊泡群体的技术困难限制了相关研究的开展。

除了在细菌致病性中的重要作用外，外膜囊泡（OMVs）还被提议用于多种生物技术应用，例如作为疫苗和药物递送载体16,17,18,19,20。为了在这些应用中实现转化，需要获得纯净且单分散的囊泡制剂。因此，必须采用有效 且高效的分离方法。

最常用的方法是密度梯度离心（DGC），用于将大小异质的囊泡群体与细胞碎片（包括鞭毛和分泌蛋白）分离21；该方法也被报道可用于分离大小异质的外膜囊泡（OMV）亚群12,13,14。然而，DGC 耗时较长、效率较低，且不同操作者之间的结果重复性差22，因此不适合放大生产。相比之下，尺寸排阻色谱（SEC）是一种可放大、高效且结果一致的 OMV 纯化方法21,23,24。我们发现，使用一根长（50 cm）、重力流的填充凝胶过滤介质的 SEC 柱，足以高效纯化并分离 OMV 的不同亚群。具体而言，我们采用该方法将 A. actinomycetemcomitans 的 OMV 分离为"大"和"小"亚群，同时去除蛋白质和 DNA 污染。整个纯化过程在 4 小时内完成，实现了 OMV 亚群的完全分离以及碎片的有效去除。

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方案

1. 缓冲液的配制

  1. 配制 ELISA 洗涤缓冲液：将 3.94 g Tris-base、8.77 g NaCl 和 1 g 牛血清白蛋白（BSA）加入 1 L 去离子水（DI）中，再加入 500 µL 吐温-20（polysorbate-20）。用 HCl 或 NaOH 调节 pH 至 7.2。
  2. 配制封闭缓冲液：将 3.94 g Tris-base、8.77 g NaCl 和 10 g BSA 加入 1 L 去离子水（DI）中，再加入 500 µL 吐温-20（polysorbate-20）。用 HCl 或 NaOH 调节 pH 至 7.2。
  3. 配制洗脱缓冲液（PBS）：将 8.01 g NaCl、2.7 g KCl、1.42 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4 加入 1 L 去离子水中，用 HCl 或 NaOH 调节 pH 至 7.4。
    ​注意：该缓冲液可配制成 10 倍浓缩液，使用时根据需要以去离子水稀释。

2. 外膜囊泡样本的制备

  1. 培养 A. actinomycetemcomitans 将细胞培养至对数生长后期（600 nm 处光密度为 0.7）。在 10,000 ×g 条件下离心两次，收集细胞沉淀 x g 在 4 °C 10分钟。将上清液通过滤膜过滤 0.45 µm 过滤器
  2. 使用50 kDa分子量截断滤器浓缩无菌上清液。将浓缩后的溶液在105,000 x g条件下超速离心 4 °C 30 分钟 
  3. 将沉淀重悬于PBS中，再次进行超速离心（105,000 × g，4 °C，1 h） x g 在 4 °C 30分钟。将沉淀重悬于2 mL PBS中。

3. 装填 S-1000 柱

  1. 用玻璃搅拌棒混匀凝胶过滤介质的原液瓶，然后将足够填满层析柱体积的介质倒入玻璃瓶中，另多准备约50%的过量体积（约135 mL）。让这些凝胶珠静置至完全沉降，倾去上清液。用洗脱缓冲液重悬凝胶珠，使最终溶液中凝胶体积约占70%，缓冲液约占30%。在真空条件下对溶液进行脱气处理。
  2. 使用铁架台将玻璃层析柱垂直固定，并加入洗脱缓冲液润湿柱管内壁。排出缓冲液，直至柱内剩余约1 cm高的缓冲液液面。
  3. 避免产生气泡，小心地用移液器将凝胶珠缓慢加入层析柱中，直至填满至柱顶。在此过程中持续排出多余的缓冲液。注意在向柱顶添加更多凝胶珠之前，不要让已加入的凝胶完全沉降。层析柱的填装高度应达到柱储液器底部以下约2 cm处。

4. 上样并收集组分

  1. 在真空条件下对洗脱缓冲液进行脱气。用两倍柱体积（180 mL）的洗脱缓冲液清洗层析柱。
  2. 让剩余缓冲液完全进入层析柱。当缓冲液降至凝胶层顶部时，小心地将含有OMVs的2 mL样品（脂质浓度约为100 - 200 nmol/L）加至凝胶表面，注意不要扰动柱顶的凝胶颗粒。让样品完全进入凝胶，即液体完全沉降至凝胶层以下，凝胶表面无残留液体。 
  3. 在凝胶柱顶部小心缓慢地加入洗脱缓冲液。切勿扰动凝胶的顶层，以免导致样品稀释。
  4. 在柱下放置一个50 mL收集管并打开柱阀。收集前20 mL流出液。根据需要，小心地向柱顶补充洗脱缓冲液，确保凝胶始终不干燥。
  5. 在柱下依次放置一系列1.5 mL离心管。打开柱阀，开始收集，每管收集1 mL流出液。在收集过程中，根据需要持续向柱顶添加洗脱缓冲液。重复此步骤，直至收集完96个组分。停止过柱。
    注意：样品若需长期保存，应储存于-20 °C；短期保存可置于4 °C，直至后续分析。
  6. 清洗层析柱时，先用一倍柱体积（90 mL）的0.1 M NaOH溶液过柱，再用两倍柱体积（180 mL）的洗脱缓冲液冲洗层析柱。

