利用基因工程HEK细胞筛选激活MRGPRX2的多肽

摘要

介绍了生成可经由MRGPRX2受体激活肥大细胞的短肽文库的技术。相关技术操作简便、成本低廉，且可拓展应用于其他细胞受体。

摘要

识别针对具有治疗意义的细胞受体的特异性配体对于多种应用至关重要，包括新疗法的设计与开发。M相关G蛋白偶联受体-X2（MRGPRX2）是一种重要的受体，可调控肥大细胞的活化，从而影响整体免疫反应。目前已鉴定出多种MRGPRX2的配体，包括内源性肽类如PAMPs、防御素、LL-37以及其他蛋白质片段（如降解的白蛋白）。进一步鉴定MRGPRX2特异性配体需要对大量肽类（如肽库）进行筛选；然而，肥大细胞的培养困难且成本较高 体外 因此，用于筛选大量分子时并不经济。本文介绍了一种利用表达MRGPRX2的HEK细胞设计、构建和筛选小肽分子文库的方法。该细胞系培养相对简便且成本较低，可用于 体外 高通量分析。采用钙离子敏感性荧光染料Fura-2标记细胞内钙离子流变化，以监测细胞活化情况。通过测定Fura-2在激发波长340 nm和380 nm下于510 nm发射波长处的荧光强度比值，计算钙离子浓度。用于验证该系统的多肽文库基于内源性肾上腺髓质素前体N端12肽（PAMP-12）分泌肽构建，该肽已知可高特异性、高亲和力地结合MRGPRX2受体。后续多肽通过在PAMP-12基础上进行氨基酸截短和丙氨酸扫描技术获得。本文所述方法简便、经济，且适用于大规模化合物文库的筛选，可有效鉴定受体活化过程中起关键作用的结合区域及其他重要参数。

引言

肥大细胞是免疫系统的重要组成部分，在先天性和适应性免疫反应中均发挥关键作用。肥大细胞主要通过抗原与免疫球蛋白E（IgE）-FcεRI受体复合物的结合，或通过近年来发现的MAS相关G蛋白偶联受体X2（MRGPRX2）被激活¹。MRGPRX2的激活与多种免疫和炎症性疾病相关，因此，了解该受体与其配体之间的结合机制具有重要意义²。为此，研究人员构建了一个小肽分子文库，并将其用于筛选在HEK细胞中过表达的MRGPRX2受体。在该研究中，利用丙氨酸扫描和氨基酸截短这两种简单且通用的技术构建了肽文库。丙氨酸扫描是指将特定氨基酸替换为丙氨酸残基；由于丙氨酸体积小且呈电中性，该替换可消除被替换残基赋予肽链的特定性质，从而依次揭示各氨基酸理化性质在受体相互作用中的重要性。相反，在氨基酸截短中，设计的肽序列会缺失一个或多个N端、C端或两端的氨基酸残基。这一系列肽被用于鉴定对MRGPRX2结合至关重要的氨基酸序列。

人肥大细胞系（LAD-2）的培养经验表明，这些细胞在体外（in vitro）培养和维持较为困难：其倍增时间为两周，培养基添加剂昂贵，且传代过程中需要直接干预³。这些特性使得该细胞不适合用于潜在配体的大规模筛选。本研究中，采用稳定转染表达MRGPRX2受体的HEK细胞（HEK-X2）进行多肽文库的筛选

