介绍了生成可经由MRGPRX2受体激活肥大细胞的短肽文库的技术。相关技术操作简便、成本低廉，且可拓展应用于其他细胞受体。
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摘要
摘要
识别针对具有治疗意义的细胞受体的特异性配体对于多种应用至关重要，包括新疗法的设计与开发。M相关G蛋白偶联受体-X2（MRGPRX2）是一种重要的受体，可调控肥大细胞的活化，从而影响整体免疫反应。目前已鉴定出多种MRGPRX2的配体，包括内源性肽类如PAMPs、防御素、LL-37以及其他蛋白质片段（如降解的白蛋白）。进一步鉴定MRGPRX2特异性配体需要对大量肽类（如肽库）进行筛选；然而，肥大细胞的培养困难且成本较高 体外 因此，用于筛选大量分子时并不经济。本文介绍了一种利用表达MRGPRX2的HEK细胞设计、构建和筛选小肽分子文库的方法。该细胞系培养相对简便且成本较低，可用于 体外 高通量分析。采用钙离子敏感性荧光染料Fura-2标记细胞内钙离子流变化，以监测细胞活化情况。通过测定Fura-2在激发波长340 nm和380 nm下于510 nm发射波长处的荧光强度比值，计算钙离子浓度。用于验证该系统的多肽文库基于内源性肾上腺髓质素前体N端12肽（PAMP-12）分泌肽构建，该肽已知可高特异性、高亲和力地结合MRGPRX2受体。后续多肽通过在PAMP-12基础上进行氨基酸截短和丙氨酸扫描技术获得。本文所述方法简便、经济，且适用于大规模化合物文库的筛选，可有效鉴定受体活化过程中起关键作用的结合区域及其他重要参数。
引言
肥大细胞是免疫系统的重要组成部分，在先天性和适应性免疫反应中均发挥关键作用。肥大细胞主要通过抗原与免疫球蛋白E（IgE）-FcεRI受体复合物的结合，或通过近年来发现的MAS相关G蛋白偶联受体X2（MRGPRX2）被激活1。MRGPRX2的激活与多种免疫和炎症性疾病相关，因此，了解该受体与其配体之间的结合机制具有重要意义2。为此，研究人员构建了一个小肽分子文库，并将其用于筛选在HEK细胞中过表达的MRGPRX2受体。在该研究中，利用丙氨酸扫描和氨基酸截短这两种简单且通用的技术构建了肽文库。丙氨酸扫描是指将特定氨基酸替换为丙氨酸残基；由于丙氨酸体积小且呈电中性，该替换可消除被替换残基赋予肽链的特定性质，从而依次揭示各氨基酸理化性质在受体相互作用中的重要性。相反，在氨基酸截短中，设计的肽序列会缺失一个或多个N端、C端或两端的氨基酸残基。这一系列肽被用于鉴定对MRGPRX2结合至关重要的氨基酸序列。
人肥大细胞系（LAD-2）的培养经验表明，这些细胞在体外（in vitro）培养和维持较为困难：其倍增时间为两周，培养基添加剂昂贵，且传代过程中需要直接干预3。这些特性使得该细胞不适合用于潜在配体的大规模筛选。本研究中，采用稳定转染表达MRGPRX2受体的HEK细胞（HEK-X2）进行多肽文库的筛选1。HEK-293细胞因其转染效率高、倍增速度快以及培养所需培养基添加剂成本较低，被广泛用于细胞表面受体的异源表达研究4。转染HEK-293细胞系的实验方案已有充分验证并被广泛确立5。稳定表达MRGPRX2受体的HEK-293细胞（第13–19代）被通过N端截短、C端截短、N+C端截短以及丙氨酸扫描所生成的多肽激活1。野生型HEK细胞（HEK-WT）（第16–21代）作为对照。通过检测细胞内钙离子释放情况，研究基于MRGPRX2的细胞激活效应。
MRGPRX2介导的细胞活化随后引发胞质钙离子动员。肥大细胞中这种受调控的细胞内钙释放由钙库操纵性钙离子进入（SOCE）过程调控，该过程由基质相互作用分子1（STIM1）协调，是免疫反应级联的核心环节6,7。目前已有多种方法用于检测细胞内钙离子浓度，包括膜片钳技术和荧光染料法8。在所有可用技术中，荧光钙染料结合不同检测手段的应用尤为广泛9。其中受到广泛关注的两类荧光染料分别为单波长染料（如Fluo-4）和双波长比率型染料（如Indo-1和Fura-2）。与单波长染料相比，双波长比率型染料的优势在于能够校正染料加载不均、光漂白以及聚焦偏差等实验误差10,11。
