用于体外疾病建模的人原代瓣膜细胞分离

摘要

本方案描述了在手术主动脉瓣置换术过程中或从尸体组织中获取人类主动脉瓣，并随后分离、扩增和鉴定患者特异性的原代瓣膜内皮细胞和间质细胞的方法。文中包含了确保细胞活力和表型特异性的关键操作步骤细节。

摘要

主动脉瓣钙化性疾病（CAVD）存在于近三分之一的老年人群中。主动脉瓣的增厚、僵硬和钙化会导致主动脉瓣狭窄，并促进心力衰竭和中风的发生。该疾病的发病机制是多因素的，炎症、细胞外基质重塑、湍流以及机械应力和应变等刺激因素均会促进瓣膜内皮细胞和瓣膜间质细胞向成骨方向分化。然而，驱动健康细胞向钙化细胞发生成骨转化的精确起始因素尚未完全明确。此外，目前针对CAVD引起的主动脉瓣狭窄的唯一治疗方法是主动脉瓣置换术，即通过手术切除原生瓣膜（外科主动脉瓣置换术，SAVR），或经导管植入完全可折叠的替代瓣膜（经导管主动脉瓣置换术，TAVR）。这些外科手术成本高昂且伴随严重风险；因此，发现新的药物治疗靶点至关重要。为此，本研究建立了一种工作流程，利用患者手术切除组织和供体尸体组织，体外构建患者特异性的瓣膜细胞原代细胞系，用于疾病建模。该方案引入了一种常用于器官移植的低温保存液，以减轻组织切除后至实验室处理期间因常较长的获取时间所造成的损伤，从而显著稳定切除组织中细胞的状态。本研究结果表明，分离得到的瓣膜细胞在供体瓣膜切除后数天内，仍能在体外培养中保持其增殖能力以及内皮细胞和间质细胞的表型特征。利用这些材料，可同时获取对照组和CAVD患者的细胞，并建立相应的对照和疾病细胞系。

引言

主动脉瓣钙化性疾病（CAVD）是一种慢性病理过程，其特征是主动脉瓣叶发生炎症、纤维化和大范围钙化。瓣叶进行性重构和钙化（称为主动脉硬化）可导致血流受阻（即主动脉瓣狭窄），进而引发中风，并导致心力衰竭。目前，CAVD的唯一治疗方法是外科主动脉瓣置换术或经导管主动脉瓣置换术（分别为SAVR和TAVR）。尚无非手术手段能够阻止或逆转CAVD的进展；若不进行瓣膜置换，患者在2至3年内的死亡率接近50%^1,2,3。明确驱动该疾病发展的潜在机制，将有助于发现潜在的新型治疗策略。

在健康的成年人中，主动脉瓣瓣叶厚度约为一毫米，其主要功能是维持血液从左心室单向流出⁴。三个瓣叶中的每一个均由一层瓣膜内皮细胞（VECs）构成，该层细胞覆盖在瓣叶的外表面并发挥屏障作用。VECs通过调节通透性、炎症细胞黏附以及旁分泌信号传导来维持瓣膜稳态^5,6,7。瓣膜间质细胞（VICs）构成了瓣叶内大多数细胞⁸。VICs在瓣叶中排列为三个不同的层次，....

方案

所有患者样本均来自经匹兹堡大学机构审查委员会批准的研究项目中的受试者，研究遵循《赫尔辛基宣言》的规定。通过器官获取与教育中心（CORE）获得的遗体组织样本，已获匹兹堡大学涉及遗体的研究与临床培训监督委员会（CORID）批准。

1. 批准与安全

1. 根据《赫尔辛基宣言》的要求，获取机构审查委员会（IRB）对采集患者样本或尸体组织的批准或豁免函。
2. 完成机构要求的与人体组织操作相关的培训，例如血源性病原体培训、生物医学人体受试者研究培训、隐私与信息安全培训，以及生物材料的运输与递送培训。

2. 后勤与准备

1. 手术样本
   1. 确保在手术室附近配备冰箱。在冰箱中放置预先贴好匿名编号标签的50 mL锥形管，每管含40 mL无菌分装的低温保存液，供手术人员使用。这些试管在4 °C条件下保存，有效期以原包装标注的截止日期为准。
   2. 取出组织后，立即将瓣膜组织放入上述锥形管中。将锥形管置于密封的第二层容器内（如防漏塑料袋或塑料容器），并在容器上贴上生物危害标识。根据机构规定的生物危害物运输流程，组织样本需在冰上运输并由专人收取。
2. 尸体来源样本
   1. 将获取的器官完全浸入低温保存液中，放入密封的第二层容器内，并根据机构规定的生物危害物运输流程在冰上运输。
   ....

