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方法文章

蚯蚓，Lumbricus terrestris：一种新型的体内微注射血管系统无脊椎动物模型

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DOI：

10.3791/62449

⸱

2021年4月1日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bioinnovation PhD Program, Tulane University, 2Biology Department, Virginia Commonwealth University, 3Mechanical Engineering Department, Montgomery College, 4Biomedical Engineering Department, Tulane University, 5US Food and Drug Administration

本文内容

摘要

蚯蚓是一种用于血管研究的新型无脊椎动物体内台式模型。本文介绍了可在蚯蚓血管系统中高效进行手术和显微注射的技术与设备，详细描述了手术操作流程、显微注射技术以及定制微移液管的制备方法。

摘要

尽管脊椎动物在生物医学研究中不可或缺，但相关研究常受到成本、漫长的内部审查以及伦理考量等因素的限制。本文提出蚯蚓作为一种低成本、适用于某些初步血管研究的无脊椎动物替代模型。由于蚯蚓的背血管、腹血管以及五对假心脏易于进行手术操作，因此该模型获取方便、维护成本低，且仅需给予少量待测化合物。蚯蚓模型具有一个结构简单的闭合式循环系统，其血红蛋白结构与人类血液相似。本文提供了一套麻醉蚯蚓并实施手术切口以暴露相关血管的操作方案。用于化合物给药的微移液管通过使用拉针仪加热并拉伸玻璃毛细管，并结合斜面打磨系统制备成微米级精细针尖。随后，利用显微操作仪和微量注射器，可将任意化合物重复注入蚯蚓的循环系统，实现大样本量实验的同时仅消耗极小剂量的化合物。文中详细阐述了注射操作过程中的各项技术细节。蚯蚓血管尺寸较小，尤其是腹血管操作难度较大；然而，掌握本文所述技术后可实现高度可重复的操作，且成本低廉，使大规模样本研究成为可能。

引言

蚯蚓已被用作多种科学研究中的重要生物指示剂和生物测定工具1,2,3,4,5,6；它是评估陆地环境中危险和有毒废物对生物风险的理想生物，适用于原位和生物富集研究，例如土壤中的杀生物剂（杀虫剂）及其不利的生态毒理学效应7,8,9,10。此外，由于生物勘探的发展，蚯蚓也成为纤溶、抗凝、抗菌和抗癌分子的替代来源11,12；例如，1991年有一研究团队从蚯蚓皮肤中提取并纯化了蚓激酶，并将其施用于SHN小鼠的乳腺肿瘤，结果导致肿瘤生长受到抑制13。蚯蚓还是一种具有教学价值的动物模型，可用于向学生介绍手术操作以及标本解剖结构的学习，涵盖从血液循环到电生理学的研究14,15。

在我们自己的研究中，我们考察了活体蚯蚓血管对高强度超声的反应18。我们发现，蚯蚓血管破裂发生的条件与我们此前在人体微血管破裂损伤中所观察到的条件相似。目前我们正在进行的研究包括将微泡注入蚯蚓的血管系统。微泡由被脂质、白蛋白或聚合物外壳包裹的重气体构成，这类试剂既可用作成像对比剂，也可作为靶向药物递送的载体。

本项新方案适用于任何可利用蚯蚓天然生物指示剂进行静脉（IV）注射化合物的研究。该方法基于对多个可能的注射位点进行静脉显微注射，包括蚯蚓的五对假心脏、背血管以及腹血管中的任意一处。该操作需通过复杂的外科切口暴露血管，随后使用显微定位仪控制注射过程。实验采用专为蚯蚓血管显微注射定制的微玻璃毛细管完成，此类毛细管可精确靶向直径低至90 µm的腹血管。

本方案旨在改进早期的微量移液技术，包括1948年一项关于蚯蚓血液和尿液提取的研究16。如图S1所示，该提取装置的操作较为困难，正如作者所述，可能需要长达一小时甚至更久。1970年开发了一种类似方法，但作者在向蚯蚓的巨大纤维中注射液体时，多次遇到移液尖端断裂的问题17。而在下文所述的本方法中，血液提取仅需数秒至数分钟即可完成，且同样适用于化合物注射和蚯蚓体液提取。在本具体案例中，我们注射了造影剂——微泡。

