聚焦激光扫描显微镜为基础的定量分析 阿斯珀吉卢斯熏蒸 孔尼迪亚分布在全山光学清除鼠肺

Summary

我们描述了对小鼠气道中 阿斯珀吉卢斯·福米加图斯 孔尼迪亚（3微米大小）分布进行定量分析的方法。该方法还可用于分析各种病理条件模型中气道中的微粒和纳米粒子聚集分布。

Abstract

阿斯珀吉卢斯·福米加图斯 ·科尼迪亚是空气中的病原体，可以穿透人类的气道。免疫能力不过敏的人表现出抵抗力和免疫耐受性，而在免疫功能低下的患者中，针叶可以殖民气道并导致严重的侵入性呼吸系统疾病。不同气道舱内的各种细胞参与防止真菌入侵的免疫反应:然而，病原体消除的时空方面尚未完全了解。光学清除的全安装器官，特别是实验鼠的肺部的三维（3D）成像，允许在感染后不同时间点在气道中检测荧光标记的病原体。在本研究中，我们描述了一个实验设置，对气道中的 A.富米加图斯 针叶分布进行定量分析。利用荧光聚焦激光扫描显微镜（CLSM），我们追踪了在向小鼠应用咽喉后6小时，支气管支部和肺泡室中荧光标记的针叶的位置。此处描述的方法以前用于检测准确的病原体位置和识别免疫反应不同阶段的病原体相互作用细胞。实验设置可用于估计不同病理条件下病原体消除的动能。

Introduction

每天，人们吸入空气中的病原体，包括机会性真菌阿斯珀吉卢斯烟熏（A.富米加图斯针叶）孢子，可以穿透呼吸道^1。哺乳动物的呼吸道是不同代的气道系统，其特征是气道壁^2、3、4的不同结构。气管支气管壁由多种细胞类型组成，其中细胞是提供粘膜间隙⁵的细胞。在藻类中，没有细胞，渗透性藻类空间病原体不能通过粘血清除⁶来消除。此外，每个气道生成是多个免疫细胞群的利基，这些群体的子集对于某些气道隔间来说是独一无二的。因此，藻类巨噬细胞位于气管室中，而气管和导管都与腹内树突状细胞^7，8衬里。

A.富米加图斯针叶的大致大小为2-3.5μm^9。由于人类甚至小鼠小气道的直径超过3.5μm，因此建议conidia可以穿透^2、10、11的藻类空间。

Protocol

这里描述的所有实验室动物方法都已得到俄罗斯科学院舍米亚金和奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所机构动物护理和使用委员会（协议编号226/2017）的批准。

1. A. 富米加图斯·科尼迪亚申请

1. 要获得荧光标记 的A.富米加图斯 针叶，修复5×10⁸ 针叶，通过添加1mL的3%的甲醛针叶颗粒。在室温下在 50 mL 试管中孵育 2 小时。
2. 用 20 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗针叶:离心机在 1，000 x g 下 15 分钟，轻轻取出超高纳特，并在 20 mL 的体积中加入新鲜的 PBS。重复。
3. 溶解针叶在900微升0.1 M NaHCO_3。
4. 将 594 nm 荧光染料的苏奇尼米尔酯溶解在 100 微升二甲基硫化物中，并加入针叶。
5. 在室温下，在 150 rpm 的摇床上用染料将针叶孵化 1 小时。
6. 在离心机中用 20 mL 的 PBS 在离心机中用 1，000 x g 清洗针叶两次，15 分钟。
7. 将针叶稀释至 PBS 中浓度为 1 ×^{10 8} 针叶/mL，并储存在 4 °C 下。
8. 用0.5-3%的异黄酮蒸汽麻醉小鼠。把鼠标放在支架上，用光滑的钳子固定舌头，并握住内舌。采取单通道移液器，并应用50μL的针叶悬浮到鼠标....