Fura-2 乙酰甲酯（Fura-2 AM）是一种可穿透细胞膜的绿色荧光染料，其在结合钙离子后激发波长向更短波长偏移。实验中，Fura-2 分别在 340 nm 和 380 nm 波长下激发，而发射光在 510 nm 处检测。如图1所示，当结合钙离子后，340 nm 处的荧光强度增强，而 380 nm 处的荧光强度减弱。数据通常表示为 340 nm 激发后的荧光强度（F340）与 380 nm 激发后的荧光强度（F380）的比值，即 F340/F380。F340/F380 比值与细胞内钙离子浓度成正比，其具体数值可通过 Grynkiewicz 公式12计算得出。由于荧光信号来自染料在两个波长（340 nm 和 380 nm）下的激发，因此荧光信号的比值可校正染料加载量、染料泄漏、光漂白以及细胞密度等实验因素的影响。
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方案
1. 肽库的设计与开发
- 基于已知配体 PAMP-1213 鉴定肥大细胞 MRGPRX2 受体的配体，请遵循以下步骤。
- 通过固相肽合成（SPPS）依次截除已知配体的 N 端氨基酸残基，构建 N 端截短肽文库。
- 通过固相肽合成（SPPS）依次截除已知配体的 C 端氨基酸残基，构建 C 端截短肽文库。
- 根据步骤 1.1.1 和 1.1.2 的结果，分别从 N 端和 C 端截除特定氨基酸残基，利用 SPPS 构建 N+C 双端截短肽文库。
- 采用固相肽合成法合成肽段13。
- 将肽段的 N 端修饰为乙酰基（Ac），C 端修饰为酰胺基团。
- 采用高效液相色谱法（HPLC）检测肽段纯度，采用质谱仪测定其分子质量。
- 为研究母体 PAMP-12 分子中特定氨基酸的重要性，请遵循以下步骤。
- 采用固相肽合成法（SPPS），将肽分子中的各个氨基酸残基依次替换为丙氨酸，构建丙氨酸扫描肽文库。将 N 端修饰为乙酰基（Ac），C 端修饰为酰胺基团。
- 采用高效液相色谱法（HPLC）检测肽段纯度，采用质谱仪测定其分子质量。
注意：确保合成的肽段具有高纯度。采用质谱和 HPLC 对肽段进行表征。
2. 体外 细胞培养
- 按照以下步骤培养 HEK-X2 和 HEK-WT 细胞。
- 通过在高糖 DMEM 培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素，制备培养液。
- 将细胞传代至经组织培养（TC）处理的 T-75 培养瓶中，并在含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中培养，直至细胞融合度达到 75–80%。
- 当细胞融合度达到 75% 时，清洗细胞并加入 2–3 mL 胰蛋白酶，作用 2–3 分钟。随后置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育，使细胞脱落。
- 待细胞脱落后，收集含胰蛋白酶的细胞悬液，加入 6–9 mL 新鲜培养基。
- 以 1620 × g 离心 3–5 分钟。
- 离心后，弃去上清液以收集细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中，并根据所需浓度进行稀释。
注意：HEK 细胞为快速增殖细胞，因此需优化培养基添加剂。HEK 细胞为贴壁细胞，应使用经 TC 处理的培养瓶进行传代以支持其贴附生长。
- 为实验准备 96 孔检测板。
- 每孔加入 200 µL 细胞悬液（浓度为 200,000 个细胞/mL），使每孔接种 40,000 个细胞。
- 将细胞在 37 °C、5% CO2 培养箱中培养 24 小时。
注意：应根据板的规格和细胞株类型优化每孔的细胞密度。实验需设置三个重复，使用底部平坦透明、经 TC 处理的黑色 96 孔板进行。
3. Fura-2 AM 钙离子检测实验
- 按照以下步骤制备染料。
- 使用 Fura-2 AM 染料进行实验。
- 配制含有 25 mM HEPES 缓冲液、120 mM NaCl、5 mM KCl、1 mg/mL 葡萄糖、1 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）以及新鲜添加的 1.8 mM CaCl₂ 的 HEPES-Tyrode 缓冲液（HTB）2 在高压灭菌的水中
- 添加 50 µL DMSO 的 50 µg Fura-2 AM 小瓶，用于配制 1 mM Fura-2 AM 染料储备液。加入 1 µL 每毫升新鲜培养基中加入1 mM Fura-2 AM染料，以制备染料负载培养基 1 µM 染料浓度
- 从培养箱中取出96孔板，弃去培养基，更换为新鲜的染料加载培养基。添加 200 µL 每孔加入染料加载培养基。将细胞在其中孵育30–40分钟 37 °C，5% CO2 培养箱.