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方案

1. 微量移液器制备：拉制玻璃毛细管并修整尖端

  1. 微移液管拉制
    1. 打开微移液管拉制仪，选择一个程序以输入用于蚯蚓显微注射的具体参数。
    2. 将参数设置为：气压（Pressure）=500，拉力（Pull）=75，时间（Time）=250，加热（Heat）=336，速度（Velocity）=70。不同拉制仪的结果可能存在差异，因此需通过实验调整参数，以获得理想的尖端（尺寸、锐度、形状等）。
    3. 在拉制前务必进行RAMP测试以确定微移液管的加热值，否则 可能导致槽内灯丝烧毁或玻璃管破裂。
    4. 如果需要更改气压，请按下清除按钮，在询问是否清除所有数值时选择“否（0）”，然后选择更改气压（2）。此过程可能因拉制仪型号而异，因此请查阅仪器说明书以更改气压设置。
    5. 打开微移液管拉制仪盖子，将一根微移液管装入拉制仪中。所使用的微移液管玻璃为含细丝的硼硅酸盐玻璃：长度10 cm，外径1.5 mm，内径0.86 mm。
    6. 从右侧沿切口将移液管滑入V型槽，直至移液管末端与移液管夹持器末端对齐。为确保移液管能穿过灯丝到达对面，应尽可能将其推到底，同时确保其始终稳定地放置在切口上。
    7. 通过拧紧右侧旋钮固定移液管，并将锁定系统连同移液管一起滑动，使其穿过灯丝到达拉制仪另一侧。最后将移液管左侧固定在拉制仪上。移液管应位于灯丝正中央；请参阅说明书了解如何正确对齐移液管。
    8. 移液管装载完成后，关闭拉制仪盖子，按下“拉制”按钮，等待拉制完成后再取出两根生成的移液管。
    9. 松开旋钮以取出移液管，并在从切口中取出时小心避免碰撞导致移液管断裂。
    10. 将拉制好的微移液管放置在微移液管支架或其他支撑装置上，以固定移液管并允许其轻松旋转而不致断裂。我们已自行设计了一种微移液管支架，可在机加工车间制作或使用3D打印技术制造。
      注：此处可暂停本实验方案。
    11. 将微移液管支架置于显微镜下，使用相机软件或类似软件拍摄拉制后微移液管的图像，并在距尖端约1000 mm和50 mm处使用10倍放大倍数测量尖端直径。
    12. 在拍摄图像前，确保相机设置与显微镜设置（10倍）一致，以便准确测量，特别是用于后期图像分析时。10倍设置位于屏幕顶部附近的水平工具栏中。
    13. 要查看并拍摄微移液管图像，请在屏幕左上角的相机软件中选择相机图标，聚焦尖端后点击“Snap”按钮以获取准确读数。“Snap”按钮位于页面左侧相机标签下方的水平工具栏中。
    14. 测量拉制后的微移液管，以判断是否达到了理想的尖端尺寸和一致性。拉制最多5根移液管足以评估拉制仪及其参数是否能稳定产生所需尺寸。若未达到理想尖端尺寸，或每根移液管的尺寸持续变化，研究人员可能需要尝试不同设置直至达到理想尺寸，或可能需要调整灯丝和移液管的位置，这可能需要参考移液管拉制仪说明书。
      注：此处可暂停本实验方案。
  2. 准备微移液管斜面修整及使用电极阻抗仪
    1. 为修整拉制后的微移液管尖端，使用配备电极阻抗仪和40倍体视显微镜的微移液管斜面修整仪。
      ​注：也可使用其他类型的斜面修整仪；即使是自制修整仪也能成功实现，且可通过不同显微镜配置观察修整过程，包括在显微镜上安装相机。
    2. 将底座/研磨板组件装配好，将细磨板置于两个黑色夹持器之间。
    3. 将底板放置好，磁铁面朝远离板的方向。
    4. 将三个部件拧紧在一起：（1）上部固定环，（2）细磨板，（3）下部固定环（带磁性）。识别研磨板的磨料表面；对于细磨板，其为紫色，应朝上放置，以便玻璃与石英光学平面接触。
    5. 在斜面修整仪的石英光学平面上滴加五滴斜面修整底座油，或根据需要添加足够数量的油，然后将组装好的研磨板放在上面。该油可全天使用，但如果研磨板出现卡顿或不应转动时停止旋转，则可能需要重新加油。
    6. 手动旋转研磨板数次以均匀分布润滑油，然后开启仪器电源。