Results

按照上述协议，获得了显示小鼠肺叶气道和A.富米加图斯针叶的3D图像（图1A）。斯特雷普塔维丁（用于气道可视化）标记支气管和支气管^15。此外，大型船只，很容易从气道的形态区分，和普鲁拉可视化在气道通道（图1A-C）。气道表面和面罩的创建允许在气道通道中移除容器和普鲁拉投影;然而，气道表面的完整性由于几个支气管分支（图1B-C）的链球菌素信号微弱而遭到破坏。气道面膜的进一步处理允许修复丢失的碎片（图1D）。

在小鼠应用针叶后，在不同时间点使用左或右上部肺叶估计小鼠肺部的A.fumigatusconidia的分布。对于右上部肺叶，图像由大约 30 块瓷砖和大约 250 个 Z 堆栈组成。拼接后，通过第 .......

Discussion

全器官三维成像允许在不解剖标本的情况下获取数据，这对研究生物体中病原体解剖分布的空间方面具有重要意义。组织光学清除有几种技术和修改，有助于克服激光散射，并允许全器官成像15，16，18，19。其中一种定制组织清除方法包括甲醇组织脱水和脱皮，然后是与BABB的光学清除。这种方法是在100多年前开发的，并进行了多次修改。在我们的工作中，我们使用了斯科特等人描述的最简单的修改。¹⁵这种方法最适合使用荧光标记的病原体。此外，具有高光静止性的荧光仪更适合长期成像。不幸的是，由于TdTomato对BABB的高灵敏度（数据未显示），转基因TdTomato A. fumigatusconidia的可视化无法使用这种方法。因此，我们在这里描述的方法允许成功检测休息或固定病原体，但不能用于成像生长的A.富米加图斯.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 NHS 酯	ThermoFisher	A20004
烟曲霉 分生孢	ATCC	46645	菌株 AfS150，一种 ATCC 46645 衍生物
苯甲醇	Panreac	141081.1611	98.0-100 %
苯甲酸苄	Acros	AC10586-0010	99+%
C57Bl/6 小鼠	普什奇诺动物繁殖中心 （俄罗斯）		雄性。12 - 30 周龄。
导管	Venisystems	G715-A01	18G
细胞成像 盖玻片底腔室	Eppendorf	30742028	4 或 8 孔室 带盖玻片底
离心机	Eppendorf	5804R	任何提供 1000 g 的离心
共聚焦激光扫描显微镜	蔡	蔡司 LSM780
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	276855	≥99.9%
斐济图像处理软件包	FIJI		Free 软件
镊子	B. Braun Aesculap	BD557R	齿
形镊子	B. Braun Aesculap	BD321R	细尖
镊	Bochem	1727	光滑
玻璃瓶	DURAN	242101304	带磨碎的盖子
图形编辑器 Photoshop	Adobe Inc		Adobe Photoshop CS
GraphPad 软件	GraphPad		Prism 8
Imaris 显微镜成像软件	牛津仪器		https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
Isoflurane	Karizoo
NaHCO3	Panreac	141638
物镜	蔡司	420640-9800-000	Plan-Apochromat， 10 & 次;（NA = 0.3）
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127
PBS	Paneco	P060Π
移液器	ProLine	722020	5 至 50 μL
奶粉	Roth	T145.2
样品混合器	Dynal	MXIC1
剪刀	B. Braun	BC257R	钝
振荡器	Apexlab	GS-20	50-300 rpm
Skalpel	Bochem	12646
丝线	B. Braun		3 USP
链霉亲和素，Alexa Fluor 488偶联物	ThermoFisher	S11223
试管	SPL Lifesciences	50050	50 mL
Tris（羟甲基氨基甲烷）	Helicon	H-1702-0.5	先生 121.14;CAS号：77-86-1
Triton X-100	Amresco	Am-O694-0.1
ZEN显微镜软件	ZEISS	ZEN2012 SP5	https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html