- 孵育40分钟后，移除培养基，用HTB缓冲液洗涤细胞。添加 100 µL 用于荧光读数的HTB缓冲液。将该板用于荧光读数。
注意：优化染料加载培养基中染料的浓度。染料可能存在泄漏和光漂白问题。添加 CaCl2 新鲜加入HTB缓冲液中以避免沉淀。
4. 细胞活化与荧光检测
注意：带有自动移液系统的荧光酶标仪可实现化合物从化合物源到检测板的自动转移，而无需将检测板从酶标仪中取出。
- 在细胞孵育的同时，设置酶标仪。
- 将温度设置为 37 °C。
- 在设置中，选择Flex模式。
- 将读数模式设置为荧光和底部读数。
- 在波长设置中，将波长数量设为 2。将激发波长设为 340 nm 和 380 nm，将发射波长设为 510 nm。
- 将灵敏度保持为默认。
- 在时间设置中，将间隔时间设为 3.9 秒，将运行时间设为 94 秒，以获得 25 次读数。
- 接下来，选择检测板类型。
- 接下来，选择待读取孔位。
- 在化合物转移设置中，将转移次数设为 1，将初始体积设为 100 µL。将移液高度设为 100 µL，体积设为 50 µL，时间点设为 36 秒，以便在第 10 次读数时加入化合物。
- 接下来，选择化合物来源板类型。
- 将吹打混匀设置为不使用。
- 在移液头布局中选择相应的移液头。
- 对于化合物和移液头列，确保待转移的化合物位于化合物板的第 1 列。将移液头列和化合物列均设为 1。
- 将自动校准保持为开启状态。
- 点击确定。
- 当温度达到 37 °C 后，将板放入酶标仪中。
- 按下读数室，将检测板放入荧光酶标仪中。
- 按下来源位，放入化合物板。通过向化合物板中加入 200 µL 相应的肽、离子霉素以及乙二醇双(β-氨基乙醚)四乙酸（EGTA）-Triton X-100 溶液来准备化合物板。
- 按下移液头架，放入移液头盒。使用黑色移液头以避免移液头自身产生荧光干扰。
- 板加载完成后，检查软件设置并点击开始读数。
5. 数据分析
- 根据 Grynkiewicz 公式，通过荧光比值确定钙离子浓度 -
其中，Kd 为 Fura-2 AM 的解离常数，R 为在 340 nm 和 380 nm 激发下（F340/F380）相应肽段的发射比值，Rmax 为加入 50 µL 30 µM 离子霉素后观察到的最大荧光比值，Rmin 为加入 50 µL 100 mM EGTA/2.5% Triton X-100 后观察到的最小荧光比值，F380min 和 F380max 分别为无钙和钙结合状态下 Fura-2 AM 的绝对荧光强度。
注意：仪器加液时具有一定冲击力。肽段加样高度不宜过于接近孔板底部，以免细胞脱落。使用黑色吸头以避免自发荧光。每次实验需读取每块板的最大和最小荧光值。
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结果
表1 包含通过末端氨基酸截短和丙氨酸扫描生成的肽段序列。如图所示 表1肽序列RKKWNKWALSR相较于其母体PAMP-12缺失了N末端的苯丙氨酸（F），因此代表了源自PAMP-12的N端截短肽文库。类似地，FRKKWNKWALS缺失了PAMP-12 C末端的丝氨酸，代表了源自PAMP-12的C端截短肽文库。在N端和C端双截短肽文库中，N端和C端的氨基酸均被去除。从PAMP-12的N端截去4个氨基酸、C端截去1个氨基酸后得到序列WNKWALS。丙氨酸扫描衍生的肽文库中，每个肽有一个氨基酸被丙氨酸取代，例如ARKKWNKWALSR，其中N末端的苯丙氨酸被丙氨酸取代。采用Fura-2 AM染料检测各肽对转染MRGPRX2的HEK细胞的激活潜力。1数据在荧光酶标仪上记录。如果肽配体激活了细胞，则在340 nm波长激发的荧光（F340）增强，而在380 nm波长激发的荧光（F380）则降低。图1a）。然而，对于空白对照（或非激活肽或HEK-WT对照），其相对增加和减少则分...
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讨论
钙信号在肥大细胞脱颗粒过程中起核心作用，已被广泛用于受体-配体相互作用、配体鉴定及药物发现的研究14。MRGPRX2 是一种新近发现的肥大细胞受体，已被证实参与多种炎症性疾病，如瘙痒、哮喘和特应性皮炎等2。此外，多种已获批药物被发现可通过 MRGPRX2 受体引发炎症反应15。因此，研究配体-受体相互作用、鉴定新配体并阐明其激活机制至关重要。本研究展示了常用肽类技术在设计肽库（表1）以及研究基于 MRGPRX2 的肥大细胞激活中的应用。实验以钙离子动员作为肥大细胞激活的检测指标。
Fura-2 是一种钙离子敏感性染料，用于测定细胞内钙离子浓度。其乙酰氧基甲酯衍生物（Fura-2 AM）可提高细胞膜通透性，从而提供一种简便的方法来定量检测胞浆钙离子的释放。该染料已广泛应用于多种表征技术，如流式细胞仪、显微镜和荧光分光光度计9,
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
SR 和 LDU 感谢阿尔伯塔创新战略研究项目、加拿大国家研究委员会（NRC）以及加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金（NSERC-Discovery grant）对本项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | 5470 | |
| 氯化钙 | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 孔板 | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| 黑色聚苯乙烯微孔板 | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | 高葡萄糖 |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | 无菌，生物级 |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| 葡萄糖 | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES 缓冲液 | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| 离子霉素 | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fischer | 15140122 | |
| 多肽 | RS Syntehsis | 定制 | ≥95% 纯度； N 末端 - 乙酰基团 C 末端 - 酰胺基团 |
| 氯化钾 | Sigma Aldrich | 12636 | |
| 氯化钠 | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Triton X-100 | DOW Chemical | 166704 |
参考文献
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