    7. 设置阻抗仪时，将生理盐水（0.9% NaCl）滴加到灯芯（即参考导线）上，并将灯芯放置在斜面修整板上。浸湿灯芯以与微移液管形成电路，并用一层薄薄的生理盐水溶液覆盖修整板。
    8. 将导线段连接到连接阻抗仪的导线末端。
    9. 将阻抗仪上的"on"开关打开，并保持在"stand-by"模式，直到准备开始修整。由于我们要制造较大的开口，因此在准备修整时将电极阻抗仪设置为x0.1档位。
  3. 装载微移液管并进行斜面修整
    1. 将微移液管装载到位于操纵器上的移液管夹具中，并拧紧旋钮以固定其位置，以便进行斜面修整。
    2. 从微移液管后端注入生理盐水，充满整个移液管，并将导线插入微移液管中，确保管内无气泡。已发现微移液管中存在气泡会导致测量结果不稳定。
    3. 通过将阻抗仪从"stand-by"切换至"x0.1"来开启阻抗仪。初始电阻应为100 MΩ，当微移液管尖端接触生理盐水时，读数应发生变化。
    4. 为获得正确的尖端开口尺寸，在降低微移液管之前，应在操纵器上将角度调整至35°，以实现一致的斜面修整效果。30°角度也足够，但在两者之间，35°的标准偏差更低，因此斜面修整更一致且尖端更不易断裂。
    5. 使用操纵器将微移液管尖端定位在研磨板旋转中心约三分之二的位置。
    6. 使用粗调旋钮将微移液管缓慢降低至接近研磨板，使尖端接近生理盐水溶液。若无相机可用，则必须通过显微镜观察尖端的修整过程。
    7. 当微移液管尖端接触生理盐水时，阻抗仪读数应从100 MΩ下降至80至20 MΩ之间的某个值。该数值会因拉制玻璃的开口大小而有所不同。
    8. 此时，从粗调旋钮切换至微调旋钮，更缓慢地下降移液管，以避免尖端撞击研磨板而断裂。在此阶段的斜面修整过程中，同时监测阻抗仪读数和尖端状态至关重要。
    9. 修整过程中，观察尖端尺寸的变化，并利用照明条件帮助获得良好的观察视角。
      注：修整过程中尖端会变得极为光亮，且开口会逐渐增大。此阶段必须使用操纵器上的微调旋钮缓慢升降微移液管。一旦将微移液管从研磨板抬起后再重新放下，可能导致尖端断裂。
    10. 继续缓慢降低尖端直至接触斜面修整板，并缓慢修整，直到电阻降至约20 MΩ。掌握此过程需要较强的学习曲线，需多次练习才能稳定地完成尖端修整。
    11. 当电阻达到20 MΩ时，将微移液管从斜面修整仪中抬起。
    12. 从微移液管中取出导线，并将其从斜面修整仪上卸下。若长时间留在修整仪上，微移液管可能断裂或尖端开口进一步扩大；因此，在修整过程中必须持续监控仪表读数和尖端状态。
      ​注：此处可暂停本实验方案。
    13. 将修整后的微移液管放回微移液管支架上，使用显微镜软件的10倍物镜测量尖端开口尺寸。测量10个尖端的样本量足以检查所有修整尖端的一致性。
    14. 在拍摄图像前，确认显微镜设置（10倍）与相机设置一致。在测量尖端开口后，可剔除异常值。
    15. 关闭斜面修整仪时，将驱动皮带电机和阻抗仪上的开关均转至"off"位置。
    16. 拧开底座/研磨板组件以卸下上部固定环。切勿在组件仍相互连接时直接提起底座/研磨板，否则可能因真空效应导致破裂。
    17. 在拧下带螺丝的连接件上部固定环后，滑出细磨板，再提起最后一个磁性连接件将其取下。使用实验室擦拭纸清除石英光学平面上多余的油。
    18. 用去离子水（DI水）清洗所有三个组件，并用纸巾轻轻擦干，以防止盐晶体形成。长时间使用后，旋转磁性底座可能出现卡顿现象。若发生此情况，可在驱动皮带上喷少量去离子水以清除结晶盐。
    19. 擦拭研磨板背面以及石英光学平面上的多余油渍。
    20. 使用去离子水清洁斜面修整平台，清除仪器上可能残留的多余生理盐水，防止结晶。
    21. 用去离子水冲洗修整后的尖端。若不清洗，尖端会结晶，但之后仍可用去离子水轻松洗去。
    22. 在培养皿内铺上黏土，并用盖玻片覆盖以防止微移液管受到污染。
    23. 在黏土上制作凹槽以固定微移液管。当准备使用时，修整后的尖端即可用于回填感兴趣的化合物，并注入蚯蚓的血管系统中。在本实验方案示例中，使用了对比剂微泡作为感兴趣的化合物。
      ​注：此处可暂停本实验方案。

