使用工程 HEK 细胞筛选激活 MRGPRX2 的肽

乳腺细胞是免疫系统不可分割的一部分，在先天和自适应免疫反应中起着至关重要的作用。乳腺细胞主要通过抗原与免疫球蛋白E（IgE）-FcéRI受体复合物结合，或者通过最近发现的与男性相关的G-蛋白受体X2（MRGPRX2）1激活。MRGPRX2激活与多种免疫和炎症性疾病有关，因此，了解受体与其配体²的结合机制非常重要。为此，开发并筛选了一个小型肽分子库，对在 HEK 细胞中过度表达的 MRGPRX2 受体进行筛选。在这项研究中，肽库是使用简单多才多艺的阿兰宁扫描和氨基酸截断技术构建的。阿兰宁扫描涉及用阿兰宁残留物取代特定的氨基酸。Alanine 是小而中性的，剥离了被替换残留物赋予的特定特性的肽，并连续突出了氨基酸在受体相互作用中各自的物理化学特性的重要性。相反，在氨基酸截断中，肽序列的设计使其缺少来自N终端、C终端或两者兼有的一个或多个氨基酸残留物。这组肽用于识别对 MRGPRX2 结合至关重要的氨基酸序列。

人类桅杆细胞系（LAD-2）的经验表明，这些细胞很难 在体外培养和维持:两周的加倍时间，昂贵的中等补充剂，以及通过³期间需要的直接注意。这些属性使细胞不适合大规模筛选潜在的配体。在这里，稳定地转染的 HEK 细胞表示 MRGPRX2 受体 （HEK-X2） 用于筛选肽库^1。HEK-293细胞由于其高转化效率、较快的翻倍率以及需要在实验室⁴中培养非昂贵的中等补充剂，被广泛用于表面受体的异质表达。转染 HEK-293 细胞线的方案已经得到证明，并且已经建立了^5。HEK-293细胞稳定地表达MRGPRX2受体（通道13-19）被激活与肽通过N截断，C-截断，N+C截断，和丙氨酸扫描¹产生。野生型 HEK 细胞 （HEK-WT） （通道 16-21） 用作控制。激活后监测细胞内钙释放，以研究基于MGPRX2的活化。

MRGPRX2 的细胞激活后，细胞溶胶钙动员。乳腺细胞中这种受调节的细胞内钙释放由存储操作的钙进入 （SOCE） 调节，由频闪相互作用分子 1 （STIM1） 协调:并且是免疫反应级联^6，7的核心。各种方法已用于检测细胞内钙浓度，包括贴片夹和荧光染料^8。在现有的所有技术中，氟钙染料与各种检测技术结合，正在被广泛使用^。获得兴趣的两种氟染料是:单波长染料（如 Fluo-4）和双波长比例染料（如印度 -1 和 Fura-2）。双波长比度染料带来单波长染料的优势在于，双波长比度染料纠正了染料加载、照片漂白和聚焦^10、11等实验错误。

Fura-2 乙酰酯（Fura-2 AM）是一种细胞渗透的绿色荧光染料，其激发在钙结合后会转移到较低的波长。实验中，Fura-2 的兴奋度为 340 和 380 nm，而排放记录为 510 nm。钙结合后，340纳米的荧光强度增加，而380纳米的荧光强度降低，如图 1所示。数据表示为 340 nm （F340） 激发后的荧光强度与 380 nm （F380） 即 F340/F380 激发后的荧光强度比率。F340/F380的比例是成正比的细胞内钙，其价值可以通过格林凯维奇方程¹²计算。由于荧光信号来自两波长（340 nm 和 380 nm）的染料激发，荧光信号的比例对染料加载、染料泄漏、光出血和细胞密度等实验因素进行了修正。

1. 肽库的设计与开发

1. 要根据已知的配体即 PAMP-12¹³来识别桅杆细胞 MRGPRX2 受体的配体，请按照以下步骤操作。
   1. 通过连续通过固相肽合成（SPPS）截断配体的N端氨基酸残留物，生成N截断肽库。
   2. 通过截断已知配体的 C 端氨基酸残留物，由 SPPS 连续截断 C 截断肽库。"
   3. 根据 1.1.1 和 1.1.2 的结果，分别通过截断 N 和 C 端所需的残留物，使用 SPPS 生成 N+C 截断肽库。
   4. 使用固相肽合成合成肽^13。
   5. 将 N 端修改为乙酰 （Ac） 组，将 C 端修改为阿米德组。
   6. 使用高压液相色谱仪 （HPLC） 和使用质谱光度计的质量来描述肽的纯度。
2. 要研究父PAMP-12分子中特定氨基酸的重要性，请遵循以下步骤。
   1. 通过用丙氨酸取代肽分子中各自的氨基酸残留物，生成阿兰宁扫描肽库，一次使用 SPPS。将 N 端修改为乙酰 （Ac） 组，将 C 端修改为阿米德组。
   2. 使用高压液相色谱仪 （HPLC） 和使用质谱光度计的质量来描述肽的纯度。
      注意:确保合成肽的纯度高。使用质谱学和 HPLC 来描述肽的特征。

