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基于共聚焦激光扫描显微镜的整装透明化小鼠肺组织中Aspergillus fumigatus分生孢子分布的定量分析

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DOI：

10.3791/62436

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2021年9月18日

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1Research Center for Molecular Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases, Moscow Institute of Physics and Technology, 2Department of Immunology, Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Institute of Biological Information Processing (IBI-7: Structural Biochemistry), Forschungszentrum Jülich

本文内容

摘要

我们描述了一种对小鼠气道中Aspergillus fumigatus分生孢子（大小为3 µm）分布进行定量分析的方法。该方法也可用于分析在各种病理模型中微粒和纳米颗粒聚集体在气道内的分布情况。

摘要

Aspergillus fumigatus 分生孢子是一种可经空气传播的病原体，能够侵入人类呼吸道。无过敏史的免疫功能正常个体通常表现出抵抗能力及免疫耐受，而在免疫功能低下患者中，分生孢子可在呼吸道定植并引发严重的侵袭性呼吸系统疾病。不同呼吸道区域的多种细胞参与了阻止真菌入侵的免疫反应；然而，病原体清除过程中的时空动态特征尚未完全阐明。通过对光学透明化处理的完整器官（尤其是实验小鼠的肺组织）进行三维（3D）成像，可在感染后的不同时间点检测呼吸道内荧光标记病原体的分布情况。在本研究中，我们描述了一种用于定量分析A. fumigatus分生孢子在呼吸道内分布的实验方案。利用荧光共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），我们在小鼠经口咽接种后6小时，追踪了荧光标记的 分生孢子在支气管分支及肺泡腔内的定位。本研究所述方法此前已被用于精确确定病原体位置，并识别免疫反应不同阶段与病原体相互作用的细胞类型。该实验方案可用于评估在不同病理状态下病原体清除的动力学过程。

引言

人们每天都会吸入空气中的病原体，包括机会性真菌Aspergillus fumigatus（A. fumigatus分生孢子）的孢子，这些孢子可侵入呼吸道1。哺乳动物的呼吸道是由不同级别的气道组成的系统，各级气道因其管壁结构不同而具有各自特征2,3,4。气管支气管壁由多种细胞类型构成，其中包括可执行黏液纤毛清除功能的纤毛细胞5。在肺泡中则不存在纤毛细胞，因此侵入肺泡腔的病原体无法通过黏液纤毛清除机制被清除6。此外，每一级气道均为多种免疫细胞群体的生态位，且这些群体的亚群在特定气道区室中具有独特性。例如，肺泡巨噬细胞定位于肺泡区室，而气管和传导性气道的内表面则分布有上皮内树突状细胞7,8。

A. fumigatus 分生孢子的大小约为 2-3.5 µm9。由于人类甚至小鼠的细小气道直径均超过 3.5 µm，因此有研究认为分生孢子可进入肺泡腔2,10,11。事实上，组织学检查已在患有曲霉病患者的肺泡中观察到真菌生长12。通过厚肺切片的活体成像技术，也在感染小鼠的肺泡中检测到分生孢子13。同时，在小鼠支气管上皮腔面也检测到了分生孢子14。

对光学透明化处理的完整小鼠肺组织进行三维（3D）成像，可实现对气道的形态计量学分析15。特别是，已利用光学透明化的小鼠肺组织样本对脏层胸膜神经分布进行了定量分析15。最近，Amich 等人16通过光学透明化小鼠肺组织样本的光片荧光显微镜技术，研究了将分生孢子经鼻接种至免疫功能低下小鼠后真菌的生长情况。明确感染后不同时间点静息态分生孢子在气道中的精确定位，对于识别在炎症特定阶段能够提供充分抗真菌防御的细胞群体具有重要意义。然而，由于尺寸相对较小，目前对A. fumigatus分生孢子在气道内分布的时间-空间特征仍缺乏充分表征。

本文介绍了一种用于定量分析感染小鼠气道中A. fumigatus分生孢子分布的实验方法。通过对经口咽途径接种荧光标记的A. fumigatus分生孢子的小鼠，获取其光学透明化肺组织的荧光共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像，进而获得三维图像并进行图像处理。通过全肺叶整体三维成像，我们此前已证实了在接种分生孢子72小时后，A. fumigatus分生孢子在小鼠传导性气道中的分布情况8。

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方案

本文所述所有涉及实验动物的方法均已获得俄罗斯科学院谢米亚金和奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准（方案编号 226/2017）。