2. 使用斜面尖端进行显微注射器校准

  1. 准备一块疏水涂层板。
    1. 前一天，将两块板用疏水涂层处理表面，使其过夜固化。该化学试剂可来自市售材料或实验室自备材料（如有），且至少需要12小时的固化时间。
    2. 涂层处理是一个快速的两步过程：先喷涂底漆，再喷涂面漆。
    3. 在通风橱或开放空间中，用力摇动底漆罐，待混合钢珠晃动约一分钟后，将底漆均匀喷洒在板上。
    4. 将底漆均匀喷涂于平板表面，喷枪与表面距离保持在约15至30厘米，喷涂时采用轻扫方式，先从右至左，再从上至下进行多次薄层覆盖。喷涂过程中持续摇动喷罐，确保涂层均匀，避免过度喷涂，以免影响产品性能。
    5. 等待1-2分钟后再涂第二层底漆。虽然此步骤并非必需，但可根据需要选择是否追加涂布。
    6. 等待底漆干燥30分钟。
    7. 重复步骤 2.1.3 - 2.1.5 用于顶涂层。
    8. 待培养板室温固化过夜或至少12小时后，即可加入矿物油。将矿物油加至培养板约一半高度。
    9. 将含有矿物油的培养皿放置到显微注射仪载物台上。
  2. 将斜面针头安装到显微注射仪上。
    1. 将显微注射仪直接连接至实验室的压缩空气接口。该系统可使用压缩氮气瓶和压力调节器，但需注意其他显微注射系统可能需要不同的接口。
    2. 打开压缩空气，将低压气路调节器调至70 PSI，然后开启显微注射仪。切勿超过80 PSI，因为系统无法承受超过80 PSI的压力。
    3. 使用带金属接头针头的1 mL注射器用水回填吸头。如果移液管的内径不同，则需要使用不同规格的金属针头以适配。
    4. 注水后，将微量移液器安装到操纵杆显微操作仪的持针器上。可使用不同的显微注射仪和显微操作仪。
  3. 使用水泡校准斜面微量移液器的分配体积。
    ​注意：在将任何化合物注入蚯蚓血管系统之前，必须校准微量注射器以确定合适的注射体积。
    1. 将显微注射仪的参数设置为压力4 PSI、时间0.5秒。超过这些参数会导致血管尺寸变形，通常不理想，除非研究人员旨在研究血管扩张。
    2. 将移液器吸头缓慢下放至接近孔板底部，但需小心避免吸头在孔板底部折断。吸头在矿物油中的位置越低，吸头表面的油黏性越大，可能导致吸头破损。
    3. 从培养板的边缘开始，以便在校准过程中充分利用整个培养板。
    4. 一旦到位，踩下踏板，将水滴注入油中形成水泡。
    5. 气泡可能残留在吸头末端。为解决此问题，应迅速将培养板朝气泡相反方向移动，使气泡脱离移液吸头。
    6. 使用相机软件测量气泡尺寸并计算其体积。若无相机软件，可使用其他替代软件。
    7. 创建10个气泡，测量平均气泡直径，以确定微量移液器向蚯蚓血管系统输送的准确体积。
      ​注意：如果研究人员感兴趣于 通过调节压力和时间参数，可分配多种体积；重复步骤 2.3.1 - 2.3.7。