结果

上述方案概述了处理人类瓣膜组织并从中分离和建立可存活细胞系所需的步骤。主动脉瓣瓣叶被分别处理，用于石蜡包埋、快速冷冻以长期保存用于生化或遗传分析，以及消化以分离血管内皮细胞（VECs）和瓣膜间质细胞（VICs）（图1）。尽管手术标本通常具有主动脉瓣狭窄的临床诊断，并可能表现出肉眼可见的严重钙化结节，但在大量老年人群（>65岁）中也普遍存在主动脉瓣钙化现象³²。鉴于该现象的高发性，所有组织样本——无论是手术来源还是尸体来源——均需进行Von Kossa染色或类似处理，以评估是否存在钙化（图2）。

研究发现，使用低温保存液可显著稳定切除瓣膜组织中的细胞。低温保存液常用于活体器官移植，在供体器官摘取前后通过灌注方式注入器官，并在冰上运输期间保留在该器官的血管系统中。观察发现，相较于手术组织，供体样本更容易建立血管内皮细胞（VEC）系，且供体来源的细胞系更有可能在多次传代后仍保持其内皮细胞形态。这一点令人困惑，因为供体组织通.......

讨论

获取人类的正常组织与病变组织对于体外和离体疾病建模至关重要；然而，尽管人们经常讨论从实验室到临床转化的挑战，反过来从手术室到实验室的过程——即从手术切除到实验研究——同样充满困难。基础科学家若要获得原代人类组织样本，必须与有投入的外科科学家开展合作，后者需拥有包括护士、手术技术人员、医师助理、医学生、住院医师以及临床方案管理人员在内的团队，能够完成患者的入组与知情同意，参与并协助切除组织的正确处理，并协调组织取材所需的各项后勤工作。若所有相关人员未能尽最大努力缩短组织切除至细胞分离之间的时间，则关键的细胞材料及其所携带的信息将发生不可逆的改变或丢失。