1. A. fumigatus 分生孢子应用

  1. 为获得荧光标记的A. fumigatus分生孢子，向分生孢子沉淀中加入1 mL 3%多聚甲醛，固定5 × 108个分生孢子。将样品置于50 mL试管中，在室温下振荡孵育2小时。
  2. 用20 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤分生孢子：在1,000 × g离心15分钟，小心移除上清液，并加入 20 mL新鲜PBS。重复此步骤一次。
  3. 将分生孢子溶解于900 µL 0.1 M NaHCO3溶液中。
  4. 将594 nm荧光染料的琥珀酰亚胺酯溶解于100 µL二甲基亚砜中，并加入分生孢子悬液中。
  5. 在室温下以150 rpm振荡孵育分生孢子与染料1小时。
  6. 在离心机中用20 mL PBS洗涤分生孢子两次，每次1,000 × g离心15分钟。
  7. 用PBS将分生孢子稀释至浓度为1 × 108个分生孢子/mL，并于4 °C保存。
  8. 使用0.5–3%异氟烷蒸气麻醉小鼠。将小鼠固定于固定装置上，用平头镊子固定舌头并堵住鼻孔。使用单通道移液器将50 µL分生孢子悬液滴加至小鼠咽部，等待悬液被吸入。

2. 样品制备

  1. 准备一个50 mL离心管，加入15 mL新鲜的2%多聚甲醛溶液。将手术器械（15 cm带齿解剖镊、8 cm细尖镊子和10 cm钝头剪刀）放入70%乙醇溶液中消毒。
  2. 根据IACUC规程实施小鼠安乐死。然后将小鼠仰卧位放置，并用针固定四肢。
    注意：若采用颈椎脱位法进行安乐死，需确保气管结构完整。
    1. 使用喷雾器将70%乙醇喷洒于小鼠体表进行处理。
    2. 从后肢至前肢及下颌处，沿腹侧中线纵向切开皮肤。
    3. 使用带齿镊子和闭合的剪刀分离皮肤与皮下组织，并用针固定皮肤上端。
    4. 切开腹壁，分离肝脏与膈肌。用闭合的剪刀小心夹起膈肌，随后剪断膈肌。
    5. 沿胸腔和颈部的结缔组织做正中切口，直至暴露气管。
  3. 将丝线穿过气管下方，并使用两把镊子打外科结。
    注意：也可使用牙线代替丝线。
    1. 小心拉紧丝线，用剪刀将肺组织从周围结缔组织上剪下。操作时保持剪刀与实验台面垂直。
    2. 将肺组织放入装有2%多聚甲醛的50 mL离心管中，丝线末端留在管外，盖紧管盖后翻转离心管，使肺组织完全浸没于多聚甲醛中。于4 °C条件下固定过夜。
  4. 使用解剖刀将肺叶从心脏及彼此之间分离。
    1. 将分离的肺叶置于24孔板中，每叶置于独立孔内。每孔加入1 mL Tris缓冲盐水（TBS，pH 7.4），在摇床上以150 rpm振荡洗涤，每次1小时，共洗涤5次。
    2. 弃去TBS，每孔加入1 mL封闭液（含1% Triton X-100和5%脱脂奶粉的TBS），于室温摇床上继续孵育过夜。
    3. 弃去封闭液，每孔加入1 mL链霉亲和素-488 nm荧光染料偶联物，用TBS按1:30比例稀释，于室温摇床上（150 rpm）孵育至少72小时。
  5. 在1 mL TBS中于室温摇床（150 rpm）上洗涤样本，每次1小时，共洗涤5次。将样本转移至新的孔板中，加入2%多聚甲醛，于4 °C条件下过夜，进行后固定。

3. 小鼠肺叶光学透明化

  1. 将样品放入装有 3 mL 50% 甲醇-水溶液的 5 mL 玻璃瓶中，于室温下置于样品混合器上处理 1 小时。
  2. 将 3 mL 50% 甲醇溶液替换为 3 mL 100% 甲醇，并置于样品混合器上处理 2 小时。同时配制总体积为 1 mL 的苯甲醇与苯甲酸苄酯（BABB）按 1:2 v/v 比例混合的溶液。
  3. 将样品转移至 24 孔板中，加入 1 mL BABB 混合液覆盖样品，孵育至少 30 分钟。切勿将样品长时间置于 BABB 中；BABB 可能损坏塑料板并使样品过度变硬。
  4. 将样品放入细胞成像用盖玻片底培养皿中。样品现已准备好进行成像。