3. 蚯蚓手术准备以暴露特定的蚯蚓血管系统

  1. 蚯蚓准备与测量
    1. 配制10%乙醇溶液，用于手术前麻醉蚯蚓。
    2. 实验间歇期间，将蚯蚓保存在含有土壤的100 mL烧杯中。
    3. 每次烧杯中仅保留5–10条蚯蚓，以防止蚯蚓因从4 °C冰箱突然转移到25 °C实验台而迅速失水干燥。
    4. 将蚯蚓置于10%乙醇溶液中30分钟。若30分钟后蚯蚓仍有活动，可额外延长5分钟。
      ​注意：有时因蚯蚓体型较大，所需麻醉时间更长；因此，乙醇处理时间可根据蚯蚓大小适当调整，但 不得超过一小时。超过一小时将对蚯蚓造成伤害。
    5. 用自来水冲洗蚯蚓，以去除其体表分泌的黏液及残留乙醇。
    6. 将蚯蚓置于纸巾上，吸去多余水分。
    7. 蚯蚓麻醉后，记录每条蚯蚓的体重（g）、宽度（mm）、长度（mm）以及血管宽度（µm）。所有测量应在未进行任何切口且未拉伸蚯蚓的前提下完成。
    8. 当血管在显微镜下被手术暴露后，使用相机软件测量血管宽度。若无相机软件，可使用不锈钢微型刻度尺，但其精度低于数字软件测量。
      注意：根据目标血管的不同，请跳转至第3.2步（腹血管）、3.3步（背血管）、3.4步（心脏顶视图）或3.5步（心脏侧视图）。
  2. 暴露蚯蚓血管系统：腹血管（方法1）
    1. 手术过程中使用橡胶垫固定蚯蚓，以便研究人员观察目标血管。蚯蚓皮肤较暗的一面应朝下放置。
    2. 为进行手术切开，将蚯蚓背侧朝上放置（即较暗的一侧朝上），用刀片在其体壁上做一个约1 mm的小切口。该小切口便于后续使用手术剪进行长切口操作。
    3. 将蚯蚓皮肤以33 mm间距固定，形成27 mm的开口以暴露血管，仅使用四枚大头针即可充分暴露血管区域。固定后可根据需要增补或移动大头针，以更好地操控蚯蚓皮肤。
    4. 使用手术剪沿身体一侧剪至对侧固定点。操作时应向上轻推皮肤，避免损伤蚯蚓内部结构，如血管或肠道。
    5. 完成切口后，在初始切口处及切口末端重新固定或补加大头针。
    6. 使用两把手术器械（手术镊）牵拉皮肤，以暴露蚯蚓内部结构。
    7. 随着皮肤被牵开，依次在底部固定皮肤；向上操作时，小心分离皮肤与内部器官。到达顶端后，插入最后一枚大头针。
    8. 若血管仍未充分暴露，可轻拉蚯蚓皮肤两侧，以分离其弹性组织，进一步暴露腹血管并扩大皮肤开口。
      注意：此操作会移除部分固定内脏的组织。操作需谨慎，以免意外破裂蚯蚓血管。此时腹血管应已暴露，神经索可作为血管定位标志，因其紧贴皮肤并平行于腹血管走行。若腹血管靠近肠道，可通过牵拉皮肤进一步暴露血管；否则可将肠道推向一侧，但可能导致操作区域杂乱。
  3. 暴露蚯蚓血管系统：背血管（方法2）
    ​注意：暴露背血管的步骤与暴露腹血管类似。
    1. 重复第3.2节中的步骤3.2.1–3.2.3。本步骤中蚯蚓皮肤较暗的一面应朝上。
    2. 使用手术剪从一侧向蚯蚓体中部剪至对侧。
    3. 从蚯蚓体中部开始，沿前向（头部方向）做切口至蚯蚓前端。操作时应向上轻推皮肤，避免损伤内部结构，如血管或肠道。
    4. 完成斜向切口后，在初始切口处及切口末端重新固定或补加大头针。
    5. 重复第3.2节中的步骤3.2.6–3.2.9。
      ​注意：此时背血管应已暴露。
  4. 暴露蚯蚓血管系统：心脏顶视图（方法3）
    1. 手术过程中使用橡胶垫固定蚯蚓，以便研究人员观察目标血管。
    2. 为进行手术暴露，将蚯蚓腹侧朝上放置（即较亮的一侧朝上）。皮肤较暗的一面应朝上。
    3. 使用四枚大头针固定蚯蚓皮肤，形成观察窗以暴露目标心脏。可额外使用一枚大头针（共五枚），固定蚯蚓头部前端。
    4. 从下至上开始固定蚯蚓，先固定右侧，再固定左侧。在靠近头部前端的位置插入两枚大头针，在靠近环带处插入两枚。
    5. 使用刀片在蚯蚓体侧做约1 mm的小切口。
    6. 使用手术剪从一侧向蚯蚓体中部剪至对侧。
    7. 从蚯蚓体中部开始，向前剪至蚯蚓口部（前端）。
      ​注意：剪刀应紧贴皮肤向上抬起，避免剪断血管；剪刀刀刃在穿过皮肤时应可见。切口必须延伸至蚯蚓前端，以获得更好的心脏视野。
    8. 固定后若皮肤向内卷曲，应重新调整大头针位置。
    9. 轻拉皮肤，以充分分离组织，彻底暴露心脏。
    10. 若心脏未暴露，可移动白色精囊，因心脏有时隐藏于其下方。
      ​注意：心脏暴露程度因蚯蚓个体而异，可能观察到全部10个心脏，也可能仅见一半。此时研究人员需判断是否需要移动器官和组织以定位心脏。
  5. 暴露蚯蚓血管系统：心脏侧视图（方法4）
    1. 手术过程中使用橡胶垫固定蚯蚓，以便研究人员观察目标血管。
    2. 为进行手术暴露，将蚯蚓侧放。此时蚯蚓的亮面与暗面均应可见。
    3. 重复第3.4节中的步骤3.4.3–3.4.9。
    4. 若心脏未暴露，可移动白色精囊，因心脏有时隐藏于其下方。
      ​注意：心脏暴露程度因蚯蚓个体而异，可能观察到全部5个心脏，也可能更少。此时研究人员需判断是否需要移动器官和组织以定位心脏。