方案

1. 肽库的设计与开发

1. 基于已知配体 PAMP-12¹³ 鉴定肥大细胞 MRGPRX2 受体的配体，请遵循以下步骤。
   1. 通过固相肽合成（SPPS）依次截除已知配体的 N 端氨基酸残基，构建 N 端截短肽文库。
   2. 通过固相肽合成（SPPS）依次截除已知配体的 C 端氨基酸残基，构建 C 端截短肽文库。
   3. 根据步骤 1.1.1 和 1.1.2 的结果，分别从 N 端和 C 端截除特定氨基酸残基，利用 SPPS 构建 N+C 双端截短肽文库。
   4. 采用固相肽合成法合成肽段¹³。
   5. 将肽段的 N 端修饰为乙酰基（Ac），C 端修饰为酰胺基团。
   6. 采用高效液相色谱法（HPLC）检测肽段纯度，采用质谱仪测定其分子质量。
2. 为研究母体 PAMP-12 分子中特定氨基酸的重要性，请遵循以下步骤。
   1. 采用固相肽合成法（SPPS），将肽分子中的各个氨基酸残基依次替换为丙氨酸，构建丙氨酸扫描肽文库。将 N 端修饰为乙酰基（Ac），C 端修饰为酰胺基团。
   2. 采用高效液相色谱法（HPLC）检测肽段纯度，采用质谱仪测定其分子质量。
      注意：确保合成的肽段具有高纯度。采用质谱和 HPLC 对肽段....

结果

表1 包含通过末端氨基酸截短和丙氨酸扫描生成的肽段序列。如图所示 表1肽序列RKKWNKWALSR相较于其母体PAMP-12缺失了N末端的苯丙氨酸（F），因此代表了源自PAMP-12的N端截短肽文库。类似地，FRKKWNKWALS缺失了PAMP-12 C末端的丝氨酸，代表了源自PAMP-12的C端截短肽文库。在N端和C端双截短肽文库中，N端和C端的氨基酸均被去除。从PAMP-12的N端截去4个氨基酸、C端截去1个氨基酸后得到序列WNKWALS。丙氨酸扫描衍生的肽文库中，每个肽有一个氨基酸被丙氨酸取代，例如ARKKWNKWALSR，其中N末端的苯丙氨酸被丙氨酸取代。采用Fura-2 AM染料检测各肽对转染MRGPRX2的HEK细胞的激活潜力。¹数据在荧光酶标仪上记录。如果肽配体激活了细胞，则在340 nm波长激发的荧光（F340）增强，而在380 nm波长激发的荧光（F380）则降低。图1a）。然而，对于空白对照（或非激活肽或HEK-WT对照），其相对增加和减少则分.......

讨论

钙信号在肥大细胞脱颗粒过程中起核心作用，已被广泛用于受体-配体相互作用、配体鉴定及药物发现的研究¹⁴。MRGPRX2 是一种新近发现的肥大细胞受体，已被证实参与多种炎症性疾病，如瘙痒、哮喘和特应性皮炎等²。此外，多种已获批药物被发现可通过 MRGPRX2 受体引发炎症反应¹⁵。因此，研究配体-受体相互作用、鉴定新配体并阐明其激活机制至关重要。本研究展示了常用肽类技术在设计肽库（表1）以及研究基于 MRGPRX2 的肥大细胞激活中的应用。实验以钙离子动员作为肥大细胞激活的检测指标。

Fura-2 是一种钙离子敏感性染料，用于测定细胞内钙离子浓度。其乙酰氧基甲酯衍生物（Fura-2 AM）可提高细胞膜通透性，从而提供一种简便的方法来定量检测胞浆钙离子的释放。该染料已广泛应用于多种表征技术，如流式细胞仪、显微镜和荧光分光光度计^9,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	5470
氯化钙	Sigma Aldrich	793939
Corning 96 孔板	Sigma Aldrich	CLS3603
黑色聚苯乙烯微孔板	Sigma Aldrich	CLS3603
DMEM	Thermo Fischer	11995065	高葡萄糖
DMSO	Thermo Fischer	D12345	无菌，生物级
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
胎牛血清	Thermo Fischer	12483-020
Flexstation 3	Molecular devices	FV06060
Fura-2 AM	Thermo Fischer	F1221
葡萄糖	Sigma Aldrich	D8270
HEPES 缓冲液	Thermo Fischer	15630-080
离子霉素	Sigma Aldrich	I9657
L-谷氨酰胺	Thermo Fischer	25030-081
青霉素-链霉素	Thermo Fischer	15140122
多肽	RS Syntehsis	定制	≥95% 纯度； N 末端 - 乙酰基团 C 末端 - 酰胺基团
氯化钾	Sigma Aldrich	12636
氯化钠	Sigma Aldrich	S9888
Triton X-100	DOW Chemical	166704