4. 采用共聚焦激光扫描显微镜对小鼠肺叶进行成像

  1. 打开显微镜系统，启动显微镜软件。在定位选项卡中打开透射光。选择10倍物镜。
    注意：如需更详细的分析，可使用20倍物镜，但这会延长实验时间并增加图像文件大小。
  2. 将带有样本的腔室放入盖玻片夹持器中。将夹持器放置在物镜上方的XY载物台上。使用载物台的XY控制旋钮将样本居中对准物镜。利用透射光和目镜手动找到样本的Z平面。
  3. 将软件切换至采集选项卡。选择CLSM λ模式。打开488 nm和561 nm激光器。选择488/561 nm二向色镜。将探测器的光谱范围调整为490–695 nm。将激光功率调节至适当范围（10–50 µW）。将探测器增益调节至750–900范围内。
    注意：增益过高会引入噪声，应避免。
  4. 通过点击1 AU按钮将针孔缩小至1个艾里单位。将像素分辨率设置为512 × 512像素。
  5. 开启Z层扫描模式。启动实时成像。选择两个荧光染料均可见的焦平面。
    注意：如有必要，调节激光功率以平衡两种荧光染料的亮度。使用图库和单通道模式，以避免信号截断并精确匹配荧光强度。
  6. 展开出现的Z层扫描面板。使用调焦旋钮找到样本的最底层平面，并点击Z层扫描面板中的起始按钮。向上移动焦平面以找到样本的顶部边界，并使用终止按钮保存该位置。在Z层扫描面板中检查样本深度的表示情况。
    注意：在选定起始和终止位置后，Z层扫描面板中将显示样本深度的示意图。
  7. 通过观察Z层扫描面板，使用调焦旋钮将物镜定位至接近样本底部的位置，大约距离样本底部20 µm处。
  8. 关闭Z层扫描模式，开启拼接扫描模式。根据样本大小，以适当数量的图像块进行成像采集。5 × 5 图像块是一个良好的起始设置。
  9. 调整图像块数量和样本的XY位置，直到整个肺组织完全包含在拼接图像内。根据新确定的样本中心XY位置，重新核对Z层扫描位置的准确性。
  10. 同时开启Z层扫描和拼接扫描模式。将Z步进（在Z层扫描面板中）设置为5 µm。将扫描速度设置为6。开启自动保存功能，并启用保存独立图像块选项。为文件命名，然后点击开始实验按钮。
  11. 确认实验总时长未超过显微镜的预定使用时间；若超出，请调整扫描速度。
    ​注意：预计文件大小超过10 GB，请确保硬盘有足够的存储空间。

5. 光谱解混与拼接

  1. 使用软件进行初始图像处理。进行光谱解混时，选择解混选项。选择两个区域，分别对应链霉亲和素/气道和分生孢子，以从图像中获取光谱。点击开始解混。
    ​注意：也可使用现有488和594 nm荧光染料的光谱。
  2. 打开文件进行图像处理，选择处理选项卡。在方法部分，选择几何和图像拼接。在参数部分，选择新建输出并勾选融合图块选项。使用参考模式，选择对应气道荧光的通道。点击应用以执行拼接。

6. 图像处理：表面渲染

  1. 以Surpass 3D 视图打开图像。针对用于气道可视化的通道，使用表面（Surface）选项创建气道表面。选择平滑（Smoothing）参数为 10 µm。
    注意：同时选择自动阈值。
  2. 目视检查表面。调整阈值以减少异常信号。去除胸膜和血管的表面。
  3. 使用编辑（Edit）和全部遮罩（Mask All）选项为气道表面创建遮罩。选择气道通道，并将表面外的体素（Voxels outside the surface）设为 0.001。
  4. 将包含气道遮罩的文件保存为 TIFF 序列至指定文件夹。将包含分生孢子通道的文件另存为 TIFF 序列至单独的文件夹。

7. 图像处理：掩模校正

  1. 在开源的生物图像分析平台17中以8位图像形式打开气道掩膜文件，点击Process | Binary | Make Binary将图像转为二值图像。
    注意：如有必要，可对掩膜进行修正：使用Polygon selection（多边形选择）工具选中并点击Delete（删除）标签，去除多余区域；也可使用Flood Fill Tool（填充工具）完成修正。
  2. 通过多次应用Dilate (3D)（膨胀，3D）来补全缺失区域：点击Plugins | Process | Dilate (3D)。随后点击Process | Binary | Fill Holes填充孔洞。利用选区工具和ROI manager interpolation（ROI管理器插值）手动填补掩膜中残留的孔洞。再应用多次Erode (3D)（腐蚀，3D）操作（Plugins | Process | Erode (3D)）以重新采样掩膜厚度。
    注意：可通过Plugins | Macros（插件 | 宏）功能创建宏，用于重复执行多个Dilate (3D)和Erode (3D)操作。
    确保Erode (3D)操作的次数与Dilate (3D)操作的次数相等。
  3. 将掩膜保存为一个新的文件夹中的TIFF序列。