4. 化合物给药至蚯蚓血管系统

  1. 准备蚯蚓以进行化合物给药
    注意：在这些特定步骤中，我们将造影剂（微泡）注入蚯蚓的血管系统，作为目标化合物。
    1. 在显微注射前，将蚯蚓放置在显微注射台上，并使用实验室擦拭纸清除目标血管周围的液体，从而暴露血管以便注射。
      注意：请勿施加过大的压力，否则会导致血管出血。
    2. 将目标血管与微移液管对齐，注射时务必使腹侧血管对齐。如果目标是心脏，则其方向必须与微移液管垂直。
    3. 将显微镜聚焦于目标血管，并开始降低微移液管至血管位置。在移动任何操纵杆之前，请确认所有操纵杆均已归零至0 mm，以确保最佳操作灵活性。
    4. 当微移液管尖端接触蚯蚓血管时，应确保血管与微移液管之间的角度小于15°。
    5. 一旦微移液管开始对血管施加压力，由于血管受压，血液会从尖端处移开。这是注射位置正确的良好指示。
    6. 为确保成功注射，使用操纵杆将微移液管向前推进，使其与血管接触。
      ​注意：切勿刺破血管。应注意观察，微移液管移动时，背侧和腹侧血管应随其移动方向被推动；随后应使用粗调旋钮进一步向前推进微移液管尖端，使其完全穿透进入血管。若载物台可移动，也可利用载物台移动并刺入血管，而非仅依赖微控制器或同时使用所有控制方式。血管不会立即被穿透，但血管的回弹现象是微移液管正确穿透的标志。一旦尖端穿透血管，血管应保持平直并与微移液管对齐。若未达到此状态，则应使用精细控制缓慢回撤微移液管。
    7. 踩下脚踏板，向蚯蚓的血管系统注入物质。踩下脚踏板后，血液被稀释是另一个表明成功穿透的指标。
    8. 缓慢回撤微移液管，并将其从血管中抽出。
      注意：另一种有效方法是在微移液管仍处于血管内时将其尖端折断，以避免血液流失。