保持组织标本活性的关键在于使用冷保存液。该溶液与UPMC及其他移植医疗中心的器官移植团队所使用的溶液相同。相较于从手术室较快获取但保存在冷PBS中的组织，从供体切除后数小时才获取的尸体组织获得了更高的细胞得率。这一偶然发现对于从人体组织中获取细胞至关重要。手术组织从切除到送至实验室的获取时间通常为1至5小时，而尸体组织则可长达24小时以上。相比之下，动物组织的获取与处理通常可在安乐死后数分钟内完成，这更有利于维持细胞活性。在缺乏冷保存.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.45 μm 滤膜	Thermo Scientific	7211345	制备胶原蛋白包被的培养板
10 cm 细胞培养板	Greiner Bio-One	664160	细胞培养/细胞系扩增
10 mL 血清移液管	Fisher	14955234	VEC/VIC 分离、细胞培养、细胞系扩增
1000 μL 滤芯吸头	VWR	76322-154	细胞培养/细胞系扩增
10XL 滤芯吸头	VWR	76322-132	细胞培养/细胞系扩增
15 mL 锥形管	Thermo Scientific	339650	组织储存、VIC/VEC 分离
16% 甲醛水溶液	Electron Microscopy Sciences	15710S	组织和细胞固定剂
190 证明乙醇	Decon	2801	消毒
1x DPBS：无钙、无镁	Gibco	14190250	生理盐水溶液。VIC/VEC 分离
1x PBS	Fisher	BP2944100	生理盐水溶液。组织制备、VIC/VEC 分离
20 μL 滤芯吸头	VWR	76322-134	细胞培养/细胞系扩增
200 证明乙醇	Decon	2701	脱蜡组织样本
2-丙醇	Fisher	A416P 4	制备胶原蛋白包被的培养板
5 mL 血清移液管	Fisher	14955233	VEC/VIC 分离、细胞培养、细胞系扩增
50 mL 锥形管	Thermo Scientific	339652	组织储存、VIC/VEC 分离
60 mm 培养皿	GenClone	25-260	VEC 分离
6 孔细胞培养板	Corning	3516	细胞培养/细胞系扩增
冰醋酸	Fisher	BP2401 500	制备胶原蛋白包被的培养板
AlexaFluor 488 鬼笔环肽	Invitrogen	A12379	荧光 F-肌动蛋白复染剂
Belzer UW 冷保存移植溶液	Bridge to Life	BUW0011L	组织保存溶液
牛血清白蛋白，第五组分 — 无脂肪酸 25g	Bioworld	220700233	使用 CD31+ Dynabeads 验证 VEC
Calponin 1 抗体	Abcam	ab46794	一抗（VIC 阳性染色）
CD31 (PECAM-1) (89C2)	Cell Signaling	3528	一抗（VEC 阳性染色）
CD31+ Dynabeads	Invitrogen	11155D	使用 CD31+ Dynabeads 验证 VEC
CDH5	Cell Signaling	2500	一抗（VEC 阳性染色）
孔径为 0.70 μm 的细胞筛	Corning	431751	VIC 分离
胶原蛋白 I，大鼠尾部蛋白	Gibco	A1048301	制备胶原蛋白包被的培养板
胶原酶 II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176	组织消化。组织制备、VIC/VEC 分离
Conflikt 即用型消毒喷雾	Decon	4101	消毒
Countess II 自动细胞计数仪	Invitrogen	A27977	自动细胞计数
Countess II 可重复使用载玻片盖片	Invitrogen	2026h	自动细胞计数仪所需盖片
盖玻片	Fisher	125485E	安装瓣膜样本
冻存管	Olympus Plastics	24-202	冷冻细胞/组织样本
含 CLOROMAX 的消毒漂白剂 - 浓缩配方	Clorox	N/A	消毒
DMEM	Gibco	10569044	生长培养基。VIC 扩增
EBM - 内皮细胞基础培养基，无酚红 500	Lonza Walkersville	CC3129	生长培养基。VEC 扩增
EGM-2 内皮细胞培养基-2 - 1 套装 SingleQuot 试剂盒	Lonza Walkersville	CC4176	生长培养基补充剂。VEC 扩增
EVOS FL 显微镜	Life Technologies	型号：AME3300	荧光成像
EVOS XL 显微镜	Life Technologies	AMEX1000	细胞系扩增过程中观察细胞
胎牛血清 - 优质选择	R&D Systems	S11550	VIC 扩增
精细剪刀	Fine Science Tools	14088-10	组织制备、VIC/VEC 分离
Fisherbrand 细胞刮刀	Fisher	08-100-241	VIC 扩增
Fungizone	Gibco	15290-026	抗真菌剂：组织制备、VIC/VEC 分离
庆大霉素	Gibco	15710-064	抗生素：组织制备、VIC/VEC 分离
载玻片	Globe Scientific Inc	1358L	安装瓣膜样本
山羊抗小鼠 488	Invitrogen	A11001	荧光二抗
山羊抗小鼠 594	Invitrogen	A11005	荧光二抗
山羊抗兔 488	Invitrogen	A11008	荧光二抗
山羊抗兔 594	Invitrogen	A11012	荧光二抗
Invitrogen Countess II FL 可重复使用载玻片	Invitrogen	A25750	自动细胞计数仪所需载玻片
Invitrogen NucBlue 固定细胞 ReadyProbes 试剂（DAPI）	Invitrogen	R37606	荧光核复染剂
LM-HyCryo-STEM - 2X 干细胞冻存培养基	HyClone Laboratories, Inc.	SR30002	冷冻细胞储存
封片剂	Fisher Chemical Permount	SP15-100	安装瓣膜样本
Mr. Frosty 冷冻容器	Nalgene	51000001	用于控制样品冷冻的容器
Mycoplasma-ExS 喷雾剂	PromoCell	PK-CC91-5051	消毒
青霉素-链霉素	Gibco	15140163	抗生素。VIC 扩增
Plasmocin	Invivogen	ANTMPT	抗支原体。VIC/VEC 分离与扩增
SM22a 抗体	Abcam	ab14106	一抗（VIC 阳性染色）
标准型剪刀	Fine Science Tools	14001-14	组织制备、VIC/VEC 分离
无菌棉签	Puritan	25806 10WC	VEC 分离
Swingsette 人体组织包埋盒	Simport Scientific	M515-2	组织包埋容器
Taylor 镊子（17cm）	Fine Science Tools	11016-17	组织制备、VIC/VEC 分离
台盼蓝溶液，0.4%	Gibco	15250061	细胞计数溶液
TrypLE Express 酶	Gibco	12604021	消化传代 VIC/VEC
Von Kossa 试剂盒	Polysciences	246331	对组织石蜡切片进行钙化染色
von Willebrand 因子抗体	Abcam	ab68545	一抗（VEC 阳性染色）
二甲苯	Fisher Chemical	X3S-4	脱蜡组织样本
αSMA 抗体	Abcam	ab7817	一抗（VIC 阳性染色）