8. 分生孢子定量分析

  1. 在编程与数值计算平台中打开应用程序：https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter。
  2. 点击 添加文件 按钮，选择气道掩膜文件夹和分生孢子文件夹。
  3. 设置介于 0 到 1 之间的自定义阈值，然后点击确定按钮。
  4. 将输出表格保存为自定义的 .xls 文件。
  5. 使用统计分析软件对数据进行分析。

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结果

按照上述方案，获得了显示小鼠肺叶中气道及A. fumigatus分生孢子的三维图像（图1A）。用于气道可视化的链霉亲和素标记了支气管和细支气管15。此外，大血管（可通过其形态与气道明确区分）以及胸膜也在气道通道中可见（图1A-C）。通过构建气道表面和掩膜，可去除气道通道中血管和胸膜的投影信号；然而，由于部分支气管分支中链霉亲和素信号较弱，导致气道表面的完整性受损（图1B-C）。对气道掩膜进行进一步处理，可修复缺失的片段（图1D）。

通过在分生孢子接种后的不同时间点取小鼠左肺或右肺上叶，估算了A. fumigatus分生孢子在肺内的分布情况。对于右肺上叶，图像由约30个图块和约250个Z轴层构成。拼...

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讨论

全器官三维成像技术能够在无需解剖标本的情况下获取数据，这对于研究病原体在生物体内解剖分布的空间特征具有重要意义。目前已发展出多种组织光学透明化技术及其改良方法，可有效克服激光散射问题，实现全器官成像15,16,18,19。其中一种定制的组织透明化方法包括基于甲醇的组织脱水与去脂处理，随后使用BABB进行光学透明化。该方法早在100多年前即已建立，并衍生出多种改良方案。在本研究中，我们采用的是Scott et al.15 所描述的最简版本。该方法适用于荧光标记病原体的成像。此外，为实现长时间成像，宜选用光稳定性较高的荧光染料。然而，由于TdTomato对BABB高度敏感，本方法无法用于可视化转基因TdTomato标记的A. fumigatus分生孢子（数据未显示）。因此，本文所述方法适用于静止...

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披露

作者在本研究中无任何利益冲突。

致谢

作者感谢德国埃尔兰根大学医院和埃尔兰根-纽伦堡大学（FUA Erlangen-Nürnberg）的 Sven Krappmann 教授提供烟曲霉（Aspergillus fumigatus）分生孢子菌株 AfS150。作者感谢 MIPT 新闻办公室。V.B. 感谢俄罗斯联邦科学和高等教育部的资助（#075-00337-20-03，项目 FSMG-2020-0003）。关于烟曲霉（A. fumigatus）分生孢子成像与定量的研究由俄罗斯科学基金会（RSF）项目 № 19-75-00082 资助。关于气道成像的研究由俄罗斯基础研究基金会（RFBR）项目 № 20-04-60311 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 594 NHS 酯ThermoFisherA20004
Aspergillus fumigatus 分生孢子ATCC46645菌株 AfS150，为 ATCC 46645 的衍生株
苯甲醇Panreac141081.161198.0–100%
苯甲酸苄酯AcrosAC10586-001099+%
C57Bl/6 小鼠普希诺动物繁育中心（俄罗斯）雄性，12–30 周龄
导管VenisystemsG715-A0118G
细胞成像用玻璃底培养皿Eppendorf307420284 孔或 8 孔，带玻璃底
离心机Eppendorf5804R任何可达到 1000 g 的离心机均可使用
共聚焦激光扫描显微镜ZEISSZEISS LSM780
二甲基亚砜Sigma-Aldrich276855≥99.9%
FIJI 图像处理软件包FIJI免费软件
镊子B. Braun AesculapBD557R有齿
镊子B. Braun AesculapBD321R细尖
镊子Bochem1727光滑
玻璃瓶DURAN242101304带磨口盖
图像编辑软件 PhotoshopAdobe IncAdobe Photoshop CS
GraphPad 软件GraphPadPrism 8
Imaris 显微成像软件Oxford Instruments可申请免费试用 https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
异氟烷Karizoo
NaHCO3Panreac141638
物镜ZEISS420640-9800-000 Plan-Apochromat，10 ×（NA = 0.3）
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
PBSPanecoP060Π
移液器ProLine7220205 至 50 μL
脱脂奶粉RothT145.2
样品混合器DynalMXIC1
剪刀B. BraunBC257R钝头
摇床ApexlabGS-2050–300 rpm
手术刀Bochem12646
丝线B. Braun3 USP
链霉亲和素-Alexa Fluor 488 标记物ThermoFisherS11223
试管SPL Lifesciences5005050 mL
Tris（羟甲基氨基甲烷）HeliconH-1702-0.5 分子量 121.14；CAS 号：77-86-1
Triton X-100AmrescoAm-O694-0.1
ZEN 显微镜软件ZEISSZEN2012 SP5https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html

参考文献

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