2.体外 细胞培养

1. 通过以下步骤培养 HEK-X2 和 HEK-WT 细胞。
   1. 通过补充高葡萄糖DMEM与10%胎儿牛血清（FBS），2mM L-麸质胺，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素补充培养介质。
   2. 通过组织培养（TC）处理T-75培养瓶的细胞，在含有5%CO₂的37°C的孵化器中生长，直到它们达到75-80%的汇合。
   3. 一旦75%的汇流，洗细胞，并添加2-3mL的试丁鱼2-3分钟。在 37 °C、5% CO₂ 孵化器中孵育，分离细胞。
   4. 一旦细胞分离，收集细胞在试金。加入6-9兆L的新鲜介质。
   5. 以 1620 x g 离心细胞 3-5 分钟。
   6. 离心后，丢弃超高纳特收集颗粒。将细胞重新用新鲜培养培养物中恢复。根据所需的浓度稀释细胞。
      注意:HEK细胞是快速生长的细胞，因此优化细胞介质补充剂。HEK细胞是粘附细胞;通过他们在TC处理的文化烧瓶，以支持粘附。
2. 为实验准备一个 96 井测定板。
   1. 在每口井中加入200微升的细胞悬浮，浓度为200，000细胞/mL，以播种40，000个细胞/井。
   2. 在 37 °C、5% CO 2 孵化器中将细胞培养₂₄ 小时。
      注:根据板大小和细胞应变类型优化每口井的细胞密度。在黑色 TC 处理的 96 井板中用平透明底部进行三重切片实验。

3. Fura-2 上午钙检测

1. 按照下面的步骤准备染料。
   1. 使用 Fura-2 AM 染料进行实验。
   2. 准备 HEPES-Tyrode 的缓冲区 （HTB） 缓冲器，其中包含 25 m HEPES 缓冲器、120 mM NaCl、5 mM KCl、1 毫克/mL 葡萄糖、1 毫克/mL 牛血清白蛋白 （BSA）以及新鲜添加的 1.8 mM CaCl₂ 在高压灭菌水中。
   3. 在 50 μg Fura-2 AM 小瓶中加入 50 μL 的 DMSO，以准备 1 mM 库存解决方案的 Fura-2 AM 染料。每 ML 新鲜介质添加 1 μL 1 m Fura-2 AM 染料，以准备具有 1 μM 染料浓度的染料加载介质。
   4. 从孵化器中取出 96 井板并丢弃介质。用新鲜的染料加载介质替换介质。在每口井中加入 200 μL 的染料装载介质。在37°C、5%CO2孵化器中孵育细胞30-40分钟_。
   5. 孵化40分钟后，取出介质。用 HTB 缓冲器清洗细胞。添加 100 μL 的 HTB 缓冲器，用于荧光读取。拿盘子读荧光。
      注:优化染料加载介质中染料的浓度。染料泄漏和光出血可能是与染料相关的问题。将新鲜加入的 CaCl₂ 添加到 HTB 缓冲器中以避免降水。

4. 细胞激活和荧光读数

注:带自动管道系统的荧光板读卡器允许化合物从复合源自动转移到检测板，而无需将板从板读取器中取出。

1. 当细胞被孵育时，设置 板读取器。
   1. 将 温度 设置为 37 °C。
   2. 在 设置中，选择 Flex。
   3. 将 阅读模式 设置为 荧光 和 底部读取。
   4. 在 波长中， 将 波长 数设置为 2。将 激发设置 为 340 nm 和 380 nm。将 排放 设置为 510 nm。
   5. 将 敏感度 保留为 默认值。
   6. 在 时间，将 间隔 设置为3.9s。将 运行时间 设置为 94s 以获得 25 读取。
   7. 接下来，选择 检测板类型。
   8. 接下来，选择 威尔斯阅读。
   9. 在 复合转移中，将 转移 设置为 1， 初始卷 设置为 100 μL。 将 派佩特高度 设置为 100 μL， 将音量 设置为 50 μL， 将时间点 设置为 36 s，以便在第 10 读取时添加化合物。
   10. 接下来，选择 复合源 板类型。
   11. 离开三叶草不使用。
   12. 选择 派佩特提示布局中的提示。
   13. 对于 复合柱和尖端柱，确保要转移的化合物位于复合板的第 1 列中。将 提示列 设置为 1， 将复合列 设置为 1。
   14. 离开 自动校准 作为 打开。
   15. 单击 "确定"。
2. 当温度达到 37 °C 时，将板加载到 板读取器中。
   1. 按 阅读室 ，将 检测板 放入荧光 板读卡器中。
   2. 按 源 放置 复合板。通过添加 200 μL 的各自肽、离子霉素和乙二醇乙二醇（β-氨基乙醚）-N、N、N+、N+-四乙酸 （EGTA）-Triton X-100 溶液，准备 复合板 。
   3. 按 下提示机架 以放置 提示框。使用黑色尖端以避免尖端自动荧光。
   4. 加载板后，请查看软件的设置并按 "阅读"。