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结果

以下代表性结果基于一组特定参数，包括用于拉制玻璃移液管的设置、由给定斜面角度形成的移液管开口尺寸，以及显微注射的压力和时间。图1展示了从开始到结束整个流程的示意图。

根据所选的拉针仪参数，拉制后将得到如下所述的尖端（图2）。需要注意的是，RAMP值可能会因玻璃管类型甚至灯丝放置位置的不同而发生变化。如果参数合适，所获得的尖端将较为坚固，并具有适合斜面打磨的长锥形。如果尖端在拉制过程中断裂，则必须重新调整拉针仪的参数。

为了确定微移液管斜面的最佳角度、评估斜面加工的难易程度以及研究角度对尖端开口大小的影响，共测试了六种斜面角度。根据我们的斜面标准，最佳角度确定为35°，因为该角度可提供锋利的尖端，且强度足以穿透血管而不发生断裂，同时具有高度可重复性。通常情况下，角度越小，尖端越锋利，如图3所示。另一个值得关注的角度是30°，其尖端更锋利，但最终选择35...

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讨论

当蚯蚓置于10%乙醇中时，尤其是较年老的个体，若暴露时间超过30分钟，可能会产生不良影响；其肠道将开始退化，当进行手术解剖时，内部肠道会散开。因此，建议使用年轻至中龄的蚯蚓。在切开蚯蚓体壁的过程中，必须避免完成整圈的剪刀剪切动作，即操作者应仅剪开一半，然后持续向前推进剪刀直至达到终点。固定蚯蚓时，需注意不要过度拉伸或用力过猛，否则可能导致血管破裂并引起出血。每次注射后，应检查微量移液器是否堵塞，可通过排出移液器内部可能残留的液体来进行判断，尤其在进行下一次注射前应清除尖端的血液。除观察尖端是否堵塞外，每次注射后还应检查微量移液器尖端是否有破损。微量移液器尖端也可能发生断裂，此时应保留断端原位以防止血液流失。在显微注射过程中，必须仔细观察血管组织。当微量移液器首次接触血管时，血管组织会附着于移液器尖端。一旦尖端成功穿入血管，可观察到血管组织迅速滑入尖端内，同时在显微操作仪上也能感受到这一过程。成功注射后，必须小心地将微量移液器抽出，否则移液器可能进一步深入组织，或在注射部位造成更大的创口，从而导致化合物从血管中泄漏。通常情况下，当血管直径为90 µm或更大时，注射成功率较高；但研究者可通过减小微量移液器尖端尺寸来进一步提高成功率。为防止蚯...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国家科学基金会-美国食品药品监督管理局驻地学者奖学金（NSF-FDA SIR，#1641221）、美国食品药品监督管理局办公室首席科学家挑战基金（FDA OCS）、美国国家科学基金会综合性研究生教育与研究培训项目（NSF IGERT，#1144646）资助，并得到美国食品药品监督管理局（FDA）科学与工程实验室办公室（OSEL）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3M Vetbond 组织粘合剂3M Vetbond084-1469SB3mL 瓶装兽用粘合剂 - 液体创可贴
40x 体视显微镜Sutter Instrument Co.BV-10-D非必需，可附加于其他显微镜
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