5. 样品分析

  1. 为测定各组分中的脂质浓度，将每种组分各50 µL移取至96孔板的单个孔中。向每个孔中加入2.5 µL亲脂性染料，孵育15秒。使用酶标仪在激发波长515 nm、发射波长640 nm条件下测定荧光强度。为计算各样品中各组分的脂质占比，需将所有发射荧光强度加和，再将每个单独的荧光强度除以总强度。
  2. 为测定特定蛋白质的浓度，将每种组分各100 µL移取至ELISA免疫板的单个孔中，在25 °C孵育3小时。
    1. 倾去样品，向每个孔中加入200 µL ELISA洗涤缓冲液，倾去液体，重复此步骤四次，共洗涤五次。
    2. 向每个孔中加入200 µL封闭缓冲液，在25 °C孵育1小时，然后倾去液体。
    3. 将板与100 µL封闭缓冲液加一抗（纯化抗体稀释比例为1:10,000；未纯化抗体稀释比例为1:10）在4 °C孵育过夜，然后倾去液体。
    4. 向每个孔中加入200 µL ELISA洗涤缓冲液，倾去液体，重复此步骤四次，共洗涤五次。
    5. 向每个孔中加入100 µL ELISA洗涤缓冲液加二抗（稀释比例为1:30,000），在25 °C孵育1小时。
    6. 向每个孔中加入200 µL ELISA洗涤缓冲液，倾去液体，重复此步骤四次，共洗涤五次。
    7. 向每个孔中加入100 µL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）单组分溶液，孵育15–30分钟，或直至出现蓝色。加入50 µL终止液以终止TMB反应。
    8. 使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度。
  3. 为测定总蛋白浓度，使用紫外-可见分光光度计测定各组分在280 nm波长下的吸光度（A280）。

该实验方案的示意图见图1。

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图1：SEC 操作流程示意图。 使用脱气的凝胶过滤介质小心地装填色谱柱，避免产生气泡和断层，随后用两倍柱体积的洗脱缓冲液洗涤。接着，将样品小心地用移液器加至凝胶顶部，避免扰动凝胶床。打开色谱柱，使样品完全进入凝胶。此时，在柱顶加入缓冲液，并收集前 20 mL 流出液。随后，连续收集一系列 1 mL 的组分。将这些组分转移至 96 孔板或 96 孔免疫板中，用于分析脂质和蛋白质含量。 请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

图2 展示了该方法的代表性结果。首先通过超速离心法从培养上清液中纯化出由 A. actinomycetemcomitans JP2 菌株产生的外膜囊泡（OMVs）15。我们先前发现，该菌株可产生两种OMV群体，一种直径约为300 nm，另一种直径约为100 nm15。为了分离这两种OMV群体，我们采用上述尺寸排阻色谱（SEC）方案对样品进行纯化。各组分通过亲脂性染料检测脂质含量，并通过酶联免疫吸附试验（ELISA）或免疫印迹法检测毒素（LtxA）含量。脂质和毒素浓度以百分比形式报告，其中“%脂质”表示每个组分中所含脂质占样品总脂质含量的百分比，“%毒素”表示每个组分中所含毒素占样品总毒素含量的百分比。

图2A展示了三次独立纯化实验的平均脂溶性染料结果及其标准差，每次实验由不同操作者完成，证明了该技术的可重复性。结果显示两个明显的脂质峰，分别对...

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讨论

本文提供了一种简单、快速且可重复的细菌外膜囊泡（OMV）亚群分离方案。尽管该技术相对直接，但某些步骤必须极为谨慎地操作，以确保在层析柱中实现有效的分离。首先，必须小心而缓慢地将凝胶装入层析柱中，以避免产生气泡。我们发现，在装柱前将凝胶于室温下放置数小时，可使凝胶充分平衡，并显著减少层析柱内气泡的形成。将凝胶通过移液枪加入层析柱时，应沿着柱壁缓慢加入，以尽量减少湍流。在整个装柱过程中，层析柱内应始终保持过量的缓冲液，防止已沉降的凝胶出现断层。若发生断层，应添加更多缓冲液，并通过上下吹打使凝胶重新悬浮。

同样，将样品上样到层析柱中是至关重要的步骤。由于样品在通过层析柱时会被稀释，因此在进行尺寸排阻层析（SEC）分离前，上样样品应具有足够的浓度。对于A. actinomycetemcomitans的外膜囊泡（OMVs），我们发现含有约100–200 nmol/L脂质的1 mL样品最为理想。将样品小心地加至层析柱顶部时，应避免扰动凝胶层，待样品完全进入凝胶柱后即开始运行层析柱。此时应停止运行，以便小心地在凝胶顶部加入一层缓冲液。建议仅加入少量缓冲液（约1 mL），以确保不...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由美国国家科学基金会（1554417）和美国国立卫生研究院（DE027769）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
一步法超敏TMB-ELISAThermo Scientific34028
Amicon 50 kDa 滤膜Millipore SigmaUFC905024
牛血清白蛋白（BSA）Fisher ScientificBP9704-100
ELISA 免疫板Thermo Scientific442404
FM 4-64Thermo ScientificT133201.5 x 50 cm
玻璃 Econo-Column 层析柱BioRad7371552
Infinite 200 Pro 酶标仪Tecan
氯化钾（KCl）Amresco (VWR)0395-500G
无水磷酸二氢钾（KH2PO4）Amresco (VWR)0781-500G
Sephacryl S-1000 超细凝胶GE Healthcare17-0476-01
氯化钠（NaCl）Fisher ChemicalS271-3
无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）Amresco (VWR)0404-500G
Tris 碱VWR0497-1KG
Tween(R) 20Acros Organics23336-2500

参考文献

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