5. 数据分析

1. 通过格林凯维奇方程从荧光比中确定钙浓度 -
   
   其中，K_d 是 Fura-2 AM 的分离常数，R 是激发后的排放比，分别在 340 nm 和 380 nm （F340/F380） 上， R_max 是通过添加 50 μL 的 30 μM 离子霉素来观察到的最大荧光比，R_分钟 是通过添加 50 μL 的 100 m M EGTA/2.5%Triton X-100 来观察到的最小荧光， 和F380_分钟 和F380_最大 是Fura-2AM的绝对荧光强度在无钙和绑定状态，分别。
   注:机器会以一定的力量分配液体。不要将肽分配高度设置得离板底太近:它可以分离细胞。使用黑色移液器提示，以避免自发光。阅读每个实验中每个板的最大荧光和最小荧光。

表1包含通过末期氨基酸截断和丙氨酸扫描产生的肽序列。如表1所示，肽序列RKKWNKWALSR缺乏N终端苯丙氨酸（F）的母体PAMP-12，因此是N截断库中具有代表性的肽。同样，在FRKKWNKWALS中，PAMP-12 C终端血清已被移除，代表从PAMP-12衍生的C-截断肽库。在N+C截断肽库中，从N和C终端中去除氨基酸。从N终端截断4个氨基酸，从PAMP-12的C终端截断1个残留物，在WNKWALS中产生。从丙氨酸扫描中提取的肽库有一种氨基酸被阿兰宁取代，就像ARKWNKWALSR一样，N终端苯丙氨酸被阿兰宁取代。Fura-2 AM染料用于研究多肽对MRGPRX2变异的赫克细胞1的活化潜力。数据记录在荧光板读取器上。如果肽配体激活细胞，以 340 nm （F340） 抽出的荧光会增加，而 380 nm 波长 （F380） （图 1a）的荧光度也会增加。然而，对于空白（或为该事项非激活肽或 HEK-WT 控制），相对增加和减少将分别较低，如图 2a 所示。然而，钙浓度由F340/F380的比例表示，如图1b，2b所示。 F340/F380的比例可以在格林凯维奇方程中进一步替代，以便使用原位校准获得钙浓度（图3）。表1所列肽的特点是质谱（图4a）和HPPC（图4b），发现纯度高。

表1:N、C 和 N+C - 截断和丙氨酸扫描后产生的代表性肽序列。肽的N终端被乙酰修改，而C终端包含一个中间体组。

图1:激活肽的代表性数据。 （a） 激活肽的荧光信号。所代表的数据对应于 PAMP-12（FRKKWNKWALSR）。肽是在生成 10 个读取周期（36s）的基线后添加的，箭头如图所示。（b） 激发后的荧光排放比为340纳米（F340），激发后荧光排放的比例为380纳米（F380）（F340/F380）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:空白代表数据。 （a） 空白的荧光信号。HTB 是在生成 10 个读取周期 （36s） 的基线后添加的，如箭头所示。（b） 激发后的荧光排放比为340纳米（F340），激发后荧光排放的比例为380纳米（F380）（F340/F380）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3:染料校准标准的代表数据。（a） 离子霉素被添加在第10读数，如箭头所示，以获得最大荧光在Ca+2绑定状态。EGTA-Triton X-100 是在箭头显示的 20 个读数后添加的，以获得最小信号。（b） 激发后的荧光排放比为340纳米（F340），激发后荧光排放的比例为380纳米（F380）（F340/F380）。这些值被进一步放在格林凯维奇方程中，以获得细胞内钙的浓度。请单击此处查看此图的较大版本。

图4:具有代表性肽的特征，以确认序列和纯度。（a） 具有代表性的肽序列WNKWAL的理论质量为857.90 Da，质谱学中的m/z比显示。（b） 肽的纯度为 99%，经 HPLC 确认。这种肽属于N+C截断肽库。请单击此处查看此图的较大版本。

作者声明没有相互竞争的利益。